Name: designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues
Uploaded: 2023-06-02T12:50:00
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Los autores agradecen al Dr. Timothy Cashman por su trabajo previo en este método. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) (R01-HL132226 y K01 HL133424) y el Programa de Redes Internacionales de Excelencia de la Fundación Leducq (CURE-PLaN).

Este protocolo utilizó una línea iPSC no identificada, SkiPS 31.3 (originalmente reprogramada con fibroblastos dérmicos de un varón sano de 45 años)47 y, por lo tanto, estaba exenta de la aprobación específica de la Junta de Revisión Institucional, en concordancia con las directrices del comité de ética de la investigación en humanos de la institución. Realice toda la manipulación celular y de la TEC en condiciones asépticas en una cabina de seguridad biológica de clase II con filtr...

Existen numerosos modelos de tejido cardíaco de ingeniería lineal publicados en la literatura, algunos de los cuales se describen en la Tabla 1. Algunos modelos implican la medición directa de la fuerza tisular, pero estos típicamente requieren la transferencia de la construcción a un baño muscular separado38. La mayoría de los modelos están diseñados con los tejidos anclados permanentemente en ambos extremos, más comúnmente a los postes PDMS <su...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected.

Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Los modelos de tejido cardíaco diseñados vienen en una amplia gama de geometrías y configuraciones para recapitular varios aspectos del nicho cardíaco nativo que son difíciles de lograr con el cultivo celular bidimensional tradicional. Una de las configuraciones más comunes es la tira de tejido lineal, con anclajes flexibles en cada extremo para inducir el autoensamblaje del tejido y proporcionar al tejido una precarga definida y una lectura de las fuerzas de contracción resultantes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23,24,25,26,27. La fuerza generada se puede determinar de manera robusta a través del seguimiento óptico del acortamiento del tejido y utilizando la teoría del haz elástico para calcular la fuerza a partir de las deflexiones medidas y la constante de resorte de los anclajes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,25,26,28.
Sin embargo, la ingeniería de tejidos cardíacos sigue siendo un campo en evolución y aún quedan algunos desafíos. Se requieren equipos especializados, como biorreactores hechos a medida y dispositivos de evaluación funcional, para cada sistema modelo 10,29,30,31. El tamaño y la complejidad del microambiente de estas construcciones a menudo están limitados por el bajo rendimiento debido a protocolos intensivos en mano de obra, alto número de células y fragilidad de los tejidos. Para abordar esto, algunos grupos han recurrido a la fabricación de microtejidos que contienen solo cientos o miles de células para facilitar ensayos de alto rendimiento que son útiles para el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, esta escala reducida complica la evaluación precisa de la función12, elimina aspectos clave del nicho cardíaco nativo (como los gradientes de difusión de nutrientes/oxígeno y la arquitectura compleja36) y limita la cantidad de material disponible para el análisis molecular y estructural posterior (que a menudo requiere la agrupación de los tejidos). En la Tabla 1 se resumen algunas de las configuraciones de los modelos de tiras de tejido lineales en la literatura 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Grupo</td>
			<td>Células por tejido</td>
			<td>Pañuelos de papel por placa</td>
			<td colspan="2">Formato de placa</td>
			<td colspan="2">Función de anclaje</td>
			<td colspan="2">Método de adquisición de datos funcionales</td>
			<td>¿Baño multimedia compartido?</td>
			<td>Medida funcional- ¿Es posible que se trate de un proceso in situ?</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Yoshida (ECT)38</td>
			<td>4 millones</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Placa modificada de 6 pocillos*</td>
			<td colspan="2">transductor de fuerza</td>
			<td colspan="2">Medición directa de la fuerza</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Chan (hESC-CM-ECTs)26</td>
			<td>310 k</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Plato personalizado de 6 pocillos</td>
			<td colspan="2">Publicaciones de PDMS</td>
			<td colspan="2">Medición directa de la fuerza</td>
			<td>Sí</td>
			<td>No</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Feinberg (dyn-EHT)16</td>
			<td>1,5 millones</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Plato personalizado de 6 pocillos</td>
			<td colspan="2">Alambre PDMS</td>
			<td colspan="2">Forma del tejido</td>
			<td>No</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RADISIC (BioWire)39, 40</td>
			<td>110 k</td>
			<td>8</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">alambre de polímero</td>
			<td colspan="2">Forma del alambre</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (ECT única)1, 2</td>
			<td>1-2 millones</td>
			<td>4**</td>
			<td colspan="2">Placa de Petri de 10 cm**</td>
			<td colspan="2">Publicaciones de PDMS</td>
