Name: designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues
Uploaded: 2023-06-02T12:50:00
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著者らは、この方法に関する以前の研究について、Timothy Cashman博士に感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)(R01-HL132226およびK01 HL133424)およびLeducq Foundation International Networks of Excellence Program(CURE-PLaN)からの資金提供を受けて行われました。

このプロトコルは、匿名化されたiPS細胞株であるSkiPS 31.3(元々は健康な45歳男性の真皮線維芽細胞を用いて再プログラムされた)47を使用し、したがって、同機関のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従って、特定の治験審査委員会の承認を免除された。すべての細胞およびhECT操作は、HEPAフィルター付きクラスII生物学的安全キャビネットまたは層流作業台で無菌状態で行?...

文献には多数の線形改変心臓組織モデルが公開されており、その一部を表1に記載する。いくつかのモデルは、組織力の直接測定を含むが、これらは典型的には、構築物を別個の筋浴38に移すことを必要とする。ほとんどのモデルはPDMSのポスト1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16に両端で永久に固定されるティッシュと、最も一般的である設計...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

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Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

人工心臓組織モデルは、従来の2次元細胞培養では実現が困難であった在来の心臓ニッチのさまざまな側面を再現するために、さまざまな形状と構成で提供されます。最も一般的な構成の1つは、組織の自己組織化を誘導し、定義されたプリロードと結果として生じるけいれん力の読み出しを組織に与えるために、両端に柔軟なアンカーを備えた線形組織ストリップです1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 、22、23、24、25、26、27。発生する力は、組織の短縮の光学追跡と、アンカー1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11の測定されたたわみとばね定数から力を計算する弾性ビーム理論を使用して、ロバストに決定することができます。12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、25、26、28。
しかし、心臓組織工学はまだ発展途上の分野であり、いくつかの課題が残っています。カスタムメイドのバイオリアクターや機能評価装置などの専用機器は、各モデルシステム10,29,30,31に必要です。これらのコンストラクトの微小環境のサイズと複雑さは、多くの場合、労働集約的なプロトコル、多数の細胞、および組織の脆弱性による低スループットによって制限されます。これに対処するために、一部のグループは、創薬に役立つハイスループットアッセイを容易にするために、数百または数千の細胞のみを含む微小組織の作製に目を向けています。しかし、この縮小されたスケールは、機能12の正確な評価を複雑にし、本来の心臓ニッチの重要な側面(栄養素/酸素拡散勾配や複雑な構造36など)を排除し、その後の分子および構造分析に利用できる材料の量を制限します(多くの場合、組織のプールが必要です)。表1は、文献1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15における線状組織ストリップモデルの構成のいくつかを要約したものである。16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、37、38、39、40。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">群</td>
			<td>組織あたりの細胞数</td>
			<td>プレートあたりの組織数</td>
			<td colspan="2">プレートフォーマット</td>
			<td colspan="2">アンカー機能</td>
			<td colspan="2">機能データ取得方式</td>
			<td>共有メディアバス?</td>
			<td>機能測定- その場で?</td>
		</tr><tr><td colspan="2">吉田 (ECT)38</td>
			<td>400万人</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">修正型6ウェルプレート*</td>
			<td colspan="2">力変換器</td>
			<td colspan="2">直接力測定</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
		</tr><tr><td colspan="2">チャン(hESC-CM-ECT)26</td>
			<td>310キロメートル</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">カスタム6ウェルディッシュ</td>
			<td colspan="2">PDMSの投稿</td>
			<td colspan="2">直接力測定</td>
			<td>はい</td>
			<td>いいえ</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ファインバーグ (dyn-EHT)16</td>
			<td>150万人</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">カスタム6ウェルディッシュ</td>
			<td colspan="2">PDMSワイヤー</td>
			<td colspan="2">組織形状</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RADISIC (BioWire)39, 40</td>
			<td>110キロメートル競走</td>
			<td>8</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">ポリマーワイヤー</td>
			<td colspan="2">ワイヤー形状</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">肋骨(単一のhECT)1、2</td>
			<td>1-200万</td>
			<td>4**</td>
			<td colspan="2">10cmシャーレ**</td>
			<td colspan="2">PDMSの投稿</td>
			<td colspan="2">光学偏向(エッジ/オブジェクトトラッキング)</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">肋骨(multi-hECT)3–9</td>
			<td>500 k-100万</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6cmシャーレ</td>
			<td colspan="2">PDMSの投稿</td>
			<td colspan="2">光学偏向(エッジ/オブジェクトトラッキング)</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">コスタ(マルチhECT W/ SPoT)</td>
			<td>100万人</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6cmシャーレ</td>
			<td colspan="2">黒いキャップのPDMSポスト</td>
