Name: determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til MCH: NSF-BSF 1815508 og NIH R01 GM124589. MRM ble delvis støttet av opplæringsstipend NIH T32 GM122740.

1. Forsøk med in vitro kinetikk
<ol><li>Fremstilling av DNA-maler ved PCR<ol><li>Sett opp PCR-reaksjon (er): For å forberede PCR-reaksjoner, kombiner følgende reagenser i et tynnvegget PCR-rør: 33 μL dobbeltdestillert vann (ddH2O) 10 μL 5x buffer for hi-fis DNA-polymerase 5 μL på 2 mM hver deoksyribonukleosidtrifosfat (dNTP) 0,5 μL av 40 μM fremoverprimer 0,5 μL av 40 μM omvendt primer 0,5 μL (10-100 ng) DNA-mal (kun for Spinat2 PCR; Brokkoliprimere ov...

<ol>
	<li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells.">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time.">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li><li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA.">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li><li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor.">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li><li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li><li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter.">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li><li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway.">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li><li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP.">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).</li><li>Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA.">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194 (2012).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide.">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li><li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients.">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li><li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs.">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li><li>Szatm&#225;ri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies.">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002 (2020).</li><li>Boulos, L., Pr&#233;vost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIVE/DEAD&#174;+BacLightTM:+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water.">LIVE/DEAD&#174; BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore.">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li><li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers.">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li><li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging.">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging.">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li><li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach.">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356 (2021).</li></ol>

For in vitro-kinetikkeksperimentet kan den samme generelle protokollen modifiseres for å måle in vitro-kinetikken til en RNA-basert fluorescerende biosensor som inneholder både et ligandbindende og fluoroforbindende domene8. I dette tilfellet bør RNA inkuberes med fluoroforen før målinger ved injeksjon av liganden for å oppnå ligandresponskinetikk. Hvis det observeres høy variabilitet mellom replikaene, kan man feilsøke ved å kontrollere at hver prøve får lov til å ...

Fluorogene reaksjoner er kjemiske reaksjoner som genererer et fluorescenssignal. Fluorogene RNA-aptamerer utfører vanligvis denne funksjonen ved å binde et lite molekylfargestoff for å forbedre fluorescenskvanteutbyttet (figur 1A)1. Ulike fluorogene RNA-aptamersystemer er utviklet og består av spesifikke RNA-aptamersekvenser og de tilsvarende fargeligandene1. Fluorogene RNA-aptamerer er lagt til RNA-transkripsjoner som fluorescerende koder som muliggjør levende celleavbildning av mRNA og ikke-kodende RNA 2,3,4. De har også blitt plassert etter promotorsekvenser som fluorescerende reportere av genuttrykk, i likhet med bruken av grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter, bortsett fra at rapporteringsfunksjonen er på RNA-nivå 5,6. Endelig har fluorogene RNA-aptamerer blitt innlemmet i RNA-baserte fluorescerende biosensorer, som er utformet for å utløse den fluorogene reaksjonen som respons på et bestemt lite molekyl. RNA-baserte fluorescerende biosensorer er utviklet for levende celleavbildning av forskjellige ikke-fluorescerende metabolitter og signalmolekyler 7,8,9,10,11.
Det er økende interesse for utvikling av fluorogene RNA-aptamerer for å visualisere dynamiske endringer i RNA-lokalisering, genuttrykk og små molekylsignaler. For hver av disse applikasjonene er det ønskelig å oppnå sanntidsmålinger, men nøyaktigheten av målingene avhenger av at kinetikken til den fluorogene reaksjonen er raskere enn samplingsfrekvensen. Her beskriver vi metoder for å bestemme in vitro-kinetikken for fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 12 og Brokkoli13 ved hjelp av en plateleser utstyrt med en prøveinjektor og for å bestemme den cellulære turn-on-kinetikken forSpinat2 uttrykt i Escherichia coli ved hjelp av et flowcytometer. Disse to RNA-aptamerene ble valgt fordi de har blitt brukt til å studere RNA-lokalisering 2,3,4, de har blitt brukt i reportere5,6 og biosensorer 7,8,9,10,11, og de tilsvarende fargestoffene (DFHBI eller DFHBI-1T) er kommersielt tilgjengelige. Et sammendrag av deres in vitro-egenskaper bestemt i litteraturen er gitt i tabell 1 4,13,14, som informerte protokollutviklingen (f.eks. bølgelengder og fargestoffkonsentrasjoner som ble brukt). Disse resultatene viser at de fluorogene reaksjonene som påvirkes av RNA-aptamerer er raske og ikke bør hindre nøyaktige målinger for de ønskede cellebiologiske applikasjonene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP160500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis equipment</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>B1A-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha D-(+)-lactose monohydrate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18-600-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune 1x Focusing Fluid</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Shutdown Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Performance Tracking Beads</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4449754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Wash Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>&#160;J24974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorine Bleach</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07J6FJR8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well plate</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF86610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI-1T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML2697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (anhydrous)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-tip micropipettor tips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate reader with heating control</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10014-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>EC3000XL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen AM95010</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM95010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analysis software from Academic Group License&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159Z11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1643-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td>Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MFCD00011110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with temperature control</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water filter with BioPak unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow micropipettor pipette tips</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>RN005R-LRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean-up kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers and templates</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for 0.5 mL tubes</td>
			<td>Techne</td>
			<td>5PRIME/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET31b-T7-Spinach2 Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #79783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>VGC-1508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis equipment</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>ASG-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>38-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short wave UV light source</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11758221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S375-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter units</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>09-741-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer for agarose gel electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea-PAGE Gel system&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV fluorescent TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05789.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>2215415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract (Granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers

