Name: designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues
Uploaded: 2023-06-02T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues at JoVE.com

Os autores agradecem ao Dr. Timothy Cashman por trabalhos anteriores sobre este método. Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 e K01 HL133424) e pelo Leducq Foundation International Networks of Excellence Program (CURE-PLaN).

Esse protocolo utilizou uma linha iPSC não identificada, SkiPS 31.3 (originalmente reprogramada com fibroblastos dérmicos de um homem saudável de 45 anos)47, sendo, portanto, isento de aprovação específica do Comitê de Ética em Pesquisa da instituição, em concordância com as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos da instituição. Realizar toda a manipulação celular e hECT em condições assépticas em um gabinete de segurança biológica classe II filtrado por ...

Existem inúmeros modelos lineares de tecido cardíaco modificados publicados na literatura, alguns dos quais estão descritos na Tabela 1. Alguns modelos envolvem a medida direta da força tecidual, mas estes tipicamente requerem a transferência do construto para um banho muscular separado38. A maioria dos modelos é desenhada com os tecidos ancorados permanentemente em ambas as extremidades, mais comumente aos pinos do PDMS1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16<sup class="xref"...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected.

Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Os modelos de tecido cardíaco projetados vêm em uma gama diversificada de geometrias e configurações para recapitular vários aspectos do nicho cardíaco nativo que são difíceis de alcançar com a cultura de células bidimensional tradicional. Uma das configurações mais comuns é a tira de tecido linear, com âncoras flexíveis em cada extremidade para induzir a automontagem do tecido e fornecer ao tecido uma pré-carga definida e uma leitura das forças de contração resultantes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23,24,25,26,27. A força gerada pode ser determinada de forma robusta através do rastreamento óptico do encurtamento tecidual e utilizando a teoria do feixe elástico para calcular a força a partir das deflexões medidas e a constante de mola das âncoras 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,25,26,28.
No entanto, a engenharia de tecidos cardíacos ainda é um campo em evolução, e alguns desafios permanecem. Equipamentos especializados, como biorreatores sob medida e dispositivos de avaliação funcional, são necessários para cada sistema modelo 10,29,30,31. O tamanho e a complexidade do microambiente dessas construções são frequentemente limitados pelo baixo rendimento devido a protocolos trabalhosos, alto número de células e fragilidade tecidual. Para resolver isso, alguns grupos se voltaram para a fabricação de microtecidos contendo apenas centenas ou milhares de células para facilitar ensaios de alto rendimento que são úteis para a descoberta de drogas. No entanto, essa escala reduzida dificulta a avaliação precisa da função12, elimina aspectos importantes do nicho cardíaco nativo (como gradientes de difusão de nutrientes/oxigênio e arquitetura complexa36) e limita a quantidade de material disponível para análises moleculares e estruturais subsequentes (muitas vezes exigindo o agrupamento dos tecidos). A Tabela 1 resume algumas das configurações dos modelos lineares de tiras de tecido na literatura 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Grupo</td>
			<td>Células por tecido</td>
			<td>Tecidos por placa</td>
			<td colspan="2">Formato da chapa</td>
			<td colspan="2">Recurso de ancoragem</td>
			<td colspan="2">Método de aquisição de dados funcionais</td>
			<td>Banho de mídia compartilhado?</td>
			<td>Medida funcional- E in loco?</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Yoshida (ECT)38</td>
			<td>4 milhões</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">placa de 6 poços modificada*</td>
			<td colspan="2">transdutor de força</td>
			<td colspan="2">medição direta de força</td>
			<td>Não</td>
			<td>Não</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Chan (hESC-CM-ECTs)26</td>
			<td>310 mil</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">prato personalizado de 6 poços</td>
			<td colspan="2">Postagens do PDMS</td>
			<td colspan="2">medição direta de força</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Não</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Feinberg (dyn-EHT)16</td>
			<td>1,5 milhão</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">prato personalizado de 6 poços</td>
			<td colspan="2">Fio PDMS</td>
			<td colspan="2">forma do tecido</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RADÍSICO (BioWire)39, 40</td>
			<td>110 mil</td>
			<td>8</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">fio de polímero</td>
			<td colspan="2">forma do fio</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (hECT simples)1, 2</td>
			<td>1-2 milhões</td>
			<td>4**</td>
			<td colspan="2">Placa de Petri de 10 cm**</td>
			<td colspan="2">Postagens do PDMS</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (rastreamento de borda/objeto)</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT)3–9</td>
			<td>500 k-1 milhão</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6 cm Placa de Petri</td>