			<td colspan="2">光学偏向(オブジェクトトラッキング)</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">パッシエ(EHT)17</td>
			<td>245キロメートル</td>
			<td>36</td>
			<td colspan="2">12ウェルプレート</td>
			<td colspan="2">黒いキャップのPDMSポスト</td>
			<td colspan="2">光学偏向(オブジェクトトラッキング)</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ヴンジャク-ノヴァコビッチ13, 18</td>
			<td>100万人</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">6cmシャーレ</td>
			<td colspan="2">キャップ付きPDMSポスト</td>
			<td colspan="2">光学偏向(エッジ検出)</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic (ミリピラー)14</td>
			<td>550キロメートル</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">カスタム6ウェルディッシュ</td>
			<td colspan="2">キャップ付きPDMSポスト</td>
			<td colspan="2">光学偏向(物体追跡);カルシウムイメージング</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">エッシェンハーゲン (EHT)10, 19–21</td>
			<td>100万人</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">12ウェルプレート</td>
			<td colspan="2">キャップ付きPDMSポスト</td>
			<td colspan="2">光学的偏向(ポストたわみのエッジ検出);カルシウムイメージング</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ザンドストラ(CaMiRi)22</td>
			<td>25〜150キロメートル</td>
			<td>96</td>
			<td colspan="2">96ウェルプレート</td>
			<td colspan="2">フック付きのPDMSポスト</td>
			<td colspan="2">光学偏向(エッジ検出)</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">マリー23、24</td>
			<td>900キロ</td>
			<td>24</td>
			<td colspan="2">24ウェルプレート</td>
			<td colspan="2">キャップ付きPDMSポスト、一体型マグネット</td>
			<td colspan="2">磁気センサー</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ドイツ (μTUG)11, 12, 25</td>
			<td>未定義</td>
			<td>156</td>
			<td colspan="2">156ウェルディッシュ</td>
			<td colspan="2">キャップ付きPDMSポスト、一体型マグネット</td>
			<td colspan="2">光学トラッキング(蛍光ビーズ)</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr></tbody></table>表1:文献中のいくつかの線形工学心臓組織モデルの特徴。 線形工学的心臓組織モデルは、サイズ、スループット、アンカー機能の設計、共有培地浴の容易化、および機能特性評価のための個別の筋浴システムの要件が異なります。*研究者は、標準的な6ウェルプレートの寸法に基づいて、市販の人工組織システムを使用しました。** 単一組織バイオリアクターを任意のプラスチック培養皿に所望の数と位置で固定するモジュラーシステム。
この論文では、線形ヒト工学心臓組織(hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27の確立されたモデルを作製するための最新のプロトコルについて説明しますhECT収縮機能を評価する方法。各マルチティッシュバイオリアクターは、共有培地に最大6台のhECTを収容し、硬質ポリスルホンフレームに取り付けられたシリコーンエラストマーポリジメチルシロキサン(PDMS)製の2つの「ラック」ピースで構成されています。各PDMSラックには、直径0.5 mm、長さ3.25 mmの柔軟な統合型フォースセンシングポストが6つ含まれており、2つのラックには6組のポストがあり、それぞれが1つのhECTを保持します。バイオリアクターの反転は、培地からの結露や空気と液体界面のメニスカスによる歪みによる下からのhECTの可視化の障害を克服するのに役立ちます。hECTが収縮するたびに、統合されたエンドポストのたわみが発生し、たわみ信号の光学的測定は、hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27の収縮機能を表す力対時間追跡に処理されます.このサイズの組織に通常使用される単一組織バイオリアクターと比較して、マルチティッシュデザインは実験スループットを向上させ、潜在的に異なる細胞組成の隣接する組織間のパラクリンシグナル伝達の研究を可能にします。このシステムは、疾患モデリング4,8、パラクリンシグナル伝達6,7、ヘテロ細胞培養5,9、および治療スクリーニング7,9への応用を説明する発表された研究で検証されています。
このシステムでは、hECTは長さ約6mm、直径0.5mmに設計されており、低ノイズで力測定の堅牢な光学的追跡を容易にします。さらに、拡散勾配や細胞組織などの組織の複雑さの側面は、組織あたり100万個の細胞という管理可能な要件とバランスが取れています。標準的なCCDカメラ技術では、1μNという弱い力(たわみ後5μm未満を表す)で明確な信号を生成するため、一部のhECT疾患モデルで観察されるような非常に弱い収縮機能でも正確に測定できます。これにより、痙攣力曲線の詳細な分析も容易になり、したがって、発達力、収縮率(+dF/dt)および弛緩率(−dF/dt)、および拍動率変動を含む、最大16の収縮性指標41のハイコンテント分析が可能になる。
このプロトコルは、バイオリアクターコンポーネントを製造するための指示から始まります。hECT収量を最大化し、組織機能の技術的変動性を低減し、組織評価の質と深さを最適化するためのステップに特別な注意が払われています。ほとんどの心臓組織工学研究は、製造および長期検査中の組織損失率を報告していませんが、これはこの分野ではよく知られた課題であり、研究のスループットと効率を低下させます27。ここで説明する組織工学的手法は、(PDMSラックの製造方法に関係なく)ほとんどのバイオリアクターですべてのhECTを確実に保持するために、長年にわたって改良されてきました。しかしながら、組織の5%〜20%の損失でさえ、特に利用可能な心筋細胞の数によって制限される小規模な実験において(例えば、いくつかの疾患細胞株4 の分化の課題のため、または市販の心筋細胞の高コストのために)、または治療条件(例えば、様々な治療化合物の限られた入手可能性または高コスト)によって、統計的検出力に大きく影響し得る。
このプロトコルは、hECTを保持する力感知ポストの端部でキャップとして機能するPDMSラックの新機能である安定したポストトラッカー(SPoT)の製造について説明します27。キャップ形状により、ポストの落下や引き抜きによるhECTの損失が大幅に減少し、キャップのないポストでの培養が困難な、より多様な剛性と張力を持つhECTを培養するための新しい機会が開かれることが実証されています。さらに、SPoTは、一貫性のある明確に定義された形状27を通じて、hECT収縮の光学的追跡を改善するための高コントラストの物体を提供する。これに続いて、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の培養と、以前に発表されたプロトコル3,42,43に基づく心筋細胞の分化、およびhECTの作製、培養、および機能測定の説明が続きます。