Fluorogene RNA-aptamerer har blitt brukt i levende celler for å merke og visualisere RNA, rapportere om genuttrykk og aktivere fluorescerende biosensorer som oppdager nivåer av metabolitter og signalmolekyler. For å studere dynamiske endringer i hvert av disse systemene er det ønskelig å oppnå sanntidsmålinger, men nøyaktigheten av målingene avhenger av at kinetikken til den fluorogene reaksjonen er raskere enn samplingsfrekvensen. Her beskriver vi metoder for å bestemme in vitro og cellulær turn-on kinetikk for fluorogene RNA-aptamerer ved hjelp av en plateleser utstyrt med henholdsvis en prøveinjektor og et flowcytometer. Vi viser at in vitro-kinetikken for fluorescensaktiveringen av spinat2- og brokkoli-aptamerene kan modelleres som tofaseassosiasjonsreaksjoner og har forskjellige raske fasehastighetskonstanter på henholdsvis 0,56 s−1 og 0,35 s−1. I tillegg viser vi at den cellulære kinetikken for fluorescensaktiveringen av spinat2 i Escherichia coli, som ytterligere begrenses av fargestoffdiffusjon i de gramnegative bakteriene, fortsatt er tilstrekkelig rask til å muliggjøre nøyaktig prøvetakingsfrekvens på minutttidsskalaen. Disse metodene for å analysere fluorescensaktiveringskinetikk gjelder for andre fluorogene RNA-aptamerer som er utviklet.

In vitro kinetikk Sekvensene av DNA-malene og primerne, som kjøpes som syntetiske oligonukleotider, er vist i tabell 2, og reagensoppskriftene er vist i tilleggsfil 1. PCR-amplifisering brukes til å skalere opp mengden DNA-mal med T7-promotoren, som er nødvendig for den påfølgende in vitro-transkripsjonsreaksjonen (IVT). I tillegg kan PCR-amplifisering brukes til to formål i samme reaksjon: å generere brokkoli DNA-malen i full...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Protokollen presenterer to metoder for å bestemme kinetikken til de fluorogene RNA-aptamerene Spinat2 og Broccoli. Den første metoden beskriver hvordan man måler fluorogen aptamerkinetikk in vitro med en plateleser, mens den andre metoden beskriver måling av fluorogen aptamerkinetikk i celler ved flowcytometri.

Bestemmelse av in vitro og cellulær turn-on kinetikk for fluorogene RNA aptamerer