			<td colspan="2">Postagens do PDMS</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (rastreamento de borda/objeto)</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT com SPoT)</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6 cm Placa de Petri</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com tampas pretas</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (rastreamento de objetos)</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Passier (EHT)17</td>
			<td>245 mil</td>
			<td>36</td>
			<td colspan="2">Placa de 12 poços</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com tampas pretas</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (rastreamento de objetos)</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic13, 18</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">6 cm Placa de Petri</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com tampas</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (detecção de borda)</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic (MilliPilar)14</td>
			<td>550 mil</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">prato personalizado de 6 poços</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com tampas</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (rastreamento de objetos); imagem do cálcio</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Eschenhagen (EHT)10, 19–21</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">Placa de 12 poços</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com tampas</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (detecção de borda de pós deflexão); imagem do cálcio</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zandstra (CaMiRi)22</td>
			<td>25-150 mil</td>
			<td>96</td>
			<td colspan="2">Placa de 96 poços</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com ganchos</td>
			<td colspan="2">deflexão óptica (detecção de borda)</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Murry23, 24</td>
			<td>900 mil</td>
			<td>24</td>
			<td colspan="2">Placa de 24 poços</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com tampas, ímã integrado</td>
			<td colspan="2">sensor magnético</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Reich (μTUG)11, 12, 25</td>
			<td>indefinido</td>
			<td>156</td>
			<td colspan="2">Prato de 156 poços</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS com tampas, ímã integrado</td>
			<td colspan="2">rastreamento óptico (cordão fluorescente)</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Características de alguns modelos lineares de tecido cardíaco na literatura. Os modelos de tecido cardíaco de engenharia linear variam em tamanho, rendimento, projetos de recursos de ancoragem e a facilitação de banhos médios compartilhados, bem como os requisitos para um sistema de banho muscular separado para caracterização funcional. * Os pesquisadores usaram um sistema de tecido projetado comercialmente disponível com base nas dimensões de uma placa padrão de 6 poços. ** Um sistema modular no qual biorreatores de tecido único são ancorados a qualquer placa de cultura plástica no número e local desejados.
Este trabalho descreve o protocolo mais recente para a fabricação de nosso modelo estabelecido de tecido cardíaco humano linear projetado (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 e métodos de avaliação da função contrátil da hECT. Cada biorreator multitecidual acomoda até seis hECTs em um banho médio compartilhado e é composto por duas peças de "rack" feitas do elastômero de silicone polidimetilsiloxano (PDMS) montado em uma estrutura rígida de polissulfona. Cada rack PDMS contém seis pinos flexíveis integrados de detecção de força que têm 0,5 mm de diâmetro e 3,25 mm de comprimento e, juntos, dois racks fornecem seis pares de postes, cada um dos quais contém um hECT. A inversão do biorreator ajuda a superar qualquer obstáculo à visualização dos hECTs por baixo devido à condensação de água do meio de cultura ou distorções do menisco da interface ar-líquido. Cada contração de uma hECT causa deflexão dos postes terminais integrados, e a medida óptica do sinal de deflexão é processada em um traçado força versus tempo representando a função contrátil da hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Comparado aos biorreatores de tecido único tipicamente usados para tecidos desse tamanho, o desenho multitecidual melhora o rendimento experimental e permite o estudo da sinalização parácrina entre tecidos adjacentes de composição celular potencialmente diferente. Esse sistema foi validado em estudos publicados descrevendo aplicações em modelagem dedoenças4,8, sinalização parácrina6,7, cultura heterocelular5,9 e triagemterapêutica7,9.
Neste sistema, os hECTs são projetados para ter aproximadamente 6 mm de comprimento e 0,5 mm de diâmetro para facilitar o rastreamento óptico robusto de medições de força com baixo ruído. Além disso, aspectos da complexidade tecidual, como gradientes de difusão e organização celular, são equilibrados com uma necessidade gerenciável de 1 milhão de células por tecido. Com a tecnologia de câmera CCD padrão, forças tão fracas quanto 1 μN (representando menos de 5 μm pós-deflexão) geram um sinal claro, garantindo que mesmo a função contrátil extremamente fraca, como observado com alguns modelos de doença hECT, possa ser medida com precisão. Isso também facilita a análise detalhada da curva de força de contração, permitindo a análise de alto conteúdo de até 16 métricas de contratilidade41, incluindo força desenvolvida, taxas de contração (+dF/dt) e relaxamento (−dF/dt) e variabilidade da taxa de batimento.
