Name: designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues
Uploaded: 2023-06-02T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Dr. Timothy Cashman per il precedente lavoro su questo metodo. Questo studio è stato sostenuto dai finanziamenti del National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 e K01 HL133424) e del programma di reti internazionali di eccellenza della Fondazione Leducq (CURE-PLaN).

Questo protocollo utilizzava una linea iPSC de-identificata, SkiPS 31.3 (originariamente riprogrammata utilizzando fibroblasti dermici di un maschio sano di 45 anni)47, ed era, quindi, esente dall'approvazione specifica dell'Institutional Review Board, in conformità con le linee guida del comitato etico per la ricerca umana dell'istituzione. Eseguire tutta la manipolazione delle cellule e dell'hECT in condizioni asettiche in una cabina di sicurezza biologica di classe II filtrata HEPA o in un ban...

Esistono numerosi modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato lineare pubblicati in letteratura, alcuni dei quali sono descritti nella Tabella 1. Alcuni modelli prevedono la misurazione diretta della forza tissutale, ma in genere richiedono il trasferimento del costrutto in un bagno muscolare separato38. La maggior parte dei modelli sono progettati con i tessuti ancorati in modo permanente ad entrambe le estremità, più comunemente ai perni PDMS ...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected.

Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

I modelli ingegnerizzati di tessuto cardiaco sono disponibili in una vasta gamma di geometrie e configurazioni per ricapitolare vari aspetti della nicchia cardiaca nativa che sono difficili da ottenere con la tradizionale coltura cellulare bidimensionale. Una delle configurazioni più comuni è la striscia di tessuto lineare, con ancoraggi flessibili a ciascuna estremità per indurre l'autoassemblaggio del tessuto e fornire al tessuto un precarico definito e una lettura delle forze di contrazione risultanti 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23,24,25,26,27. La forza generata può essere determinata in modo robusto attraverso l'inseguimento ottico dell'accorciamento del tessuto e utilizzando la teoria del fascio elastico per calcolare la forza dalle deflessioni misurate e la costante elastica degli ancoraggi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,25,26,28.
Tuttavia, l'ingegneria dei tessuti cardiaci è ancora un campo in evoluzione e permangono alcune sfide. Per ogni modello di sistema 10,29,30,31 sono necessarie attrezzature specializzate, come bioreattori su misura e dispositivi di valutazione funzionale. Le dimensioni e la complessità del microambiente di questi costrutti sono spesso limitate da un basso rendimento dovuto a protocolli ad alta intensità di lavoro, dall'elevato numero di cellule e dalla fragilità dei tessuti. Per affrontare questo problema, alcuni gruppi si sono rivolti alla fabbricazione di microtessuti contenenti solo centinaia o migliaia di cellule per facilitare saggi ad alto rendimento utili per la scoperta di farmaci. Tuttavia, questa scala ridotta complica la valutazione accurata della funzione12, elimina aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa (come i gradienti di diffusione di nutrienti/ossigeno e l'architettura complessa36) e limita la quantità di materiale disponibile per le successive analisi molecolari e strutturali (spesso richiedendo il pooling dei tessuti). La Tabella 1 riassume alcune delle configurazioni dei modelli di strisce di tessuto lineare in letteratura 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Gruppo</td>
			<td>Cellule per tessuto</td>
			<td>Fazzoletti per piastra</td>
			<td colspan="2">Formato piastra</td>
			<td colspan="2">Funzione di ancoraggio</td>
			<td colspan="2">Metodo di acquisizione dei dati funzionali</td>
			<td>Bagno multimediale condiviso?</td>
			<td>Misura funzionale- mento in situ?</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Yoshida (ECT)38</td>
			<td>4 milioni</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Piastra a 6 pozzetti modificata*</td>
			<td colspan="2">trasduttore di forza</td>
			<td colspan="2">Misurazione diretta della forza</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Chan (hESC-CM-ECTs)26</td>
			<td>310 mila</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Piatto personalizzato a 6 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Posti PDMS</td>
			<td colspan="2">Misurazione diretta della forza</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Feinberg (dyn-EHT)16</td>
			<td>1,5 milioni</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Piatto personalizzato a 6 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Filo PDMS</td>
			<td colspan="2">forma del tessuto</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RADISIC (BioWire)39, 40</td>
			<td>110 mila</td>
			<td>8</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">filo polimerico</td>
			<td colspan="2">Forma del filo</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (hECT singolo)1, 2</td>
			<td>1-2 milioni</td>
			<td>4**</td>
			<td colspan="2">Piastra Petri da 10 cm**</td>
			<td colspan="2">Posti PDMS</td>
			<td colspan="2">Deflessione ottica (tracciamento di bordi/oggetti)</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT)3–9</td>
			<td>500 k-1 milione</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Piastra di Petri da 6 cm</td>
			<td colspan="2">Posti PDMS</td>
			<td colspan="2">Deflessione ottica (tracciamento di bordi/oggetti)</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT con SPoT)</td>