			<td colspan="2">Deflexión óptica (seguimiento de bordes/objetos)</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT)3–9</td>
			<td>500 K-1 millón</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Placa de Petri de 6 cm</td>
			<td colspan="2">Publicaciones de PDMS</td>
			<td colspan="2">Deflexión óptica (seguimiento de bordes/objetos)</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT con SPoT)</td>
			<td>1 millón</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Placa de Petri de 6 cm</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con tapas negras</td>
			<td colspan="2">Deflexión óptica (seguimiento de objetos)</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Passier (EHT)17</td>
			<td>245 k</td>
			<td>36</td>
			<td colspan="2">Placa de 12 pocillos</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con tapas negras</td>
			<td colspan="2">Deflexión óptica (seguimiento de objetos)</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic13, 18</td>
			<td>1 millón</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">Placa de Petri de 6 cm</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con tapas</td>
			<td colspan="2">Deflexión óptica (detección de bordes)</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14</td>
			<td>550 k</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Plato personalizado de 6 pocillos</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con tapas</td>
			<td colspan="2">deflexión óptica (seguimiento de objetos); Imágenes de calcio</td>
			<td>No</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Eschenhagen (EHT)10, 19–21</td>
			<td>1 millón</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">Placa de 12 pocillos</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con tapas</td>
			<td colspan="2">deflexión óptica (detección de bordes de la deflexión posterior); Imágenes de calcio</td>
			<td>No</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zandstra (CaMiRi)22</td>
			<td>25-150 k</td>
			<td>96</td>
			<td colspan="2">Placa de 96 pocillos</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con ganchos</td>
			<td colspan="2">Deflexión óptica (detección de bordes)</td>
			<td>No</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Murry23, 24</td>
			<td>900 k</td>
			<td>24</td>
			<td colspan="2">Placa de 24 pocillos</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con tapas, imán integrado</td>
			<td colspan="2">Sensor magnético</td>
			<td>No</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Reich (μTUG)11, 12, 25</td>
			<td>indefinido</td>
			<td>156</td>
			<td colspan="2">Plato de 156 pocillos</td>
			<td colspan="2">Postes PDMS con tapas, imán integrado</td>
			<td colspan="2">Seguimiento óptico (perla fluorescente)</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Características de algunos modelos lineales de tejido cardíaco de ingeniería en la literatura. Los modelos de tejido cardíaco de ingeniería lineal varían en tamaño, rendimiento, diseños de características de anclaje y la facilitación de baños de medios compartidos, así como los requisitos de un sistema de baño muscular separado para la caracterización funcional. * Los investigadores utilizaron un sistema de tejido de ingeniería disponible comercialmente basado en las dimensiones de una placa estándar de 6 pocillos. ** Un sistema modular en el que los biorreactores de un solo tejido se anclan a cualquier placa de cultivo de plástico en el número y ubicación deseados.
Este artículo describe el protocolo más reciente para la fabricación de nuestro modelo establecido de tejido cardíaco humano lineal (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 y métodos para evaluar la función contráctil de la TECh. Cada biorreactor multitejido tiene capacidad para hasta seis hECT en un baño de medio compartido y está compuesto por dos piezas de "rack" hechas de elastómero de silicona polidimetilsiloxano (PDMS) montadas en un marco rígido de polisulfona. Cada bastidor PDMS contiene seis postes flexibles integrados de detección de fuerza de 0,5 mm de diámetro y 3,25 mm de largo, y juntos, dos bastidores proporcionan seis pares de postes, cada uno de los cuales tiene una hECT. La inversión del biorreactor ayuda a superar cualquier obstáculo para la visualización de los hECTs desde abajo debido a la condensación de agua del medio de cultivo o a las distorsiones del menisco de la interfaz aire-líquido. Cada contracción de una hECT provoca la deflexión de los postes finales integrados, y la medición óptica de la señal de deflexión se procesa en un trazado de fuerza frente al tiempo que representa la función contráctil de la hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . En comparación con los biorreactores de un solo tejido que se utilizan normalmente para tejidos de este tamaño, el diseño multitejido mejora el rendimiento experimental y permite el estudio de la señalización paracrina entre tejidos adyacentes de composición celular potencialmente diferente. Este sistema ha sido validado en estudios publicados que describen aplicaciones en modelización de enfermedades 4,8, señalización paracrina 6,7, cultivo heterocelular 5,9 y cribado terapéutico 7,9.