Este protocolo começa com instruções para a fabricação dos componentes do biorreator. Atenção especial é dada às etapas para maximizar o rendimento da hECT, reduzir a variabilidade técnica na função tecidual e otimizar a qualidade e a profundidade da avaliação tecidual. A maioria dos estudos de engenharia de tecidos cardíacos não relata taxas de perda tecidual durante a fabricação e testes de longo prazo, embora seja um desafio bem conhecido na área e reduza o rendimento e a eficiência dos estudos27. Os métodos de engenharia de tecidos descritos aqui foram refinados ao longo dos anos para garantir a retenção de todos os hECTs na maioria dos biorreatores (independentemente de como os racks PDMS são fabricados). No entanto, mesmo uma perda de 5%-20% de tecidos pode afetar significativamente o poder estatístico, particularmente em experimentos menores limitados pelo número de cardiomiócitos disponíveis (por exemplo, devido a desafios de diferenciação com algumas linhagens celulares doentes4 ou devido ao alto custo dos cardiomiócitos comprados comercialmente), ou pela condição de tratamento (por exemplo, disponibilidade limitada ou alto custo de vários compostos de tratamento).
Este protocolo descreve a fabricação de rastreadores de poste estável (SPoTs), um novo recurso dos racks PDMS, que funcionam como tampas nas extremidades dos postes de detecção de força que seguram os hECTs27. Demonstra-se como a geometria da tampa reduz significativamente a perda de hECT por queda ou arrancamento dos postes, abrindo assim novas oportunidades para a cultura de hECTs com uma maior variedade de rigidezes e tensões, que são desafiadoras para a cultura em pinos sem tampa. Além disso, os SPoTs fornecem um objeto de alto contraste para melhorar o rastreamento óptico da contração da hECT por meio de uma forma consistente e bem definida27. Segue-se uma descrição da cultura de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e diferenciação de cardiomiócitos com base em protocolos previamente publicados 3,42,43 e uma explicação da fabricação, cultura e medidas funcionais da hECT.
Este artigo também aborda a necessidade de medir a função tecidual em temperatura fisiológica. O miocárdio humano (tanto tecido fetal como adulto saudável e doente), bem como tecido cardíaco de uma ampla gama de espécies animais (incluindo ratos, gatos, camundongos, furões e coelhos)44,45, exibe um aumento acentuado na força de contração compatível com a frequência em temperaturas de 28 °C-32 °C em comparação com a temperatura fisiológica - um fenômeno conhecido como inotropia hipotérmica45, 46º. No entanto, os efeitos da temperatura sobre a função do tecido miocárdico modificado permanecem pouco estudados. Muitos modelos recentes de tecido cardíaco projetados na literatura são projetados para serem avaliados funcionalmente a 37 °C para aproximar condições fisiológicas 13,14,37. No entanto, até onde sabemos, os efeitos dependentes da temperatura sobre a força gerada pelos tecidos cardíacos modificados não têm sido sistematicamente investigados. Esse protocolo descreve um projeto de eletrodo de estimulação que minimiza a perda de calor durante o teste, além de permitir a incorporação de um elemento de aquecimento isolado no setup para medidas funcionais, o que pode manter os hECTs em temperatura fisiológica sem comprometer a esterilidade27. Em seguida, relatamos alguns dos efeitos observados da temperatura na função hECT, incluindo sobre a força desenvolvida, frequência de batimento espontâneo, +dF/dt e −dF/dt. Em conjunto, este artigo fornece os detalhes necessários para fabricar este sistema de biorreator multitecidual com sensor de força para fabricar tecidos cardíacos humanos projetados e avaliar sua função contrátil, e um conjunto de dados é apresentado que fornece uma base de comparação para medições à temperatura ambiente e a 37 °C27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >6517K61&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 cm dishes (20 mm tall)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 N NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS225-1</td>
			<td>dilute 1:10 in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 - 200 &#956;L Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 &#956;L MicroPipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 cm Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>&#160;LED-6W&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90 degree angle mirror</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>45-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic bonding glue</td>
			<td>SCIGRIP</td>
			<td>#4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adjustable 10 cm x 10 cm jack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum 6061</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>9008K82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A-Plan 10X Objective Lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>1020-863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave Bags</td>
			<td>Propper</td>
			<td>21002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement (without insulin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black ABS</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>2.85 mm wide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Collagen I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3430009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Acrylic Sheeting</td>