			<td>1 milione</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Piastra di Petri da 6 cm</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con cappucci neri</td>
			<td colspan="2">Deflessione ottica (tracciamento dell'oggetto)</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Passier (EHT)17</td>
			<td>245 mila</td>
			<td>36</td>
			<td colspan="2">Piastra a 12 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con cappucci neri</td>
			<td colspan="2">Deflessione ottica (tracciamento dell'oggetto)</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic13, 18</td>
			<td>1 milione</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">Piastra di Petri da 6 cm</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con tappi</td>
			<td colspan="2">deflessione ottica (rilevamento dei bordi)</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic (MilliPilastro)14</td>
			<td>550 mila</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Piatto personalizzato a 6 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con tappi</td>
			<td colspan="2">deflessione ottica (tracciamento di oggetti); Imaging del calcio</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Eschenhagen (EHT)10, 19–21</td>
			<td>1 milione</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">Piastra a 12 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con tappi</td>
			<td colspan="2">deflessione ottica (rilevamento del bordo della post-deflessione); Imaging del calcio</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zandstra (CaMiRi)22</td>
			<td>25-150 mila</td>
			<td>96</td>
			<td colspan="2">Piastra a 96 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con ganci</td>
			<td colspan="2">deflessione ottica (rilevamento dei bordi)</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Murry23, 24</td>
			<td>900 mila</td>
			<td>24</td>
			<td colspan="2">Piastra a 24 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con tappi, magnete integrato</td>
			<td colspan="2">sensore magnetico</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Reich (μTUG)11, 12, 25</td>
			<td>indefinito</td>
			<td>156</td>
			<td colspan="2">Piatto da 156 pozzetti</td>
			<td colspan="2">Pali PDMS con tappi, magnete integrato</td>
			<td colspan="2">Tracciamento ottico (perlina fluorescente)</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Caratteristiche di alcuni modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato lineare in letteratura. I modelli lineari di tessuto cardiaco ingegnerizzato variano in termini di dimensioni, produttività, design delle caratteristiche di ancoraggio e facilitazione di bagni di terreno condivisi, nonché i requisiti per un sistema di bagno muscolare separato per la caratterizzazione funzionale. * I ricercatori hanno utilizzato un sistema tissutale ingegnerizzato disponibile in commercio basato sulle dimensioni di una piastra standard a 6 pozzetti. ** Un sistema modulare in cui i bioreattori monotissutale sono ancorati a qualsiasi piastra di coltura in plastica nel numero e nella posizione desiderati.
Questo documento descrive l'ultimo protocollo per la fabbricazione del nostro modello consolidato di tessuto cardiaco lineare ingegnerizzato umano (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 e metodi per la valutazione della funzione contrattile dell'eCT. Ogni bioreattore multi-tessuto ospita fino a sei hECT in un bagno di terreno condiviso ed è composto da due pezzi "rack" realizzati con l'elastomero siliconico polidimetilsilossano (PDMS) montato su un telaio rigido in polisulfone. Ogni rack PDMS contiene sei montanti flessibili integrati con rilevamento della forza di 0,5 mm di diametro e 3,25 mm di lunghezza e, insieme, due rack forniscono sei coppie di montanti, ognuno dei quali contiene un hECT. L'inversione del bioreattore aiuta a superare qualsiasi ostacolo alla visualizzazione degli hECT dal basso dovuto alla condensazione dell'acqua dal terreno di coltura o alle distorsioni del menisco dell'interfaccia aria-liquido. Ogni contrazione di un hECT provoca la deflessione dei pali terminali integrati e la misurazione ottica del segnale di deflessione viene elaborata in un tracciato della forza rispetto al tempo che rappresenta la funzione contrattile dell'hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Rispetto ai bioreattori monotissutali tipicamente utilizzati per tessuti di queste dimensioni, il design multi-tessuto migliora la produttività sperimentale e consente lo studio della segnalazione paracrina tra tessuti adiacenti di composizione cellulare potenzialmente diversa. Questo sistema è stato validato in studi pubblicati che descrivono applicazioni nella modellazione della malattia 4,8, nella segnalazione paracrina 6,7, nella coltura eterocellulare 5,9 e nello screening terapeutico 7,9.
In questo sistema, gli hECT sono progettati per essere lunghi circa 6 mm e con un diametro di 0,5 mm per facilitare un robusto tracciamento ottico delle misurazioni della forza con basso rumore. Inoltre, aspetti della complessità tissutale, come i gradienti di diffusione e l'organizzazione cellulare, sono bilanciati con un fabbisogno gestibile di 1 milione di cellule per tessuto. Con la tecnologia standard delle telecamere CCD, forze deboli come 1 μN (che rappresentano meno di 5 μm di post-deflessione) generano un segnale chiaro, assicurando che anche la funzione contrattile estremamente debole, come osservato con alcuni modelli di malattia hECT, possa essere misurata con precisione. Ciò facilita anche l'analisi dettagliata della curva della forza di contrazione, consentendo così l'analisi ad alto contenuto di un massimo di 16 metriche di contrattilità41, tra cui la forza sviluppata, i tassi di contrazione (+dF/dt) e di rilassamento (−dF/dt) e la variabilità della frequenza di battimento.