この記事では、生理学的温度で組織機能を測定する必要性についても説明します。ヒト心筋(胎児および成人の健康および罹患組織)、および広範囲の動物種(ラット、ネコ、マウス、フェレット、ウサギを含む)の心臓組織44,45は、生理学的温度と比較して28°C-32°Cの温度で周波数整合痙攣力の著しい増加を示します-低体温異方性45として知られる現象、46。しかし、人工心筋組織機能に対する温度の影響は、まだ十分に研究されていません。文献にある最近の人工心臓組織モデルの多くは、生理学的条件を近似するために37°Cで機能的に評価されるように設計されています13,14,37。しかし、私たちの知る限り、人工心臓組織によって生成される力に対する温度依存的な影響は体系的に調査されていません。このプロトコルは、試験中の熱損失を最小限に抑え、無菌性を損なうことなくhECTを生理学的温度に維持できる機能測定用のセットアップに絶縁発熱体を組み込むことを可能にするペーシング電極設計について説明しています27。次に、発達力、自発拍数、+dF/dt、-dF/dtなど、hECT機能に観測された温度の影響のいくつかを報告します。全体として、この論文は、ヒトで操作された心臓組織を作製し、それらの収縮機能を評価するために、この多組織力感知バイオリアクターシステムを製造するために必要な詳細を提供し、室温および37°Cでの測定の比較の基礎を提供する一連のデータを提示します27。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >6517K61&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 cm dishes (20 mm tall)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 N NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS225-1</td>
			<td>dilute 1:10 in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 - 200 &#956;L Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 &#956;L MicroPipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 cm Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>&#160;LED-6W&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90 degree angle mirror</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>45-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic bonding glue</td>
			<td>SCIGRIP</td>
			<td>#4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adjustable 10 cm x 10 cm jack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum 6061</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>9008K82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A-Plan 10X Objective Lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>1020-863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave Bags</td>
			<td>Propper</td>
			<td>21002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement (without insulin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black ABS</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>2.85 mm wide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Collagen I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3430009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Acrylic Sheeting</td>
			<td>estreetplastics</td>
			<td>1002502436</td>
			<td>6.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CNC Vertical Mill</td>
			<td>Haas</td>
			<td>VF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive Graphite Bars</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1763T33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Dilute to 70% in water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Automated Cell counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>E1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Cell Counting Slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine Curved Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>3110</td>
			<td>AKA &#34;incubator&#34;. With HEPA class 100 filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion360 software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>AKA &#34;CAD software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>1475</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC qualified matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>AKA &#34;basement membrane matrix&#34;. Store in frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed CCD Camera</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>P7410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Werk</td>
			<td>Axiovert 40 CFL</td>
			<td>10X phase contrast objective</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IWR-1</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabView Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow clean bench</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-201-330</td>