			<td>estreetplastics</td>
			<td>1002502436</td>
			<td>6.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CNC Vertical Mill</td>
			<td>Haas</td>
			<td>VF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive Graphite Bars</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1763T33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Dilute to 70% in water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Automated Cell counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>E1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Cell Counting Slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine Curved Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>3110</td>
			<td>AKA &#34;incubator&#34;. With HEPA class 100 filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion360 software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>AKA &#34;CAD software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>1475</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC qualified matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>AKA &#34;basement membrane matrix&#34;. Store in frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed CCD Camera</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>P7410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Werk</td>
			<td>Axiovert 40 CFL</td>
			<td>10X phase contrast objective</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IWR-1</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabView Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow clean bench</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-201-330</td>
			<td>necessary for hECT functional analysis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laptop</td>
			<td>AsusTek</td>
			<td>Strix</td>
			<td>Intel Core i&#38; processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser Cutting Machine</td>
			<td>Epilog</td>
			<td>Helix 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnification headset</td>
			<td>ExcelBlades</td>
			<td>70020</td>
			<td>Recommended for steps requiring fine manipulations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Version 2019b or later</td>
			<td>AKA &#34;data analysis software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Vannas Scissors, 3 mm blade</td>
			<td>WPI Instruments</td>
			<td>501839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Boom Stand</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ2-STU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin stock solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 IU/ml penicillin; 10,000 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline without divalent cations</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PixelLINK Capture OEM</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>10.2.1.6</td>
			<td>AKA &#34;Camera Software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polysulfone</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>86735K73</td>
			<td>translucent amber color</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polytetrafluoroethylene (PTFE)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8545K176&#160;</td>
			<td>Black, molded</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>AKA &#34;iPSC dissociation media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone Sheeting</td>
			<td >SMI manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>glossy, 0.02 in thickness, durometer 40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads</td>
			<td>Michael&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>color should withstand autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td>used for mixing PDMS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Pulse Stimulator&#160;</td>
			<td>Astro-Med / Grass Technologies</td>
			<td>S88X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Razoblades</td>
			<td>GEM</td>
			<td>62-0179-CTN</td>
			<td>preferred over non-stainless steel due to lower hardness</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stemflex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>AKA &#34;iPSC culture media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile distilled water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 170 -&#160; Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DOWSIL 170 2LB KIT</td>
			<td>AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT</td>
			<td>AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature-controlled heated stage</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H401-HG-SMU</td>
			<td>Set height to 10 cm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermoplastic 3D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>Ultimaker 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S1459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art Parts</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Mini Band Saw</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Miniature Drill Press</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration Isolation Table</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3618000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Weighing Boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Talon Cylinder Bench Clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97035-528</td>
			<td>AKA screw clamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues

A insuficiência cardíaca continua sendo a principal causa de morte em todo o mundo, criando uma necessidade premente de melhores modelos pré-clínicos do coração humano. A engenharia de tecidos é crucial para a pesquisa em ciência básica cardíaca; a cultura de células humanas in vitro elimina as diferenças interespécies de modelos animais, enquanto um ambiente 3D mais semelhante a tecidos (por exemplo, com matriz extracelular e acoplamento heterocelular) simula condições in vivo em maior extensão do que a cultura bidimensional tradicional em placas de Petri plásticas. No entanto, cada sistema modelo requer equipamentos especializados, por exemplo, biorreatores personalizados e dispositivos de avaliação funcional. Além disso, esses protocolos são muitas vezes complicados, trabalhosos e atormentados pela falha dos tecidos pequenos e delicados.
Este artigo descreve um processo para gerar um sistema modelo robusto de tecido cardíaco humano projetado (hECT) usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos para a medição longitudinal da função tecidual. Seis hECTs com geometria de tira linear são cultivadas em paralelo, com cada hECT suspensa de um par de postes de polidimetilsiloxano (PDMS) com sensor de força acoplados a racks PDMS. Cada postagem é coberta com um rastreador de postagem estável PDMS preto (SPoT), um novo recurso que melhora a facilidade de uso, a taxa de transferência, a retenção de tecido e a qualidade dos dados. A forma permite o rastreamento óptico confiável de deflexões de poste, produzindo traçados de força de contração aprimorados com tensão ativa e passiva absoluta. A geometria da tampa elimina a falha tecidual devido ao deslizamento de hECTs dos postes e, como eles envolvem uma segunda etapa após a fabricação do rack PDMS, os SPoTs podem ser adicionados aos projetos pós-baseados em PDMS existentes sem grandes alterações no processo de fabricação do biorreator.
O sistema é usado para demonstrar a importância de medir a função hECT em temperaturas fisiológicas e mostra função tecidual estável durante a aquisição de dados. Em resumo, descrevemos um sistema modelo de última geração que reproduz condições fisiológicas fundamentais para promover a biofidelidade, eficiência e rigor de tecidos cardíacos projetados para aplicações in vitro .