Questo protocollo inizia con le istruzioni per la fabbricazione dei componenti del bioreattore. Particolare attenzione è rivolta alle fasi per massimizzare la resa di hECT, ridurre la variabilità tecnica nella funzione tissutale e ottimizzare la qualità e la profondità della valutazione tissutale. La maggior parte degli studi di ingegneria tissutale cardiaca non riporta i tassi di perdita di tessuto durante la fabbricazione e i test a lungo termine, sebbene sia una sfida ben nota nel campo e riduca la produttività e l'efficienza degli studi27. I metodi di ingegneria tissutale qui descritti sono stati perfezionati nel corso degli anni per garantire la ritenzione di tutti gli hECT nella maggior parte dei bioreattori (indipendentemente da come sono fabbricati i rack PDMS). Tuttavia, anche una perdita del 5%-20% dei tessuti può influenzare significativamente la potenza statistica, in particolare negli esperimenti più piccoli limitati dal numero di cardiomiociti disponibili (ad esempio, a causa di problemi di differenziazione con alcune linee cellulari malate4 o a causa dell'alto costo dei cardiomiociti acquistati in commercio), o dalle condizioni di trattamento (ad esempio, disponibilità limitata o costo elevato di vari composti di trattamento).
Questo protocollo descrive la fabbricazione di inseguitori di pali stabili (SPoT), una nuova caratteristica dei rack PDMS, che funzionano come tappi alle estremità dei pali di rilevamento della forza che contengono gli hECT27. È stato dimostrato come la geometria del cappuccio riduca significativamente la perdita di hECT dovuta alla caduta o al distacco dei montanti, aprendo così nuove opportunità per la coltivazione di hECT con una maggiore varietà di rigidità e tensioni, che sono difficili da coltivare su pali non tappati. Inoltre, gli SPoT forniscono un oggetto ad alto contrasto per migliorare l'inseguimento ottico della contrazione hECT attraverso una forma coerente e ben definita27. Segue una descrizione della coltura di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e del differenziamento dei cardiomiociti sulla base dei protocolli 3,42,43 pubblicati in precedenza e una spiegazione della fabbricazione, della coltura e delle misurazioni funzionali dell'hECT.
Questo articolo affronta anche la necessità di misurare la funzione dei tessuti alla temperatura fisiologica. Il miocardio umano (tessuto sano e malato fetale e adulto), così come il tessuto cardiaco di un'ampia gamma di specie animali (tra cui ratti, gatti, topi, furetti e conigli)44,45, mostra un marcato aumento della forza di contrazione abbinata alla frequenza a temperature di 28 °C-32 °C rispetto alla temperatura fisiologica, un fenomeno noto come inotropia ipotermica45, 46. Tuttavia, gli effetti della temperatura sulla funzione del tessuto miocardico ingegnerizzato rimangono poco studiati. Molti recenti modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato in letteratura sono progettati per essere valutati funzionalmente a 37 °C per approssimare le condizioni fisiologiche 13,14,37. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, gli effetti dipendenti dalla temperatura sulla forza generata dai tessuti cardiaci ingegnerizzati non sono stati studiati in modo sistematico. Questo protocollo descrive un design dell'elettrodo di stimolazione che riduce al minimo la perdita di calore durante il test, oltre a consentire l'incorporazione di un elemento riscaldante isolato nella configurazione per le misurazioni funzionali, in grado di mantenere gli hECT a temperatura fisiologica senza compromettere la sterilità27. Riportiamo quindi alcuni degli effetti osservati della temperatura sulla funzione dell'hECT, tra cui la forza sviluppata, la frequenza di battimento spontaneo, +dF/dt e −dF/dt. Nel complesso, questo documento fornisce i dettagli necessari per produrre questo sistema di bioreattore multi-tessuto con rilevamento della forza per fabbricare tessuti cardiaci ingegnerizzati dall'uomo e per valutare la loro funzione contrattile, e viene presentata una serie di dati che forniscono una base di confronto per le misurazioni a temperatura ambiente e a 37 °C27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >6517K61&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 cm dishes (20 mm tall)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 N NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS225-1</td>
			<td>dilute 1:10 in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 - 200 &#956;L Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 &#956;L MicroPipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 cm Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>&#160;LED-6W&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90 degree angle mirror</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>45-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic bonding glue</td>
			<td>SCIGRIP</td>
			<td>#4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adjustable 10 cm x 10 cm jack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum 6061</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>9008K82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A-Plan 10X Objective Lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>1020-863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave Bags</td>
			<td>Propper</td>
