Name: determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

Bu çalışma MCH'YE aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: NSF-BSF 1815508 ve NIH R01 GM124589. MRM, eğitim hibesi NIH T32 GM122740 tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. In vitro kinetik deneyi
<ol><li>DNA şablonlarının PCR ile hazırlanması<ol><li>PCR reaksiyonlarını ayarlayın: PCR reaksiyonlarını hazırlamak için, aşağıdaki reaktifleri ince duvarlı bir PCR tüpünde birleştirin: 33 μL çift damıtılmış su (ddH2O) Yüksek doğrulukta DNA polimeraz için 10 μL 5x tampon Her biri 2 mM'lik 5 μL deoksiribonükleozid trifosfat (dNTP) 0,5 μL 40 μM ileri astar 0,5 μL 40 μM ters astar DNA şablonunun 0,5 μL (1...

<ol>
	<li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells.">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time.">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li><li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA.">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li><li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor.">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li><li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP.">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li><li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter.">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li><li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway.">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li><li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP.">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).</li><li>Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA.">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194 (2012).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide.">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li><li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients.">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li><li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs.">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li><li>Szatm&#225;ri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies.">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002 (2020).</li><li>Boulos, L., Pr&#233;vost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIVE/DEAD&#174;+BacLightTM:+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water.">LIVE/DEAD&#174; BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore.">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li><li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers.">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li><li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging.">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging.">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li><li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach.">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356 (2021).</li></ol>

In vitro kinetik deneyi için, aynı genel protokol, hem ligand bağlayıcı hem de florofor bağlayıcı alan8 içeren RNA tabanlı bir floresan biyosensörün in vitro kinetiğini ölçmek için değiştirilebilir. Bu durumda, RNA, ligand yanıt kinetiği elde etmek için ligand enjekte edildikten sonra ölçümlerden önce florofor ile inkübe edilmelidir. Replikalar arasında yüksek değişkenlik gözlenirse, her numunenin ölçümden önce 96 delikli plakada aynı süre bo...

Florojenik reaksiyonlar, floresan sinyali üreten kimyasal reaksiyonlardır. Florojenik RNA aptamerler tipik olarak floresan kuantum verimini arttırmak için küçük bir molekül boyasını bağlayarak bu işlevi yerine getirir (Şekil 1A)1. Farklı florojenik RNA aptamer sistemleri geliştirilmiştir ve spesifik RNA aptamer dizilerinden ve buna karşılık gelen boya ligandlarından oluşur1. Florojenik RNA aptamerleri, mRNA'ların ve kodlamayan RNA'ların canlı hücre görüntülemesini sağlayan floresan etiketler olarak RNA transkriptlerine eklenmiştir 2,3,4. Ayrıca, raporlama fonksiyonu RNA seviyesi5,6 olması dışında, yeşil floresan proteininin (GFP) muhabir olarak kullanılmasına benzer şekilde, gen ekspresyonunun floresan raporlayıcıları olarak promotör dizilerinden sonra yerleştirilmişlerdir. Son olarak, florojenik RNA aptamerleri, belirli bir küçük moleküle yanıt olarak florojenik reaksiyonu tetiklemek için tasarlanmış RNA bazlı floresan biyosensörlere dahil edilmiştir. RNA bazlı floresan biyosensörler, çeşitli floresan olmayan metabolitlerin ve sinyal molekülleri 7,8,9,10,11'in canlı hücre görüntülemesi için geliştirilmiştir.
RNA lokalizasyonu, gen ekspresyonu ve küçük molekül sinyallerindeki dinamik değişiklikleri görselleştirmek için florojenik RNA aptamerlerinin geliştirilmesine artan ilgi vardır. Bu uygulamaların her biri için, gerçek zamanlı ölçümlerin elde edilmesi arzu edilir, ancak ölçümlerin doğruluğu, florojenik reaksiyonun kinetiğinin örnekleme frekansından daha hızlı olmasına bağlıdır. Burada, florojenik RNA aptamers Ispanak2 12 ve Brokoli13 için in vitro kinetiği bir örnek enjektör ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak belirlemek ve bir akış sitometresi kullanarak Escherichia coli'de eksprese edilen Ispanak2 için hücresel açılma kinetiğini belirlemek için yöntemler açıklanmaktadır. Bu iki RNA aptamer seçildi çünkü RNA lokalizasyonu 2,3,4'ü incelemek için uygulandılar, muhabirler 5,6 ve biyosensörler 7,8,9,10,11'de kullanıldılar ve karşılık gelen boya ligandları (DFHBI veya DFHBI-1T) ticari olarak temin edilebilir. Literatürde belirlenen in vitro özelliklerinin bir özeti, protokol gelişimini (örneğin, kullanılan dalga boyları ve boya konsantrasyonları) bildiren Tablo 1 4,13,14'te verilmiştir. Bu sonuçlar, RNA aptamerlerinden etkilenen florojenik reaksiyonların hızlı olduğunu ve istenen hücre biyolojik uygulamaları için doğru ölçümleri engellememesi gerektiğini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP160500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis equipment</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>B1A-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha D-(+)-lactose monohydrate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18-600-440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune 1x Focusing Fluid</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Shutdown Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A24975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Performance Tracking Beads</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4449754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Wash Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>&#160;J24974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorine Bleach</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07J6FJR8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well plate</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF86610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI-1T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML2697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (anhydrous)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-tip micropipettor tips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate reader with heating control</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10014-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>EC3000XL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen AM95010</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM95010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analysis software from Academic Group License&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159Z11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1643-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td>Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MFCD00011110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with temperature control</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water filter with BioPak unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow micropipettor pipette tips</td>
			<td>DOT Scientific</td>
			<td>RN005R-LRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean-up kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers and templates</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler for 0.5 mL tubes</td>
			<td>Techne</td>
			<td>5PRIME/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET31b-T7-Spinach2 Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #79783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>VGC-1508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel electrophoresis equipment</td>
			<td>C.B.S. Scientific</td>
			<td>ASG-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>38-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0450L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short wave UV light source</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11758221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S375-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter units</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>09-741-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer for agarose gel electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea-PAGE Gel system&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV fluorescent TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05789.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>2215415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract (Granulated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of in vitro and cellular turn-on kinetics for fluorogenic rna aptamers