En este sistema, los hECT están diseñados para tener aproximadamente 6 mm de largo y 0,5 mm de diámetro para facilitar un seguimiento óptico robusto de las mediciones de fuerza con poco ruido. Además, los aspectos de la complejidad de los tejidos, como los gradientes de difusión y la organización celular, se equilibran con un requerimiento manejable de 1 millón de células por tejido. Con la tecnología de cámara CCD estándar, fuerzas tan débiles como 1 μN (que representan menos de 5 μm después de la deflexión) generan una señal clara, lo que garantiza que incluso la función contráctil extremadamente débil, como se observa con algunos modelos de enfermedad de TEC hequimoroidal, se pueda medir con precisión. Esto también facilita el análisis detallado de la curva de fuerza de contracción, lo que permite el análisis de alto contenido de hasta 16 métricas de contractilidad41, incluida la fuerza desarrollada, las tasas de contracción (+dF/dt) y relajación (−dF/dt) y la variabilidad de la frecuencia de batido.
Este protocolo comienza con instrucciones para la fabricación de los componentes del biorreactor. Se presta especial atención a los pasos para maximizar el rendimiento de la TECH, reducir la variabilidad técnica en la función tisular y optimizar la calidad y profundidad de la evaluación tisular. La mayoría de los estudios de ingeniería de tejidos cardíacos no informan sobre las tasas de pérdida de tejido durante la fabricación y las pruebas a largo plazo, aunque es un desafío bien conocido en el campo y reduce el rendimiento y la eficiencia de los estudios27. Los métodos de ingeniería de tejidos descritos aquí se han perfeccionado a lo largo de los años para garantizar la retención de todos los hECT en la mayoría de los biorreactores (independientemente de cómo se fabriquen los racks de PDMS). Sin embargo, incluso una pérdida de tejidos del 5% al 20% puede afectar significativamente el poder estadístico, particularmente en experimentos más pequeños limitados por el número de cardiomiocitos disponibles (por ejemplo, debido a los desafíos de diferenciación con algunas líneas celulares enfermas4 o debido al alto costo de los cardiomiocitos comprados comercialmente), o por la condición del tratamiento (por ejemplo, disponibilidad limitada o alto costo de varios compuestos de tratamiento).
Este protocolo describe la fabricación de rastreadores de postes estables (SPoTs), una nueva característica de los racks PDMS, que funcionan como tapas en los extremos de los postes de detección de fuerza que sostienen los hECTs27. Se demuestra cómo la geometría de la tapa reduce significativamente la pérdida de hECT por caída o tirón de los postes, lo que abre nuevas oportunidades para el cultivo de hECT con una mayor variedad de rigideces y tensiones, que son difíciles de cultivar en postes sin tapa. Además, los SPoT proporcionan un objeto de alto contraste para mejorar el seguimiento óptico de la contracción de la TEC a través de una forma consistente y bien definida27. A continuación, se describe el cultivo de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y la diferenciación de cardiomiocitos con base en protocolos publicados anteriormente 3,42,43 y una explicación de la fabricación, el cultivo y las mediciones funcionales de la TECH.