			<td>necessary for hECT functional analysis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laptop</td>
			<td>AsusTek</td>
			<td>Strix</td>
			<td>Intel Core i&#38; processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser Cutting Machine</td>
			<td>Epilog</td>
			<td>Helix 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnification headset</td>
			<td>ExcelBlades</td>
			<td>70020</td>
			<td>Recommended for steps requiring fine manipulations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Version 2019b or later</td>
			<td>AKA &#34;data analysis software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Vannas Scissors, 3 mm blade</td>
			<td>WPI Instruments</td>
			<td>501839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Boom Stand</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ2-STU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin stock solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 IU/ml penicillin; 10,000 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline without divalent cations</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PixelLINK Capture OEM</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>10.2.1.6</td>
			<td>AKA &#34;Camera Software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polysulfone</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>86735K73</td>
			<td>translucent amber color</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polytetrafluoroethylene (PTFE)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8545K176&#160;</td>
			<td>Black, molded</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>AKA &#34;iPSC dissociation media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone Sheeting</td>
			<td >SMI manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>glossy, 0.02 in thickness, durometer 40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads</td>
			<td>Michael&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>color should withstand autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td>used for mixing PDMS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Pulse Stimulator&#160;</td>
			<td>Astro-Med / Grass Technologies</td>
			<td>S88X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Razoblades</td>
			<td>GEM</td>
			<td>62-0179-CTN</td>
			<td>preferred over non-stainless steel due to lower hardness</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stemflex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>AKA &#34;iPSC culture media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile distilled water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 170 -&#160; Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DOWSIL 170 2LB KIT</td>
			<td>AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT</td>
			<td>AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature-controlled heated stage</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H401-HG-SMU</td>
			<td>Set height to 10 cm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermoplastic 3D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>Ultimaker 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S1459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art Parts</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Mini Band Saw</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Miniature Drill Press</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration Isolation Table</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3618000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Weighing Boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Talon Cylinder Bench Clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97035-528</td>
			<td>AKA screw clamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues

心不全は依然として世界の主要な死因であり、ヒトの心臓のより優れた前臨床モデルが急務となっています。組織工学は、基礎科学の心臓研究に不可欠です。 in vitro でのヒト細胞培養では、動物モデルの種間の違いが排除されますが、より組織に似た3D環境(細胞外マトリックスやヘテロ細胞カップリングなど)では、プラスチック製のペトリ皿での従来の2次元培養よりもin vivo 条件をシミュレートできます。ただし、各モデルシステムには、カスタム設計のバイオリアクターや機能評価デバイスなど、特殊な機器が必要です。さらに、これらのプロトコルはしばしば複雑で労働集約的であり、小さくて繊細な組織の障害に悩まされています。
この論文では、組織機能の縦断的測定のために人工多能性幹細胞由来心筋細胞を使用して、堅牢なヒト人工心臓組織(hECT)モデルシステムを生成するプロセスについて説明します。直線的なストリップ形状の6つのhECTを並行して培養し、各hECTはPDMSラックに取り付けられた一対の力感知ポリジメチルシロキサン(PDMS)ポストから吊り下げられます。各ポストは、使いやすさ、スループット、組織保持、データ品質を向上させる新機能である黒色のPDMS安定ポストトラッカー(SPoT)で覆われています。この形状により、ポストのたわみを確実に光学的に追跡でき、絶対的な能動的および受動的張力による痙攣力の追跡が改善されます。キャップ形状により、hECTがポストから滑り落ちることによる組織障害が排除され、PDMSラック製造後の第2ステップが含まれるため、バイオリアクター製造プロセスに大きな変更を加えることなく、SPoTを既存のPDMSポストベースの設計に追加できます。
このシステムは、生理学的温度でhECT機能を測定することの重要性を実証するために使用され、データ取得中に安定した組織機能を示します。要約すると、主要な生理学的条件を再現して、 in vitro アプリケーション用に設計された心臓組織の生体忠実度、効率、および厳密性を向上させる最先端のモデルシステムについて説明します。