Florojenik RNA aptamerleri, RNA'ları etiketlemek ve görselleştirmek, gen ekspresyonu hakkında rapor vermek ve metabolitlerin ve sinyal moleküllerinin seviyelerini tespit eden floresan biyosensörleri aktive etmek için canlı hücrelere uygulanmıştır. Bu sistemlerin her birindeki dinamik değişiklikleri incelemek için, gerçek zamanlı ölçümlerin elde edilmesi arzu edilir, ancak ölçümlerin doğruluğu, florojenik reaksiyonun kinetiğinin örnekleme frekansından daha hızlı olmasına bağlıdır. Burada, sırasıyla bir numune enjektörü ve bir akış sitometresi ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak florojenik RNA aptamers için in vitro ve hücresel açma kinetiğini belirleme yöntemlerini açıklıyoruz. Ispanak2 ve Brokoli aptamerlerinin floresan aktivasyonu için in vitro kinetiğin iki fazlı ilişki reaksiyonları olarak modellenebileceğini ve sırasıyla 0.56 s-1 ve 0.35 s-1'lik farklı hızlı faz hızı sabitlerine sahip olduğunu gösteriyoruz. Ek olarak, Escherichia coli'deki Ispanak2'nin floresan aktivasyonu için hücresel kinetiğin, Gram-negatif bakterilere boya difüzyonu ile daha da sınırlı olduğunu, dakika zaman ölçeğinde doğru örnekleme sıklığını sağlamak için hala yeterince hızlı olduğunu gösteriyoruz. Floresan aktivasyon kinetiğini analiz etmek için kullanılan bu yöntemler, geliştirilen diğer florojenik RNA aptamerlerine uygulanabilir.

In vitro kinetik Sentetik oligonükleotidler olarak satın alınan DNA şablonlarının ve primerlerinin dizileri Tablo 2'de, reaktif tarifleri ise Ek Dosya 1'de gösterilmiştir. PCR amplifikasyonu, sonraki in vitro transkripsiyon (IVT) reaksiyonu için gerekli olan T7 promotörü ile DNA şablonunun miktarını artırmak için kullanılır. Ek olarak, PCR amplifikasyonu aynı reaksiyonda iki amaç için kullanılabilir: primer uzan...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers at JoVE.com

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Protokol, florojenik RNA aptamers Ispanak2 ve Brokolinin kinetiğini belirlemek için iki yöntem sunar. İlk yöntem, florojenik aptamer kinetiğinin in vitro olarak bir plaka okuyucu ile nasıl ölçüleceğini açıklarken, ikinci yöntem hücrelerdeki florojenik aptamer kinetiğinin akış sitometrisi ile ölçülmesini detaylandırır.