Este artículo también aborda la necesidad de medir la función tisular a temperatura fisiológica. El miocardio humano (tejido sano y enfermo fetal y adulto), así como el tejido cardíaco de una amplia gama de especies animales (incluidas ratas, gatos, ratones, hurones y conejos)44,45, muestra un marcado aumento en la fuerza de contracción de frecuencia a temperaturas de 28 °C-32 °C en comparación con la temperatura fisiológica, un fenómeno conocido como inotropía hipotérmica45, Artículo 46. Sin embargo, los efectos de la temperatura sobre la función tisular miocárdica modificada siguen siendo poco estudiados. Muchos modelos recientes de tejido cardíaco diseñados en la literatura están diseñados para ser evaluados funcionalmente a 37 °C para aproximarse a las condiciones fisiológicas 13,14,37. Sin embargo, hasta donde sabemos, los efectos dependientes de la temperatura sobre la fuerza generada por los tejidos cardíacos modificados no se han investigado sistemáticamente. Este protocolo describe un diseño de electrodo de estimulación que minimiza la pérdida de calor durante las pruebas, además de permitir la incorporación de un elemento calefactor aislado en la configuración para mediciones funcionales, que puede mantener los hECT a temperatura fisiológica sin comprometer la esterilidad27. A continuación, informamos de algunos de los efectos observados de la temperatura sobre la función de la TECh, incluyendo la fuerza desarrollada, la frecuencia de latido espontáneo, +dF/dt y −dF/dt. En conjunto, este artículo proporciona los detalles necesarios para fabricar este sistema de biorreactor de detección de fuerza de múltiples tejidos para fabricar tejidos cardíacos de ingeniería humana y evaluar su función contráctil, y se presenta un conjunto de datos que proporciona una base para la comparación de mediciones a temperatura ambiente y a 37 °C27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >6517K61&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 cm dishes (20 mm tall)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 N NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS225-1</td>
			<td>dilute 1:10 in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 - 200 &#956;L Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 &#956;L MicroPipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 cm Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>&#160;LED-6W&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90 degree angle mirror</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>45-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic bonding glue</td>
			<td>SCIGRIP</td>
			<td>#4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adjustable 10 cm x 10 cm jack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum 6061</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>9008K82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A-Plan 10X Objective Lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>1020-863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave Bags</td>
			<td>Propper</td>
			<td>21002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement (without insulin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black ABS</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>2.85 mm wide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Collagen I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3430009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Acrylic Sheeting</td>
			<td>estreetplastics</td>
			<td>1002502436</td>
			<td>6.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CNC Vertical Mill</td>
			<td>Haas</td>
			<td>VF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive Graphite Bars</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1763T33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Dilute to 70% in water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Automated Cell counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>E1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Cell Counting Slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine Curved Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>3110</td>
			<td>AKA &#34;incubator&#34;. With HEPA class 100 filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion360 software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>AKA &#34;CAD software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>1475</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC qualified matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>AKA &#34;basement membrane matrix&#34;. Store in frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed CCD Camera</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>P7410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Werk</td>
			<td>Axiovert 40 CFL</td>
			<td>10X phase contrast objective</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IWR-1</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabView Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow clean bench</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-201-330</td>
			<td>necessary for hECT functional analysis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laptop</td>
			<td>AsusTek</td>
			<td>Strix</td>
			<td>Intel Core i&#38; processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser Cutting Machine</td>
			<td>Epilog</td>
			<td>Helix 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnification headset</td>
			<td>ExcelBlades</td>
			<td>70020</td>
			<td>Recommended for steps requiring fine manipulations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Version 2019b or later</td>
			<td>AKA &#34;data analysis software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Vannas Scissors, 3 mm blade</td>
			<td>WPI Instruments</td>
			<td>501839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Boom Stand</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ2-STU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin stock solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 IU/ml penicillin; 10,000 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline without divalent cations</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PixelLINK Capture OEM</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>10.2.1.6</td>
			<td>AKA &#34;Camera Software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polysulfone</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>86735K73</td>
			<td>translucent amber color</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polytetrafluoroethylene (PTFE)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8545K176&#160;</td>
			<td>Black, molded</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>AKA &#34;iPSC dissociation media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone Sheeting</td>
			<td >SMI manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>glossy, 0.02 in thickness, durometer 40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads</td>
			<td>Michael&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>color should withstand autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td>used for mixing PDMS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Pulse Stimulator&#160;</td>
			<td>Astro-Med / Grass Technologies</td>
			<td>S88X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Razoblades</td>
			<td>GEM</td>
			<td>62-0179-CTN</td>
			<td>preferred over non-stainless steel due to lower hardness</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stemflex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>AKA &#34;iPSC culture media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile distilled water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 170 -&#160; Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DOWSIL 170 2LB KIT</td>
			<td>AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT</td>
			<td>AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature-controlled heated stage</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H401-HG-SMU</td>
			<td>Set height to 10 cm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermoplastic 3D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>Ultimaker 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S1459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art Parts</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Mini Band Saw</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Miniature Drill Press</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration Isolation Table</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3618000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Weighing Boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Talon Cylinder Bench Clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97035-528</td>
			<td>AKA screw clamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues

La insuficiencia cardíaca sigue siendo la principal causa de muerte en todo el mundo, lo que crea una necesidad apremiante de mejores modelos preclínicos del corazón humano. La ingeniería de tejidos es crucial para la investigación cardíaca de la ciencia básica; El cultivo de células humanas in vitro elimina las diferencias entre especies de los modelos animales, mientras que un entorno 3D más parecido a un tejido (por ejemplo, con matriz extracelular y acoplamiento heterocelular) simula las condiciones in vivo en mayor medida que el cultivo bidimensional tradicional en placas de Petri de plástico. Sin embargo, cada modelo de sistema requiere equipos especializados, por ejemplo, biorreactores diseñados a medida y dispositivos de evaluación funcional. Además, estos protocolos suelen ser complicados, laboriosos y están plagados de fallos en los tejidos pequeños y delicados.