上記のプロトコルに従って、心筋細胞は、以前に私たちのグループによって使用された健康なiPS細胞株から生成されました9,15、培養で8〜61日後にhECTに作製されました。図9Aは、SPoTなし(上)とSPoTあり(下)で作成されたhECTを下から見た代表的な画像を示しています。機能測定は、hECT製造後37日から52日の間に室温(23°C)および生理...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro で研究するための有望なモデルとして浮上し、天然の心臓ニッチの重要な側面を再現しています。この原稿では、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞から生成されたハイコンテント人工心臓組織を作製および分析するためのプロトコルについて説明します。

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

当社の3次元幹細胞由来ヒト心筋のinvitroモデルは、従来の2次元細胞培養の生体忠実度を向上させると同時に、実験動物実験に関連する種間の違いを排除します。安定したポストトラッカーを備えた当社のマルチティッシュバイオリアクター設計は、組織の成功を最大化し、操作された心臓組織機能の詳細な特性評価の精度を向上させます。心不全が世界の死因の第1位であり続ける中、当社の人工心臓組織により、研究者はヒトの心臓疾患をモデル化し、潜在的な治療法をスクリーニングすることができます。まず、4つのアルミニウムネガティブマスターキャストをキャストホルダーに配置して、支柱の穴が三角形の棚の反対側のデッドスペースに揃うようにします。装置を2つの平行ブラケットの間に置き、厚さ0.5mmのシリコーンシートの長方形の部分をガスケットとして使用して側面をクランプし、液体PDMSの漏れを防ぎます。浅い容器に、0.5ミリリットルのPDMS硬化剤と5ミリリットルのPDMSエラストマーベースを1対10の比率で混合し、5分間激しく攪拌します。PDMS混合物を真空チャンバー内で、気泡が消えるまで強力真空下で脱気します。次に、PDMS混合物を鋳造装置に注ぎ、各スロットを完全に覆うように過剰に充填します。PDMSラックの本体の支柱と反対側に小さな色ガラスビーズを追加して、各ラックを一意に識別できるようにします。水平に水平にした鋳造装置を、少なくとも12時間、強力な真空下で真空チャンバー内に置きます。PDMSを埃から離れた室温で48時間硬化させ、デリケートなポストを完全に硬化させ、強度を最大限に高めます。クランプ、ブラケット、シリコンシートを鋳造装置から取り外します。ステンレス鋼のかみそりの刃を使用して、鋳造装置とフレームサポートの上部にあるPDMSフィルムを切り取ります。指を使って、PDMS ラックをキャスト・ホルダーの側面から切り離します。鈍いステンレス鋼のかみそりの刃をキャストとキャストホルダーの間のデッドスペースに挿入し、それらをこじ開けて、デッドスペースを埋めるPDMSがキャストホルダーに残るようにします。次に、鋭利なステンレス鋼の刃を使用して、残りのPDMSフィルムとデッドスペースPDMSをポストの先端から切り取ります。指を使って、支柱の反対側のキャストから PDMS ラックをゆっくりと離します。支柱からマスターキャストがなくなるまで、左右を交互に進めます。前述したように、すべての PDMS ラックと支柱を解放し、鋭利なカミソリの刃を使用して、ラックから余分な PDMS を切り取ります。熱可塑性溶融堆積モデリング3Dプリンターを使用して、安定ポストトラッカー(SPoT)鋳造装置のコンポーネントをプリントします。3Dプリントされた部品の間、およびPDMSラックと三又治具の間にしっかりと圧入されるようにします。また、PDMSラックが、ウェルの底に届くだけの支柱に、曲がらずにぴったりと収まっていることを確認します。0.5ミリリットルの黒色PDMSパートAと0.5ミリリットルのパートBを小型計量ボートまたは浅い容器で、溶液の色が均一になるまで混合します。混合した黒色PDMSを真空チャンバー内で強真空下で20分間脱気する。脱気した黒いPDMSを3Dプリントされたベースに流し込み、穴を埋め、泡が残らないようにします。ベースから余分なPDMSをできるだけ多くこすり落とします。三股の部品をベースにカチッとはめ込み、PDMS ラックを三股のジグの溝に置き、支柱の端が円形ウェルの黒い PDMS に浸るようにします。黒色のPDMSを室温で48時間硬化させ、ほこりから離します。三又をスライドさせて、支柱の張力を最小限に抑えます。小さな鉗子を使用して、各SPoTを囲む薄い黒いPDMSフィルムをこすり落とし、先端が細かく曲がった鉗子をSPoTウェルに挿入して、3Dプリントされたベースから解放します。SPoTを検査し、鋳造プロセスから残った黒いPDMSフィルムを細いバンナハサミでトリミングします。PDMS ラックを polys 携帯電話フレームに取り付け、これを黒のベース プレートにスライドさせて、完成した支柱が正しい長さであることを確認します。バイオリアクターをオートクレーブし、細胞混合物を調製した後、hECTの作製に進みます。滅菌手袋を着用し、バイオリアクターの部品が入ったオートクレーブバッグから黒いベースプレートを取り出し、ウェルを上に向けて60ミリリットルの皿に入れます。