Name: designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues
Uploaded: 2023-06-02T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues at JoVE.com

Författarna tackar Dr. Timothy Cashman för tidigare arbete med denna metod. Denna studie finansierades av National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 och K01 HL133424) och Leducq Foundation International Networks of Excellence Program (CURE-PLaN).

Detta protokoll använde en avidentifierad iPSC-linje, SkiPS 31.3 (ursprungligen omprogrammerad med hjälp av dermala fibroblaster från en frisk 45-årig man)47, och var därför undantagen från specifikt godkännande från Institutional Review Board, i enlighet med institutionens riktlinjer för humanforskningsetiska kommittéer. Utför all cell- och hECT-manipulation under aseptiska förhållanden i ett HEPA-filtrerat biologiskt säkerhetsskåp av klass II eller arbetsbänk med laminärt flöd...

Det finns ett stort antal linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller publicerade i litteraturen, av vilka några beskrivs i tabell 1. Vissa modeller involverar direkt mätning av vävnadskraften, men dessa kräver vanligtvis att konstruktionen överförs till ett separat muskelbad38. De flesta modeller är utformade med vävnaderna permanent förankrade i båda ändar, oftast till PDMS-stolpar 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <sup class="...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected&#160;from:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected.

Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Konstruerade hjärtvävnadsmodeller finns i en mängd olika geometrier och konfigurationer för att rekapitulera olika aspekter av den ursprungliga hjärtnischen som är svåra att uppnå med traditionell tvådimensionell cellodling. En av de vanligaste konfigurationerna är den linjära vävnadsremsan, med flexibla ankare i varje ände för att inducera självorganisering av vävnaden och förse vävnaden med en definierad förspänning och en avläsning av de resulterande ryckkrafterna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23,24,25,26,27. Den genererade kraften kan bestämmas på ett robust sätt genom optisk spårning av vävnadsförkortningen och med hjälp av elastisk strålteori för att beräkna kraften från de uppmätta avböjningarna och fjäderkonstanten för ankarna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,25,26,28.
Hjärtvävnadsteknik är dock fortfarande ett område under utveckling, och vissa utmaningar kvarstår. Specialiserad utrustning, såsom specialtillverkade bioreaktorer och funktionsbedömningsanordningar, krävs för varje modellsystem 10,29,30,31. Storleken och komplexiteten hos mikromiljön för dessa konstruktioner begränsas ofta av låg genomströmning på grund av arbetsintensiva protokoll, ett stort antal celler och vävnadsbräcklighet. För att ta itu med detta har vissa grupper vänt sig till tillverkning av mikrovävnader som endast innehåller hundratals eller tusentals celler för att underlätta analyser med hög genomströmning som är användbara för läkemedelsupptäckt. Denna reducerade skala komplicerar dock den exakta bedömningen av funktion12, eliminerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen (såsom närings-/syrediffusionsgradienter och komplex arkitektur36) och begränsar mängden material som är tillgängligt för efterföljande molekylär och strukturell analys (vilket ofta kräver poolning av vävnaderna). Tabell 1 sammanfattar några av konfigurationerna av linjära vävnadsremsmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Grupp</td>
			<td>Celler per vävnad</td>
			<td>Vävnader per platta</td>
			<td colspan="2">Plattans format</td>
			<td colspan="2">Funktion för förankring</td>
			<td colspan="2">Funktionell datainsamlingsmetod</td>
			<td>Delat mediabad?</td>
			<td>Funktionellt mått- på plats?</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Yoshida (ECT)38</td>
			<td>4 miljoner</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Modifierad 6-hålsplatta*</td>
			<td colspan="2">Kraftgivare</td>
			<td colspan="2">Direkt kraftmätning</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Nej</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Chan (hESC-CM-ECT)26</td>
			<td>310 k-lopp</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">anpassad 6-brunns maträtt</td>
			<td colspan="2">PDMS-inlägg</td>
			<td colspan="2">Direkt kraftmätning</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Nej</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Feinberg (dyn-EHT)16</td>
			<td>1,5 miljoner</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">anpassad 6-brunns maträtt</td>
			<td colspan="2">PDMS-kabel</td>
			<td colspan="2">vävnadens form</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RADISIC (BioWire)39, 40</td>
			<td>110 km-lopp</td>