Florojenik RNA Aptamers için In Vitro ve Hücresel Turn-on Kinetiğinin Belirlenmesi

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

Vitro ve hücresel florojenik aptamer kinetiğinde çalışmak, kullanıcının aptamer boya etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak ilgilenilen bir süreci incelemek için yeterince hızlı olup olmadığını değerlendirmesini sağlar. Sunulan teknikler, hücrenin hem içinde hem de dışında nicel kinetik ölçümlere izin verir; bunlardan herhangi biri, aptamerin uygulanmasına bağlı olarak ilgili olabilir. Sunulan yöntemler, alternatif aptamerler ve küçük moleküller için RNA tabanlı biyosensörler de dahil olmak üzere herhangi bir florojenik RNA sistemine uygulanabilir.Başlamak için, termosiklustan RNA renatürasyon programını ayarlayın. Yeni program oluştur"yeni aşama ekle" ve yeni adım ekle" yi seçerek programı oluşturun, kaydetmeden önce sıcaklığa özgü adımlar eklemek için birden çok kez"Programa göre ek ayarları yapın. Ispanak iki ve brokoli RNA'larını yeniden denatüre etmek için, her RNA'nın iki mikromolar sapını 0.5 mililitrelik ince duvarlı bir PCR tüpünde çift damıtılmış suda hazırlayın.Daha sonra bir mikromolar RNA çözeltisi yapmak için eşit hacimlerde iki x renatürasyon tamponu ekleyin. Tüpleri termosiklusun içine yerleştirin. Kaydedilen renatürasyon programını açın ve çalıştır tuşuna basın"Ardından, plaka okuyucu enjektör programını ayarlayın.Floresan plaka okuyucusunda sıcaklığı seçin "ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Kinetik çalışmaya başlamadan önce, sıcaklığın bu değere eşit olduğundan emin olun. Plaka okuyucu yazılımını açın.Kinetik ölçümler için programı girmek üzere ayarları "ardından edinme görünümünü" seçin, her kuyucuk için "döngü" yü seçin. Ardından, 10 mikrolitrelik enjeksiyon için taban çizgisi ayarını 60 taban çizgisi okuması ve akıllı enjeksiyon ayarları olarak ayarlayın. Floresan uyarım dalga boyunu 448 nanometreye, emisyon dalga boyunu 506 nanometreye ve kartuşu monoya ayarlayın.Toplam okuma süresini 0,5 saniyelik okuma aralığıyla 10 dakika olarak ayarlayın. PMT ve optikleri okuma başına altı flaşa ayarlayın. Ardından bir sonraki kuyuya döngü girin.Plaka okuyucu enjektörünü hazırlamak için "plaka okuyucusuna enjekte et" i seçin ve yönlendirildiğinde bir atık toplama plakası sağlayın. Ardından yıkamayı seçin ve plaka okuyucudaki talimatları izleyerek enjeksiyon tüpünü bir mililitre hacimde çift damıtılmış su,% 75 etanol ve ardından damıtılmış su ile temizleyin. Daha sonra aspiratı seçin", enjektörün fazla sıvıyı çıkarmasına izin verin.Ardından, enjektörün iki adet 260 mikrolitre 100 mikromolar D F H B ile astarlanması I.To bir kinetik deneyi gerçekleştirmesi için prime" i seçin, 96 iyi temizlenmiş bir alt plakanın bir kuyucuğuna 80 mikrolitre bağlayıcı tampon ana karışımı ekleyin. Sonra 10 mikrolitre renatüre RNA ekleyin. Enjektördeki plaka ve D F H B I çözeltisinin 15 dakika boyunca 37 santigrat dereceye dengelenmesine izin verin.Ardından, okuma alanının altındaki yazılım ayarlarında analiz edilecek kuyuyu seçin. Ardından, ana sayfa sekmesinin altında, daha önce açıklanan kinetik programını yürütmek için "çalıştır" ı seçin. Tüm denemeler tamamlanana kadar bu işlemi tekrarlayın.