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

Studier in vitro og cellulær fluorogen aptamerkinetikk gjør det mulig for brukeren å evaluere om aptamerfargeinteraksjoner er raske nok til å studere en prosess av interesse i sanntid. Teknikkene som presenteres tillater kvantitative kinetiske målinger både innenfor og utenfor cellen, som begge kan være relevante avhengig av anvendelsen av aptameren. Metodene som presenteres kan brukes på ethvert fluorogent RNA-system, inkludert alternative aptamerer og RNA-baserte biosensorer for små molekyler.For å begynne, sett opp RNA-renatureringsprogrammet fra termocycleren. Opprett programmet ved å velge opprett nytt program"legg til ny fase"og legg til nytt trinn"flere ganger for å legge til temperaturspesifikke trinn før du trykker på lagre"Juster tilleggsinnstillinger i henhold til programmet. For å renaturere spinat to og brokkoli RNA, lag to mikromolære stilker av hvert RNA i dobbelt destillert vann i et 0, 5 milliliter tynnvegget PCR-rør.Deretter legger du til like store mengder to-x renatureringsbuffer for å lage en mikromolar RNA-løsning. Plasser rørene i termocycleren. Åpne det lagrede renatureringsprogrammet og trykk kjør"Deretter konfigurerer du plateleserinjektorprogrammet.På fluorescensplateleseren velger du temperatur"og sett den til 37 grader Celsius. Før du starter kinetikken, må du sørge for at temperaturen er likevektet med denne verdien. Åpne plateleserprogramvaren.Velg innstillinger"deretter anskaffelsesvisning"for å legge inn programmet for kinetiske målinger, velg sløyfe"for hver brønn. Deretter angir du grunnlinjeinnstillingen til 60 grunnlinjeavlesninger og smarte injeksjonsinnstillinger for 10 mikroliterinjeksjon. Sett fluorescensavlesningene eksitasjonsbølgelengde til 448 nanometer, emisjonsbølgelengde til 506 nanometer og patron til mono.Sett total lesetid til 10 minutter med leseintervall på 0,5 sekunder. Sett PMT og optikk til seks blink per lesing. Deretter legger du inn sløyfe til neste brønn.For å klargjøre plateleserinjektoren velger du injiser "på plateleseren og leverer en avfallsinnsamlingsplate når den er anvist. Velg deretter vask"og rengjør injeksjonsrøret etter instruksjonene på plateleseren med ett milliliter volum dobbelt destillert vann, 75% etanol og deretter destillert vann. Velg deretter aspirat"slik at injektoren kan kaste ut overflødig væske.Velg deretter prime"for å prime injektoren med to 260 mikroliter 100 mikromolar D F H B I.To utføre ett kinetikkeksperiment, legg til 80 mikroliter bindende buffermasterblanding til en brønn på en 96 godt klar bunnplate. Tilsett deretter 10 mikroliter renaturert RNA. La platen og D F H B I-løsningen i injektoren balansere til 37 grader Celsius i 15 minutter.Velg deretter brønnen som skal analyseres i programvareinnstillingene under leseområdet. Velg deretter kjør under hjem-fanen"for å utføre kinetikkprogrammet beskrevet tidligere. Gjenta denne prosessen til alle eksperimentene er fullført.Etter kjøringen, vask injektoren for å fjerne den gjenværende D F H B I-oppløsningen fra injeksjonsrøret som vist tidligere. For å sette opp eksperimentelle filer, slå på flowcytometeret og datamaskinen. Opprett en ny fil i eksperimentutforsker-fanen ved å høyreklikke på flow cytometer"brukernavnet.Velg deretter nytt eksperiment"i rullegardinvinduet, og når et nytt vindu på dataskjermen dukker opp, velg eksperimenttype som rør"og velg deretter OK"I den nye eksperimentfilen høyreklikker du på gruppemappen og velger legg til nytt prøverør"Merk prøverørene for hvert bestemt tidspunkt og repliker ved å høyreklikke på prøven"og velge gi nytt navn"i rullegardinmenyen. Deretter fremstiller du en fortynnet celleløsning ved å tilsette 1,5 milliliter av en X P B S og tre mikroliter induserte celler i AI-medier i et kulturrør. Før du tilsetter fargestoff, må du måle bakgrunnsfluorescensen til cellene for å observere folden slå på over tid.Når fargestoffet er tilsatt, plasser dyrkningsrøret som inneholder celler i P B S inn i prøverørløfteren og løft løfteren til prøveinjeksjonsnålen. Velg deretter riktig prøvefil i samlingspanelfanen og klikk på posten "Når løpet er fullført, senk prøverørløfteren med kulturrøret for hånd. Å starte et skylletrinn, å skylle fluidic systemet, og minimere overføring mellom hver biologisk replikere prøve.Hvis du vil flytte til følgende eksempel, velger du neste eksempelfil ved å klikke høyrepilikonet nær navnet på prøverøret under postikonet. For å måle fluorescensen av celler med fargestoff, tilsett 1,4 mikroliter konsentrert fargestoff i en X P B S med celler, for å gi en endelig konsentrasjon på 50 mikromolar D F H B I en T.Fest kulturrørlokket og inverter tre til fem ganger for å blande løsningen jevnt. Fjern deretter lokket og legg kulturrøret i prøverørløfteren.Etter å ha løftet holderen til prøveinjeksjonsnålen, klikker du på record"-ikonet under riktig prøvefil. Start deretter en timer ved å trykke start"In vitro kinetikk av fluorogene aptamerer spinat to og brokkoli, viste tofaset assosiasjonskinetikk for binding til D F H B I fargestoff. For begge aptamerene var kinetikkdata bedre tilpasset av tofaseassosiasjon enn enfase ved lange måletider.Den beste tilpasningskurven bestemte hastighetskonstantene og halveringstidsverdiene for de raske og langsomme assosiasjonene. Spinat to i bindingskompetansetilstand, viste raskere slå på enn brokkoli. Den andre fasens kinetikk for begge aptamerer er lik og kan tilsvare et felles hastighetsbegrensende trinn.Aptamers kinetiske kurver består av en tilsvarende grad av raskt assosierende RNA. For celler som uttrykker spinat to T RNA, øker gjennomsnittlig fluorescensintensitet eller M F I umiddelbart ved null tidspunkt. Videre nådde cellulær fluorescens sin maksimale likevektede M F I-verdi innen fem minutter.I motsetning til dette viste kontrollceller lav bakgrunnsfluorescens og ingen endring i M F I-verdier med D M S O-tillegg Metodene som presenteres tillater forskere å bestemme hvordan de kan lage RNA-baserte sensorer i fluorogene aptamerer raskere.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Anstand HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; og<em&gt; I Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Dannelsen av kovalente DNA-addukter av enzymatisk aktivert kreftfremkallende og narkotika In Vitro og deres vilje av 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...