44マイクロリットルの細胞混合物を各ウェルにゆっくりとピペットで移し、気泡が入らないようにします。新しい滅菌手袋を着用し、ポリスルホンフレームとPDMSラックをオートクレーブバッグから取り外します。フレームの端がベースプレートの端の溝に収まるように、フレームをベースプレートに下ろします。支柱がすべてまっすぐで、フレームが傾いていないことを確認して、バイオリアクターを60ミリメートルの皿に入れます。心筋細胞維持培地に1ミリリットルの10%FBSを60ミリリットルのディッシュに加え、hECTが固化するにつれて湿度を上げます。蓋のない皿を目立つ100mmの皿に入れ、100mmの皿の蓋で覆い、バイオリアクターを摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに戻して、コラーゲンが懸濁液中の細胞とゲルを形成できるようにします。2時間後、インキュベーターから皿を取り出します。心筋細胞維持培地に13ミリリットルの10%FBSを加え、皿を傾けて培地がPTFEベースプレートとPDMSラックの間を流れるようにします。バイオリアクターを側面から点検し、気泡がないことを確認し、ディッシュをインキュベーターに戻します。空気が閉じ込められている場合は、バイオリアクターを培地から傾けて気泡を破砕し、ゆっくりと再び下げるか、ゲルローディングチップ付きのマイクロピペットを使用して、支柱を乱さずに空気を吸い上げます。フレーム内の窓からhECT圧縮を検査します。24時間から96時間かけて、hECTは圧縮され、不透明になります。hECTが元の直径と比較して少なくとも30%圧縮されたら、ベースプレートを取り外します。バイオリアクターを含む60ミリメートルのディッシュに心筋細胞維持培地を充填し、液体がディッシュの縁で洗い流されるまで充填し、新しい60ミリメートルのディッシュに14ミリリットルを加えます。滅菌手袋を着用した状態で、ベースプレートが上になるように、バイオリアクターを皿の中で裏返します。気泡が閉じ込められていないか検査した後、ベースプレートを水平に保ちながらゆっくりと持ち上げます。投稿のヒントにフォーカスが合っていることを確認します。しきい値スイッチをオンにし、SPoTが適切に区切られ、hECTが収縮しても形状が変化しなくなるまでスライダーを調整します。長方形ツールを使用して SPoT の 1 つの周囲に長方形を描画し、投稿の境界ボックス内の [1 つ設定] ボタンをクリックして SPoT の周囲に長方形の位置を設定し、SPoT が常に長方形の境界内に収まるようにします。このプロセスを他の投稿に繰り返し、セット2に記録します。オブジェクトのサイズ設定を調整して、プログラムが小さなオブジェクトを追跡しないようにし、各四角形で追跡されるオブジェクトの数が一定になるようにします。インターフェースには、追跡対象物間の測定距離がリアルタイムで表示されます。このグラフを使用して、ノイズを監視します。ペーシング周波数ヘルツヘッダーの下に、必要な周波数の範囲と、最小から最大へのステップの間隔を示します。右側のボックスで、hECTが新しいペーシング周波数に調整できるように希望の設定時間を選択し、録音時間とペーシング電圧を指定します。プログラムの開始ボタンをクリックしてプログラムを開始します。1つの周波数からのデータを記録した後、最大周波数に達するまで、新しい記録に必要な間隔だけ刺激装置の周波数を増やします。ここでは、SPoTなしとSPoTありで作成したhECTの代表的な画像を下から見たものです。SPoTは、データ取得中に追跡するための単一の定義された形状を提供しました。極端な例では、追跡オブジェクトが不明瞭になることさえありました。光学トラッキングとノイズリダクションのためのより信頼性の高い形状により、1マイクロニュートンという低い発生力で弱い組織の測定が可能になりました。SPoTは、hECTの損失を防ぐキャップ形状を提供しました。測定されたhECT機能は、加熱ステージを使用した現在のペーシングセットアップで、長時間の培養時間にわたって安定していました。生理学的温度での測定と比較して、hECTは室温で収縮ダイナミクスの変化を示し、収縮と弛緩の速度が遅くなりました。より高い周波数では、hECTは室温で弱くなる傾向がありました。より低い周波数では、hECTは室温で強くなる傾向がありました。摂氏36度でペーシングすると、hECTは自発的なビートレートが高く、捕捉周波数の範囲が広がりました。温度管理された環境により、測定されたhECT機能の生理学的関連性が保証されます。さらに、マルチティッシュバイオリアクターの共有培地槽は、異なる細胞組成のhECT間のパラクリンシグナル伝達の研究を容易にします。当社のマルチ組織バイオリアクターにSPoTを追加することで、研究者は、キャップのない支柱の端から滑り落ちるような、異常に高いまたは低い張力を持つ病気の心筋を効率的に研究することができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

生物工学

Operation of a Benchtop Bioreactor

ベンチトップリアクターの操作

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

シードとマウス モデルにおける合成組織設計気管移植片の移植

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...