Çalıştırmadan sonra, kalan D F H B I çözeltisini daha önce gösterildiği gibi enjeksiyon tüpünden çıkarmak için enjektörü yıkayın. Deneysel dosyaları ayarlamak için akış sitometresini ve bilgisayarı açın. Akış sitometresi"kullanıcı adını sağ tıklayarak deneme gezgini sekmesinde yeni bir dosya oluşturun.Ardından, açılır pencerede "yeni deneme"yi seçin ve bilgisayar ekranında yeni bir pencere açıldığında, tüp olarak deneme türünü seçin" ve ardından Tamam'ı seçin"Yeni deney dosyasında grup klasörüne sağ tıklayın ve yeni örnek tüpü ekle'yi seçin"Her belirli zaman noktası için örnek tüpleri etiketle ve örneğe sağ tıklayarak çoğalt" ı seçin ve açılır menüden "yeniden adlandır" ı seçin. Daha sonra, bir kültür tüpünde AI ortamına 1,5 mililitre bir X P B S ve üç mikrolitre indüklenmiş hücre ekleyerek seyreltilmiş bir hücre çözeltisi hazırlayın. Boya eklemeden önce, kıvrımın zamanla açıldığını gözlemlemek için hücrelerin arka plan floresansını ölçün.Boya eklendikten sonra, P B S'deki hücreleri içeren kültür tüpünü numune tüp kaldırıcıya yerleştirin ve kaldırıcıyı numune enjeksiyon iğnesine kaldırın. Ardından, toplama paneli sekmesinden uygun numune dosyasını seçin ve kaydet'e tıklayın"Çalıştırma tamamlandıktan sonra, numune tüpü kaldırıcıyı kültür tüpü ile elle indirin. Bir durulama adımı başlatmak, akışkan sistemi yıkamak ve her biyolojik replikasyon numunesi arasındaki taşımayı en aza indirmek için.Aşağıdaki örneğe gitmek için, kayıt simgesinin altındaki örnek tüp adının yanındaki sağ ok simgesini tıklatarak bir sonraki örnek dosyayı seçin. Boya ile hücrelerin floresansını ölçmek için, hücrelerle birlikte bir X P B S içine 1.4 mikrolitre konsantre boya stoğu ekleyin, 50 mikromolar D F H B I bir T.Kültür tüpü kapağını sabitleyin ve çözeltiyi eşit şekilde karıştırmak için üç ila beş kez ters çevirin. Ardından, kapağı çıkarın ve kültür tüpünü numune tüp kaldırıcıya yerleştirin.Tutucuyu numune enjeksiyon iğnesine kaldırdıktan sonra, uygun numune dosyasının altındaki "kayıt" simgesine tıklayın. Daha sonra, başlat tuşuna basarak bir zamanlayıcıya başlayın"Florojenik aptamers ıspanak iki ve brokolinin in vitro kinetiği, D F H B I boyasına bağlanmak için iki fazlı ilişki kinetiği gösterdi. Her iki aptamer için de kinetik veriler, uzun ölçüm zamanlarında bir fazdan ziyade iki fazlı ilişki ile daha iyi bir şekilde yerleştirildi.En uygun eğri, hızlı ve yavaş ilişkilendirmeler için hız sabitlerini ve yarı ömür değerlerini belirledi. Ispanak iki bağlanma yetkinlik durumunda, brokoliden daha hızlı açılma gösterdi. Her iki aptamer için ikinci faz kinetiği benzerdir ve ortak bir hız sınırlama adımına karşılık gelebilir.Aptamers kinetik eğrileri, benzer derecede hızlı ilişkili RNA'lardan oluşur. Ispanak iki T RNA eksprese eden hücreler için, ortalama floresan yoğunluğu veya M F I sıfır zaman noktasında hemen artar. Ayrıca, hücresel floresan beş dakika içinde maksimum dengelenmiş M F I değerine ulaştı.Buna karşılık, kontrol hücreleri düşük arka plan floresansı gösterdi ve D M S O ilavesiyle M F I değerlerinde değişiklik olmadı Sunulan yöntemler, araştırmacıların florojenik aptamerlerde RNA tabanlı sensörleri nasıl daha hızlı yapabileceklerini belirlemelerini sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...