			<td>21002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement (without insulin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black ABS</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>2.85 mm wide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Collagen I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3430009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Acrylic Sheeting</td>
			<td>estreetplastics</td>
			<td>1002502436</td>
			<td>6.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CNC Vertical Mill</td>
			<td>Haas</td>
			<td>VF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive Graphite Bars</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1763T33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Dilute to 70% in water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Automated Cell counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>E1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Cell Counting Slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine Curved Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>3110</td>
			<td>AKA &#34;incubator&#34;. With HEPA class 100 filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion360 software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>AKA &#34;CAD software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>1475</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC qualified matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>AKA &#34;basement membrane matrix&#34;. Store in frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed CCD Camera</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>P7410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Werk</td>
			<td>Axiovert 40 CFL</td>
			<td>10X phase contrast objective</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IWR-1</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabView Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow clean bench</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-201-330</td>
			<td>necessary for hECT functional analysis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laptop</td>
			<td>AsusTek</td>
			<td>Strix</td>
			<td>Intel Core i&#38; processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser Cutting Machine</td>
			<td>Epilog</td>
			<td>Helix 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnification headset</td>
			<td>ExcelBlades</td>
			<td>70020</td>
			<td>Recommended for steps requiring fine manipulations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Version 2019b or later</td>
			<td>AKA &#34;data analysis software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Vannas Scissors, 3 mm blade</td>
			<td>WPI Instruments</td>
			<td>501839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Boom Stand</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ2-STU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin stock solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 IU/ml penicillin; 10,000 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline without divalent cations</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PixelLINK Capture OEM</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>10.2.1.6</td>
			<td>AKA &#34;Camera Software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polysulfone</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>86735K73</td>
			<td>translucent amber color</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polytetrafluoroethylene (PTFE)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8545K176&#160;</td>
			<td>Black, molded</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>AKA &#34;iPSC dissociation media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone Sheeting</td>
			<td >SMI manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>glossy, 0.02 in thickness, durometer 40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads</td>
			<td>Michael&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>color should withstand autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td>used for mixing PDMS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Pulse Stimulator&#160;</td>
			<td>Astro-Med / Grass Technologies</td>
			<td>S88X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Razoblades</td>
			<td>GEM</td>
			<td>62-0179-CTN</td>
			<td>preferred over non-stainless steel due to lower hardness</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stemflex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>AKA &#34;iPSC culture media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile distilled water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 170 -&#160; Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DOWSIL 170 2LB KIT</td>
			<td>AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT</td>
			<td>AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature-controlled heated stage</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H401-HG-SMU</td>
			<td>Set height to 10 cm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermoplastic 3D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>Ultimaker 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S1459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art Parts</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Mini Band Saw</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Miniature Drill Press</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration Isolation Table</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3618000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Weighing Boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Talon Cylinder Bench Clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97035-528</td>
			<td>AKA screw clamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues

L'insufficienza cardiaca rimane la principale causa di morte in tutto il mondo, creando un urgente bisogno di migliori modelli preclinici del cuore umano. L'ingegneria tissutale è fondamentale per la ricerca cardiologica di base; La coltura cellulare umana in vitro elimina le differenze interspecie dei modelli animali, mentre un ambiente 3D più simile a quello dei tessuti (ad esempio, con matrice extracellulare e accoppiamento eterocellulare) simula le condizioni in vivo in misura maggiore rispetto alla tradizionale coltura bidimensionale su piastre di Petri di plastica. Tuttavia, ogni sistema modello richiede attrezzature specializzate, ad esempio bioreattori progettati su misura e dispositivi di valutazione funzionale. Inoltre, questi protocolli sono spesso complicati, laboriosi e afflitti dal fallimento dei piccoli e delicati tessuti.
Questo articolo descrive un processo per la generazione di un robusto sistema modello di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano (hECT) utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per la misurazione longitudinale della funzione tissutale. Sei hECT con geometria a striscia lineare vengono coltivati in parallelo, con ogni hECT sospeso da una coppia di perni in polidimetilsilossano (PDMS) con rilevamento della forza collegati ai rack PDMS. Ogni post è dotato di un PDMS stable post tracker (SPoT) nero, una nuova funzionalità che migliora la facilità d'uso, la produttività, la ritenzione dei tessuti e la qualità dei dati. La forma consente un tracciamento ottico affidabile delle deflessioni dei perni, ottenendo un migliore tracciamento della forza di contrazione con tensione attiva e passiva assoluta. La geometria del cappuccio elimina il cedimento del tessuto dovuto agli hECT che scivolano dai perni e, poiché comportano una seconda fase dopo la fabbricazione del rack PDMS, gli SPoT possono essere aggiunti ai progetti basati su post-post PDMS esistenti senza modifiche sostanziali al processo di fabbricazione del bioreattore.
Il sistema viene utilizzato per dimostrare l'importanza di misurare la funzione dell'hECT a temperature fisiologiche e mostra una funzione tissutale stabile durante l'acquisizione dei dati. In sintesi, descriviamo un sistema modello all'avanguardia che riproduce le condizioni fisiologiche chiave per far progredire la biofedeltà, l'efficienza e il rigore dei tessuti cardiaci ingegnerizzati per applicazioni in vitro .