Este artículo describe un proceso para generar un sistema modelo robusto de tejido cardíaco humano (hECT) utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas para la medición longitudinal de la función tisular. Se cultivan seis hECT con geometría de tira lineal en paralelo, con cada hECT suspendida de un par de postes de polidimetilsiloxano con detección de fuerza (PDMS) unidos a bastidores de PDMS. Cada publicación está cubierta con un rastreador de publicaciones estables (SPoT) PDMS negro, una nueva característica que mejora la facilidad de uso, el rendimiento, la retención de tejidos y la calidad de los datos. La forma permite el seguimiento óptico fiable de las deflexiones posteriores, lo que produce trazados mejorados de la fuerza de contracción con tensión activa y pasiva absoluta. La geometría de la tapa elimina la falla del tejido debido a que los hECT se deslizan de los postes y, como implican un segundo paso después de la fabricación del bastidor de PDMS, los SPoT se pueden agregar a los diseños existentes basados en postes de PDMS sin cambios importantes en el proceso de fabricación del biorreactor.
El sistema se utiliza para demostrar la importancia de medir la función de la TEC a temperaturas fisiológicas y muestra una función tisular estable durante la adquisición de datos. En resumen, describimos un sistema modelo de última generación que reproduce condiciones fisiológicas clave para avanzar en la biofidelidad, la eficiencia y el rigor de los tejidos cardíacos diseñados para aplicaciones in vitro .

Siguiendo el protocolo anterior, se generaron cardiomiocitos a partir de una línea de iPSC sana utilizada previamente por nuestro grupo 9,15 y se fabricaron en TEC después de 8-61 días en cultivo. La Figura 9A muestra imágenes representativas de los TEC vistos desde abajo, que se crearon sin (arriba) y con (abajo) SPoT. Las mediciones funcionales se tomaron a temperatura ambiente (23 °C) y a temperatura fisiológica (36 °C) ent...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Diseño de un biorreactor para mejorar la adquisición de datos y el rendimiento del modelo de tejidos cardíacos diseñados

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

Nuestro modelo in vitro de músculo cardíaco humano tridimensional derivado de células madre mejora la biofidelidad del cultivo celular bidimensional tradicional al tiempo que elimina las diferencias entre especies asociadas con las pruebas con animales de laboratorio. Nuestro diseño de biorreactor multitejido con rastreadores de postes estables maximiza el éxito de los tejidos y mejora la precisión de la caracterización en profundidad de la función tisular cardíaca diseñada. Dado que la insuficiencia cardíaca sigue siendo la principal causa de muerte en todo el mundo, nuestros tejidos cardíacos diseñados permiten a los investigadores modelar enfermedades cardíacas humanas, así como detectar posibles terapias.Para comenzar, coloque cuatro moldes maestros negativos de aluminio en el soporte de fundición de modo que los orificios del poste se alineen con el espacio muerto opuesto a los estantes triangulares. Coloque el aparato entre dos soportes paralelos y sujete los lados con una pieza rectangular de lámina de silicona de 0,5 milímetros de espesor como junta para evitar fugas del PDMS líquido. En un recipiente poco profundo, mezcle 0,5 mililitros de agente de curado PDMS con cinco mililitros de base de elastómero PDMS en una proporción de uno a 10 y revuelva vigorosamente durante cinco minutos.Desgasificar la mezcla de PDMS en una cámara de vacío bajo un fuerte vacío hasta que desaparezcan las burbujas. A continuación, vierta la mezcla de PDMS en el aparato de fundición, llenando en exceso para garantizar una cobertura completa de cada ranura. Agregue pequeñas cuentas de vidrio de colores al cuerpo de los bastidores PDMS opuestos al lado con los postes para la identificación única de cada estante.Coloque el aparato de fundición nivelado horizontalmente en la cámara de vacío bajo un fuerte vacío durante al menos 12 horas. Deje que el PDMS se cure a temperatura ambiente lejos del polvo durante 48 horas para permitir un curado completo y la máxima resistencia de los postes delicados. Retire la abrazadera, los soportes y las láminas de silicona del aparato de fundición.Con una cuchilla de afeitar de acero inoxidable, recorte la película PDMS en la parte superior del aparato de fundición y los soportes