Seguindo o protocolo acima, os cardiomiócitos foram gerados a partir de uma linhagem iPSC saudável usada previamente por nosso grupo 9,15 e fabricados em hECTs após 8-61 dias em cultura. A Figura 9A mostra imagens representativas de hECTs vistas de baixo, que foram criadas sem SPoTs (superior) e com SPoTs (inferior). Medidas funcionais foram realizadas à temperatura ambiente (23 °C) e fisiológica (36 °C) entre 37 dias e 52 dia...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Tecidos cardíacos tridimensionais bioprojetados usando cardiomiócitos derivados de células-tronco têm emergido como modelos promissores para estudar o miocárdio humano saudável e doente in vitro , enquanto recapitulam aspectos-chave do nicho cardíaco nativo. Este manuscrito descreve um protocolo para fabricação e análise de tecidos cardíacos projetados de alto conteúdo gerados a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos.

Projetando um Biorreator para Melhorar a Aquisição de Dados e Modelar o Rendimento de Tecidos Cardíacos Projetados

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

Nosso modelo invitro de células-tronco tridimensionais derivadas do músculo cardíaco humano melhora a biofidelidade da cultura tradicional de células bidimensionais, ao mesmo tempo em que elimina as diferenças interespécies associadas aos testes em animais de laboratório. Nosso projeto de biorreator multitecidual com pós-rastreadores estáveis maximiza o sucesso do tecido e melhora a precisão da caracterização aprofundada da função do tecido cardíaco projetado. Como a insuficiência cardíaca continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo, nossos tecidos cardíacos projetados permitem que os pesquisadores modelem doenças cardíacas humanas, bem como rastreiem potenciais terapias.Para começar, posicione quatro moldes mestres negativos de alumínio no suporte do molde de modo que os orifícios do poste se alinhem com o espaço morto oposto às prateleiras do triângulo. Coloque o aparelho entre dois braquetes paralelos e prenda as laterais juntas usando uma peça retangular de chapa de silicone de 0,5 milímetro de espessura como uma junta para evitar o vazamento do PDMS líquido. Em um recipiente raso, misture 0,5 mililitros de agente de cura PDMS com cinco mililitros de base de elastômero PDMS em uma proporção de um para 10 e mexa vigorosamente por cinco minutos.Desgaseifique a mistura de PDMS em uma câmara de vácuo sob um vácuo forte até que as bolhas desapareçam. Em seguida, despeje a mistura de PDMS sobre o aparelho de fundição, enchendo demais para garantir a cobertura completa de cada slot. Adicione pequenas contas de vidro colorido ao corpo dos racks PDMS opostos ao lado com os postes para a identificação única de cada rack.Coloque o aparelho de fundição nivelado horizontalmente na câmara de vácuo sob um vácuo forte por pelo menos 12 horas. Deixe o PDMS curar à temperatura ambiente longe da poeira por 48 horas para permitir a cura completa e a máxima resistência dos pinos delicados. Remova a braçadeira, os suportes e as chapas de silicone do aparelho de fundição.Usando uma lâmina de barbear de aço inoxidável, corte a película PDMS na parte superior do aparelho de fundição e dos suportes do quadro. Use os dedos para separar os racks PDMS das laterais do suporte fundido. Insira uma lâmina de barbear de aço inoxidável embotada no espaço morto entre o molde e o suporte fundido e separe-os, garantindo que o PDMS que preenche o espaço morto permaneça com o suporte fundido.Em seguida, usando uma lâmina afiada de aço inoxidável, corte os filmes PDMS restantes e o PDMS de espaço morto das pontas dos postes. Usando os dedos, separe lentamente o rack PDMS do molde no lado oposto aos postes. Continue para os lados alternados até que os postos estejam livres dos elencos mestres.Liberte todos os racks PDMS e os postes, como demonstrado anteriormente, e use uma lâmina de barbear afiada para aparar qualquer excesso de PDMS restante dos racks. Usando uma impressora 3D termoplástica de modelagem de deposição fundida, imprima os componentes do aparelho de fundição estável pós-rastreador, ou SPoT. Garanta um encaixe de prensa seguro entre as peças impressas em 3D e entre os racks PDMS e o gabarito de três pontas.Confirme também se os racks PDMS se encaixam perfeitamente com os postes apenas atingindo o fundo dos poços sem serem dobrados. Misture 0,5 mililitros de PDMS preto parte A a 0,5 mililitros de parte B em um barco de pesagem pequeno ou em um recipiente raso até que a solução esteja de cor uniforme. Desgaseifique o PDMS preto misto em uma câmara de vácuo sob um vácuo forte por 20 minutos.Despeje o PDMS preto desgaseificado na base impressa em 3D para preencher os orifícios e toque para garantir que não restem bolhas. Raspe o máximo possível de PDMS em excesso da base. Encaixe a peça de três pontas na base e coloque os racks PDMS nos sulcos do gabarito de três pontas, garantindo que as extremidades dos postes mergulhem no PDMS preto nos poços circulares.Deixe o PDMS preto curar à temperatura ambiente longe da poeira por 48 horas. Deslize a peça de três pontas, minimizando a tensão nos postes. Usando pinças pequenas, raspe a fina película PDMS preta ao redor de cada SPoT e, em seguida, insira pinças finas e dobradas no poço SPoT para liberá-lo da base impressa em 3D.Inspecione os SPoTs e corte qualquer filme PDMS preto restante do processo de fundição usando uma tesoura fina de vannas. Certifique-se de que os postes acabados tenham o comprimento correto, encaixando os racks PDMS na estrutura do telefone celular polis e, em seguida, deslizando-os para a placa de base preta. Após a autoclavação do biorreator e o preparo da mistura celular, proceder