Seguendo il protocollo di cui sopra, i cardiomiociti sono stati generati da una linea di iPSC sana utilizzata in precedenza dal nostro gruppo 9,15 e fabbricati in hECT dopo 8-61 giorni in coltura. La Figura 9A mostra immagini rappresentative degli hECT visti dal basso, che sono stati creati senza (in alto) e con (in basso) SPoT. Le misurazioni funzionali sono state effettuate a temperatura ambiente (23 °C) e a temperatura fisiologic...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

I tessuti cardiaci tridimensionali bioingegnerizzati utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali sono emersi come modelli promettenti per lo studio in vitro del miocardio umano sano e malato, ricapitolando gli aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa. Questo manoscritto descrive un protocollo per la fabbricazione e l'analisi di tessuti cardiaci ingegnerizzati ad alto contenuto generati da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Progettazione di un bioreattore per migliorare l'acquisizione dei dati e modellare la produttività dei tessuti cardiaci ingegnerizzati

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

Il nostro modello in vitro del muscolo cardiaco umano derivato da cellule staminali tridimensionali migliora la biofedeltà della tradizionale coltura cellulare bidimensionale, eliminando al contempo le differenze interspecie associate ai test sugli animali da laboratorio. Il nostro design del bioreattore multi-tessuto con tracciatori di post stabili massimizza il successo dei tessuti e migliora l'accuratezza della caratterizzazione approfondita della funzione del tessuto cardiaco ingegnerizzato. Poiché l'insufficienza cardiaca continua a essere la principale causa di morte in tutto il mondo, i nostri tessuti cardiaci ingegnerizzati consentono ai ricercatori di modellare le malattie cardiache umane e di esaminare potenziali terapie.Per iniziare, posizionare quattro fusioni master in alluminio nel supporto per gesso in modo che i fori dei pali siano allineati con lo spazio morto opposto ai ripiani triangolari. Posizionare l'apparecchio tra due staffe parallele e fissare i lati insieme utilizzando un pezzo rettangolare di foglio di silicone spesso 0.5 millimetri come guarnizione per evitare perdite del PDMS liquido. In un contenitore poco profondo, mescolare 0,5 millilitri di agente indurente PDMS con cinque millilitri di base elastomerica PDMS in un rapporto di uno a 10 e mescolare energicamente per cinque minuti.Degassare la miscela PDMS in una camera a vuoto sotto forte vuoto fino a quando le bolle non scompaiono. Successivamente, versare la miscela PDMS sull'apparato di colata, riempiendo eccessivamente per garantire la copertura completa di ogni fessura. Aggiungere piccole perle di vetro colorato al corpo dei rack PDMS di fronte al lato con i montanti per l'identificazione univoca di ciascun rack.Posizionare l'apparecchio di colata livellato orizzontalmente nella camera a vuoto sotto un forte vuoto per almeno 12 ore. Lasciare polimerizzare il PDMS a temperatura ambiente lontano dalla polvere per 48 ore per consentire la completa polimerizzazione e la massima resistenza dei perni delicati. Rimuovere il clamp, le staffe e il foglio di silicone dall'apparecchio di colata.Utilizzando una lama di rasoio in acciaio inossidabile, tagliare la pellicola PDMS sulla parte superiore dell'apparato di fusione e dei supporti del telaio. Utilizzare le dita per separare i rack PDMS dai lati del supporto per gesso. Inserire una lama di rasoio in acciaio inossidabile smussata nello spazio morto tra il gesso e il supporto del gesso e separarli, assicurandosi che il PDMS che riempie lo spazio morto rimanga con il supporto del gesso.Quindi, utilizzando una lama affilata in acciaio inossidabile, tagliare le pellicole PDMS rimanenti e lo spazio morto PDMS dalle punte dei perni. Usando le dita, separare lentamente il rack PDMS dal gesso sul lato opposto ai montanti. Continuate ad alternare i lati fino a quando i pali non sono liberi dai lanci master.Liberare tutti i rack PDMS e i montanti come dimostrato in precedenza e utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare via il PDMS in eccesso rimanente dai rack. Utilizzando una stampante 3D per modellazione a deposizione fusa