del marco. Use los dedos para separar los bastidores PDMS de los lados del soporte de fundición. Inserte una hoja de afeitar de acero inoxidable desafilada en el espacio muerto entre el yeso y el soporte de yeso y sepárelos, asegurándose de que el PDMS que llena el espacio muerto permanezca con el soporte de yeso.Luego, con una cuchilla afilada de acero inoxidable, corte las películas PDMS restantes y el PDMS de espacio muerto de las puntas de los postes. Con los dedos, separe lentamente la rejilla PDMS del yeso en el lado opuesto a los postes. Continúe alternando los lados hasta que los postes estén libres de los moldes maestros.Libere todos los bastidores PDMS y los postes como se demostró anteriormente, y use una cuchilla de afeitar afilada para recortar cualquier exceso de PDMS restante de los bastidores. Usando una impresora 3D de modelado por deposición fundida termoplástica, imprima los componentes del aparato de fundición de rastreador de poste estable, o SPoT. Garantice un ajuste seguro a presión entre las piezas impresas en 3D y entre los bastidores PDMS y la plantilla de tres puntas.También confirme que los bastidores PDMS encajan perfectamente con los postes que llegan al fondo de los pozos sin doblarse. Mezcle 0,5 mililitros de PDMS negro de la parte A con 0,5 mililitros de la parte B en un bote de pesaje pequeño o en un recipiente poco profundo hasta que la solución tenga un color uniforme. Desgasificar el PDMS negro mezclado en una cámara de vacío bajo un fuerte vacío durante 20 minutos.Vierte el PDMS negro desgasificado sobre la base impresa en 3D para rellenar los agujeros y golpea para asegurarte de que no quedan burbujas. Raspe la mayor cantidad posible de PDMS de la base. Encaje la pieza de tres puntas en la base y coloque los bastidores de PDMS en las ranuras de la plantilla de tres puntas, asegurándose de que los extremos de los postes se sumerjan en el PDMS negro de los pozos circulares.Deje que el PDMS negro se cure a temperatura ambiente lejos del polvo durante 48 horas. Deslice hacia afuera la pieza de tres puntas, minimizando la tensión en los postes. Con unas pinzas pequeñas, raspe la fina película negra de PDMS que rodea cada SPoT, luego inserte unas pinzas dobladas y de punta fina en el pocillo del SPoT para liberarlo de la base impresa en 3D.Inspeccione los SPoT y recorte cualquier resto de película negra de PDMS del proceso de fundición con unas finas tijeras de vannas. Asegúrese de que los postes terminados tengan la longitud correcta colocando los bastidores PDMS en el marco del teléfono celular de polietileno y luego deslizándolo sobre la placa base negra. Después de esterilizar el biorreactor en autoclave y preparar la mezcla celular, se procede a fabricar los hECT.Con guantes estériles, retire la placa base negra de la bolsa esterilizada en autoclave que contiene las piezas del biorreactor y colóquela en un plato de 60 mililitros con los pocillos hacia arriba. Pipetear 44 microlitros de la mezcla de células en cada pocillo lentamente para evitar la introducción de burbujas. Con un par de guantes estériles nuevos, retire el marco de polisulfona con las gradillas PDMS de la bolsa del autoclave.Baje el marco sobre la placa base de modo que los extremos del marco encajen en las ranuras del extremo de la placa base. Asegurándose de que los postes estén todos rectos y que el marco no esté inclinado, coloque el biorreactor en un plato de 60 milímetros. Agregue un mililitro de FBS al 10% en medio de mantenimiento de cardiomiocitos a la placa de 60 mililitros para aumentar la humedad a medida que los hECT se solidifican.Coloque el plato sin tapa en un plato de alto perfil de 100 milímetros y cúbralo con una tapa de plato de 100 milímetros, luego regrese el biorreactor a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius para permitir que el colágeno forme un gel con las células en suspensión. Después de dos horas, retire el plato de la incubadora. Agregue 13 mililitros de FBS al 10% en el medio de mantenimiento de cardiomiocitos, inclinando el plato para permitir que el medio fluya entre la placa base de PTFE y las gradillas de PDMS.Inspeccione el biorreactor desde un lado para ver si no hay burbujas de aire y devuelva el plato a la incubadora. Si queda aire atrapado, incline el biorreactor fuera del medio para dejar que la burbuja se rompa y vuelva a bajarlo lentamente, o utilice una micropipeta con una punta de carga de