à fabricação dos hECTs.Usando luvas estéreis, retire a placa de base preta do saco autoclavado contendo as partes do biorreator e coloque-a em um prato de 60 mililitros com os poços voltados para cima. Pipetar 44 microlitros da mistura celular em cada poço lentamente para evitar a introdução de bolhas. Usando um novo par de luvas estéreis, remova a estrutura de polissulfona com os racks PDMS do saco de autoclave.Abaixe o quadro sobre a placa de base de modo que as extremidades do quadro se encaixem nos sulcos na extremidade da placa de base. Garantindo que os postes estejam todos retos e a estrutura não seja inclinada, coloque o biorreator em um prato de 60 milímetros. Adicione um mililitro de 10%FBS em meio de manutenção de cardiomiócitos ao prato de 60 mililitros para aumentar a umidade à medida que os hECTs se solidificam.Coloque o prato sem tampa em um prato de alto perfil de 100 milímetros e cubra-o com uma tampa de prato de 100 milímetros, em seguida, devolva o biorreator a uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius a 5% para permitir que o colágeno forme um gel com as células em suspensão. Após duas horas, retire o prato da incubadora. Adicione 13 mililitros de FBS a 10% no meio de manutenção do cardiomiócito, inclinando a placa para permitir que o meio flua entre a placa de base de PTFE e os racks PDMS.Inspecione o biorreator do lado para não haver bolhas de ar e devolva a placa para a incubadora. Se o ar estiver preso, incline o biorreator para fora do meio para deixar a bolha quebrar e baixá-la lentamente novamente, ou use uma micropipeta com uma ponta de carregamento de gel para sifão o ar sem perturbar os postes. Inspecione a compactação hECT através da janela na moldura.Ao longo de 24 a 96 horas, os hECTs compactam e tornam-se opacos. Remova a placa de base quando os hECTs estiverem compactados em pelo menos 30% em relação ao diâmetro original. Encha a placa de 60 milímetros que contém o biorreator com meio de manutenção de cardiomiócitos até que o líquido lave com o lábio da placa e adicione 14 mililitros a uma nova placa de 60 milímetros.Enquanto estiver usando luvas estéreis, vire o biorreator em seu prato para que a placa de base fique por cima. Depois de inspecionar se há bolhas de ar presas, levante lentamente a placa de base, mantendo-a nivelada. Certifique-se de que as dicas de postagem estejam em foco.Ligue o interruptor de limite e ajuste o controle deslizante até que os SPoTs estejam bem demarcados e não mudem de forma à medida que o hECT se contrai. Use a ferramenta retângulo para desenhar um retângulo ao redor de um dos SPoTs e clique no botão definir um dentro da caixa de limites de postagem para definir a posição do retângulo ao redor do SPoT, garantindo que o SPoT permaneça sempre dentro do limite do retângulo. Repita o processo para a outra postagem e registre-o no conjunto dois.Ajuste as configurações de tamanho do objeto para impedir que o programa rastreie objetos menores e certifique-se de que o número de objetos rastreados em cada retângulo permaneça constante. A interface mostra a distância medida entre os objetos rastreados em tempo real. Use este gráfico para monitorar o ruído.Sob o cabeçalho hertz de frequência de marcação, indique a faixa de frequências desejadas e o intervalo desejado para passar de min a max. Nas caixas à direita, escolha o tempo de ajuste desejado para permitir que o hECT se ajuste à nova frequência de ritmo e, em seguida, especifique o tempo de gravação e a tensão de ritmo. Comece o programa clicando no botão Iniciar programa.Após o registro dos dados de uma frequência, aumente a frequência do estimulador pelo intervalo desejado para uma nova gravação até que a frequência máxima tenha sido atingida. Imagens representativas de hECTs são mostradas aqui como vistas de baixo, criadas sem SPoTs e com SPoTs. Os SPoTs forneceram uma única forma definida para controlar durante a aquisição de dados.Em alguns casos extremos, o objeto de rastreamento foi até obscurecido. Uma forma mais confiável para rastreamento óptico e redução de ruído permitiu a medição de tecidos fracos com uma força desenvolvida tão baixa quanto um micro Newton. Os SPoTs forneceram uma geometria da tampa que evitou a perda de hECT.A função hECT medida foi estável ao longo do tempo de cultura prolongado na configuração de estimulação atual com o estágio aquecido. Comparadas às medidas em temperatura fisiológica, as hECTs apresentaram dinâmica de contração alterada à temperatura ambiente, com taxas mais lentas de contração e relaxamento. Em frequências mais altas, as hECTs tenderam a ser mais fracas à temperatura ambiente.Em frequências mais baixas, as hECTs tenderam a ser mais fortes à temperatura ambiente. Quando cadenciados a 36 graus Celsius, os hECTs apresentaram maior taxa de batimento espontâneo e maior amplitude de frequências de captação. O ambiente com temperatura controlada garante a relevância fisiológica da função dos hECTs medidos.Além disso, o banho de meio compartilhado do biorreator multitecidual facilita estudos de sinalização parácrina entre hECTs de diferentes composições celulares. A adição de SPoTs ao nosso biorreator multitecidual permite que os pesquisadores estudem eficientemente o miocárdio doente com tensão anormalmente alta ou baixa, que de outra forma escorregaria das extremidades de pinos sem tampa.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Operation of a Benchtop Bioreactor

Funcionamento de um biorreator de bancada

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

A propagação e a implantação de um enxerto traqueal biossintética engenharia de tecido em um modelo do rato

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...