termoplastica, stampare i componenti dell'apparato di colata stabile post tracker, o SPoT. Garantire un fissaggio sicuro tra i pezzi stampati in 3D e tra i rack PDMS e la maschera a tre punte.Verificare inoltre che i rack PDMS si adattino perfettamente ai montanti che raggiungono appena il fondo dei pozzetti senza essere piegati. Mescolare 0,5 millilitri di PDMS nero parte A a 0,5 millilitri di parte B in una piccola pesa o in un contenitore poco profondo fino a quando la soluzione non è di colore uniforme. Degassare il PDMS nero miscelato in una camera a vuoto sotto forte vuoto per 20 minuti.Versare il PDMS nero degassato sulla base stampata in 3D per riempire i fori e picchiettare per assicurarsi che non rimangano bolle. Raschiare il più possibile il PDMS in eccesso dalla base. Agganciare il pezzo a tre punte alla base e posizionare i rack PDMS nelle scanalature della maschera a tre punte, assicurandosi che le estremità dei montanti si immergano nel PDMS nero nei pozzetti circolari.Lasciare indurire il PDMS nero a temperatura ambiente lontano dalla polvere per 48 ore. Far scorrere il pezzo a tre punte, riducendo al minimo la tensione sui montanti. Usando piccole pinze, raschiare via la sottile pellicola nera PDMS che circonda ogni SPoT, quindi inserire una pinza piegata a punta fine nel pozzetto SPoT per liberarla dalla base stampata in 3D.Ispezionare gli SPoT e tagliare la pellicola PDMS nera rimanente dal processo di fusione utilizzando forbici vannas fini. Assicurarsi che i montanti finiti siano della lunghezza corretta montando i rack PDMS sul telaio del telefono cellulare polys, quindi facendolo scorrere sulla piastra di base nera. Dopo aver sterilizzato in autoclave il bioreattore e aver preparato la miscela cellulare, procedere alla fabbricazione degli hECT.Indossando guanti sterili, rimuovere la piastra di base nera dal sacchetto autoclavato contenente le parti del bioreattore e posizionarla in un piatto da 60 millilitri con i pozzetti rivolti verso l'alto. Pipettare lentamente 44 microlitri della miscela cellulare in ciascun pozzetto per evitare l'introduzione di bolle. Indossando un nuovo paio di guanti sterili, rimuovere il telaio in polisulfone con i rack PDMS dalla sacca dell'autoclave.Abbassare il telaio sulla piastra di base in modo che le estremità del telaio si adattino alle scanalature all'estremità della piastra di base. Assicurandosi che i montanti siano tutti dritti e che il telaio non sia inclinato, posizionare il bioreattore in un piatto da 60 millimetri. Aggiungere un millilitro di FBS al 10% nel terreno di mantenimento dei cardiomiociti al piatto da 60 millilitri per aumentare l'umidità man mano che gli hECT si solidificano.Posizionare il piatto senza coperchio in un piatto di alto profilo da 100 millimetri e coprirlo con un coperchio da 100 millimetri, quindi riportare il bioreattore in un incubatore a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per consentire al collagene di formare un gel con le cellule in sospensione. Dopo due ore, rimuovere la capsula dall'incubatrice. Aggiungere 13 millilitri di FBS al 10% nel terreno di mantenimento dei cardiomiociti, inclinando la piastra per consentire al terreno di fluire tra la piastra di base in PTFE e i rack PDMS.Ispezionare il bioreattore lateralmente per verificare l'assenza di bolle d'aria e rimettere il piatto nell'incubatrice. Se l'aria è intrappolata, inclinare il bioreattore fuori dal mezzo per far sì che la bolla si rompa e abbassarla di nuovo lentamente, oppure utilizzare una micropipetta con una punta di caricamento del gel per aspirare l'aria senza disturbare i perni. Ispezionare la compattazione hECT attraverso la finestra nel telaio.Nell'arco di 24-96 ore, gli hECT si compattano e diventano opachi. Rimuovere la piastra di base quando gli hECT sono compattati di almeno il 30% rispetto al diametro originale. Riempire la capsula da 60 millimetri contenente il bioreattore con terreno di mantenimento dei cardiomiociti fino a quando il liquido non si stacca con il bordo della capsula e aggiungere 14 millilitri a una nuova capsula da 60 millimetri.Indossando guanti sterili, capovolgere il bioreattore nella sua capsula in modo che la piastra di base sia in alto. Dopo aver ispezionato la presenza di bolle d'aria intrappolate, sollevare lentamente la piastra di base, mantenendola in piano. Assicurati che i suggerimenti per i post siano a fuoco.Attivare l'interruttore di soglia e regolare il cursore fino a quando gli SPoT non sono ben delimitati e non cambiano forma quando l'hECT si contrae. Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare un rettangolo attorno a uno degli SPoT e fare clic sul pulsante Imposta uno all'interno della casella dei contorni del montante per impostare la posizione del rettangolo attorno allo SPoT, assicurandosi che l'SPoT rimanga sempre all'interno del contorno del rettangolo. Ripeti il processo nell'altro post e registralo sotto il secondo set.Regolare le impostazioni delle dimensioni dell'oggetto per impedire al programma di tracciare oggetti più piccoli e assicurarsi che il numero di oggetti tracciati in ogni rettangolo rimanga costante. L'interfaccia mostra la distanza misurata tra gli oggetti tracciati in tempo reale. Utilizzare questo grafico per monitorare il rumore.Sotto l'intestazione hertz della frequenza di stimolazione, indicare l'intervallo di frequenze desiderate e l'intervallo desiderato per il passaggio da min a max. Nelle caselle a destra, scegliere il tempo di impostazione desiderato per consentire all'hECT di adattarsi alla nuova frequenza di stimolazione, quindi specificare il tempo di registrazione e la tensione di stimolazione. Avviare il programma facendo clic sul pulsante di avvio del programma.Dopo aver registrato i dati di una frequenza, aumentare la frequenza dello stimolatore dell'intervallo desiderato per una nuova registrazione fino a raggiungere la frequenza massima. Le immagini rappresentative degli hECT sono mostrate qui viste dal basso, create senza SPoT e con SPoT. Gli SPoT hanno fornito un'unica forma definita da tracciare durante l'acquisizione dei dati.In alcuni casi estremi, l'oggetto di tracciamento è stato persino oscurato. Una forma più affidabile per il tracciamento ottico e la riduzione del rumore ha permesso la misurazione di tessuti deboli con una forza sviluppata di appena un micro Newton. Gli SPoT hanno fornito una geometria del cappuccio che ha impedito la perdita di hECT.La funzione hECT misurata è risultata stabile per un tempo di coltura prolungato nell'attuale configurazione di stimolazione con il tavolino riscaldato. Rispetto alle misurazioni a temperatura fisiologica, gli hECT hanno mostrato dinamiche di contrazione alterate a temperatura ambiente, con tassi di contrazione e rilassamento più lenti. A frequenze più elevate, gli hECT tendevano ad essere più deboli a temperatura ambiente.A frequenze più basse, gli hECT tendevano ad essere più forti a temperatura ambiente. Quando sono stati stimolati a 36 gradi Celsius, gli hECT avevano una frequenza di battimento spontaneo più elevata e una gamma più ampia di frequenze di cattura. L'ambiente a temperatura controllata garantisce la rilevanza fisiologica della funzione degli hECT misurati.Inoltre, il bagno di terreno condiviso del bioreattore multi-tessuto facilita gli studi sulla segnalazione paracrina tra hECT di diverse composizioni cellulari. L'aggiunta di SPoT al nostro bioreattore multitissutale consente ai ricercatori di studiare in modo efficiente il miocardio malato con tensione anormalmente alta o bassa, che altrimenti scivolerebbe via dalle estremità dei perni non tappati.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

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Bioingegneria

Operation of a Benchtop Bioreactor

Il funzionamento di un bioreattore da banco

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

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Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

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Atimico Rat modello per la valutazione di Engineered legamento crociato anteriore Innesti

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Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

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Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

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Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

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Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...