gel para desviar el aire sin alterar los postes. Inspeccione la compactación hECT a través de la ventana del marco.A lo largo de 24 a 96 horas, los TCE se compactan y se vuelven opacos. Retire la placa base cuando los hECT estén compactados en al menos un 30% en comparación con el diámetro original. Llene el plato de 60 milímetros que contiene el biorreactor con medio de mantenimiento de cardiomiocitos hasta que el líquido se enjuague con el borde del plato y agregue 14 mililitros a un nuevo plato de 60 milímetros.Mientras usa guantes estériles, voltee el biorreactor en su plato para que la placa base quede en la parte superior. Después de inspeccionar si hay burbujas de aire atrapadas, levante lentamente la placa base, manteniéndola nivelada. Asegúrate de que los consejos de las publicaciones estén enfocados.Encienda el interruptor de umbral y ajuste el control deslizante hasta que los SPoT estén bien demarcados y no cambien de forma a medida que se contrae la hECT. Use la herramienta de rectángulo para dibujar un rectángulo alrededor de uno de los SPoT y haga clic en el botón establecer uno dentro del cuadro de límites de la publicación para establecer la posición del rectángulo alrededor del SPoT, asegurándose de que el SPoT siempre permanezca dentro del límite del rectángulo. Repita el proceso en la otra publicación y grábelo en el segundo conjunto.Ajuste la configuración del tamaño del objeto para evitar que el programa realice un seguimiento de los objetos más pequeños y asegúrese de que el número de objetos rastreados en cada rectángulo permanezca constante. La interfaz muestra la distancia medida entre los objetos rastreados en tiempo real. Utilice este gráfico para controlar el ruido.Debajo del encabezado de hercios de frecuencia de marcapasos, indique el rango de frecuencias deseadas y el intervalo deseado para pasar de mínimo a máximo. En los cuadros de la derecha, elija el tiempo de ajuste deseado para permitir que el hECT se ajuste a la nueva frecuencia de estimulación y, a continuación, especifique el tiempo de grabación y el voltaje de estimulación. Comience el programa haciendo clic en el botón de inicio del programa.Después de que se hayan grabado los datos de una frecuencia, aumente la frecuencia del estimulador en el intervalo deseado para una nueva grabación hasta que se haya alcanzado la frecuencia máxima. Aquí se muestran imágenes representativas de las TEC vistas desde la parte inferior, creadas sin SPoT y con SPoT. Los SPoT proporcionaron una única forma definida para realizar un seguimiento durante la adquisición de datos.En algunos casos extremos, el objeto de rastreo incluso se oscureció. Una forma más fiable para el seguimiento óptico y la reducción del ruido permitió la medición de tejidos débiles con una fuerza desarrollada tan baja como un micro Newton. Los SPoT proporcionaron una geometría de tapa que evitó la pérdida de hECT.La función de TEC medida se mantuvo estable durante el tiempo de cultivo prolongado en la configuración de estimulación actual con la etapa calentada. En comparación con las mediciones a temperatura fisiológica, los TEC mostraron una dinámica de contracción alterada a temperatura ambiente, con tasas más lentas de contracción y relajación. A frecuencias más altas, los TEC tendían a ser más débiles a temperatura ambiente.A frecuencias más bajas, los TEC tendían a ser más fuertes a temperatura ambiente. Cuando se marcaron a 36 grados centígrados, los hECT tenían una frecuencia de latidos espontáneos más alta y un rango más amplio de frecuencias de captura. El entorno de temperatura controlada garantiza la relevancia fisiológica de la función de las hECT medidas.Además, el baño de medios compartidos del biorreactor multitejido facilita los estudios de señalización paracrina entre hECTs de diferentes composiciones celulares. La adición de SPoT a nuestro biorreactor multitejido permite a los investigadores estudiar de manera eficiente el miocardio enfermo con una tensión anormalmente alta o baja, que de otro modo se deslizaría por los extremos de los postes destapados.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigación

Bioingeniería

Operation of a Benchtop Bioreactor

La operación de un biorreactor de sobremesa

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Atímicos Rata Modelo de Evaluación de Ingeniería de ligamento cruzado anterior injertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...