			<td>8</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Tråd av polymer</td>
			<td colspan="2">Trådens form</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (enkel hECT)1, 2</td>
			<td>1-2 miljoner</td>
			<td>4**</td>
			<td colspan="2">10 cm petriskål**</td>
			<td colspan="2">PDMS-inlägg</td>
			<td colspan="2">Optisk avböjning (kant-/objektspårning)</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT)3–9</td>
			<td>500 K-1 miljon</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6 cm petriskål</td>
			<td colspan="2">PDMS-inlägg</td>
			<td colspan="2">Optisk avböjning (kant-/objektspårning)</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT med SPoT)</td>
			<td>1 miljon</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6 cm petriskål</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med svarta lock</td>
			<td colspan="2">Optisk avböjning (objektspårning)</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Passier (EHT)17</td>
			<td>245 k-lopp</td>
			<td>36</td>
			<td colspan="2">Tallrik med 12 brunnar</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med svarta lock</td>
			<td colspan="2">Optisk avböjning (objektspårning)</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic13, 18</td>
			<td>1 miljon</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">6 cm petriskål</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med lock</td>
			<td colspan="2">Optisk avböjning (kantdetektering)</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14</td>
			<td>550 km-lopp</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">anpassad 6-brunns maträtt</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med lock</td>
			<td colspan="2">optisk avböjning (objektspårning); Kalcium avbildning</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Eschenhagen (EHT)10, 19–21</td>
			<td>1 miljon</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">Tallrik med 12 brunnar</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med lock</td>
			<td colspan="2">optisk avböjning (kantdetektering av efterböjning); Kalcium avbildning</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zandstra (CaMiRi)22</td>
			<td>25-150 km-lopp</td>
			<td>96</td>
			<td colspan="2">Platta med 96 brunnar</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med krokar</td>
			<td colspan="2">Optisk avböjning (kantdetektering)</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Murry23, 24</td>
			<td>900 km-lopp</td>
			<td>24</td>
			<td colspan="2">Tallrik med 24 brunnar</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet</td>
			<td colspan="2">Magnetisk sensor</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Reich (μTUG)11, 12, 25</td>
			<td>odefinierad</td>
			<td>156</td>
			<td colspan="2">Skål med 156 brunnar</td>
			<td colspan="2">PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet</td>
			<td colspan="2">Optisk spårning (fluorescerande pärla)</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Karakteristika för några linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen. Linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller varierar i storlek, genomströmning, förankringsfunktionsdesign och underlättande av delade mediumbad, samt kraven på ett separat muskelbadsystem för funktionell karakterisering. * Forskarna använde ett kommersiellt tillgängligt konstruerat vävnadssystem baserat på måtten på en standard 6-hålsplatta. ** Ett modulärt system där bioreaktorer med en enda vävnad förankras i valfri plastodlingsskål i önskat antal och på önskad plats.
Denna artikel beskriver det senaste protokollet för tillverkning av vår etablerade modell av linjär humaniserad hjärtvävnad (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 och metoder för att bedöma hECT:s kontraktila funktion. Varje bioreaktor med flera vävnader rymmer upp till sex hECT:er i ett gemensamt mediumbad och består av två "rack"-bitar gjorda av silikonelastomeren polydimetylsiloxan (PDMS) monterad på en styv polysulfonram. Varje PDMS-rack innehåller sex flexibla integrerade kraftavkännande stolpar som är 0,5 mm i diameter och 3,25 mm långa, och tillsammans ger två rack sex par stolpar, som var och en rymmer en hECT. Inversion av bioreaktorn hjälper till att övervinna eventuella hinder för visualisering av hECT:erna underifrån på grund av vattenkondensation från odlingsmediet eller distorsioner från menisken i luft-vätskegränssnittet. Varje sammandragning av en hECT orsakar avböjning av de integrerade ändstolparna, och den optiska mätningen av avböjningssignalen bearbetas till en kraft- kontra tidsspårning som representerar hECT:s sammandragningsfunktion 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Jämfört med de bioreaktorer med en enda vävnad som vanligtvis används för vävnader av denna storlek, förbättrar designen med flera vävnader den experimentella genomströmningen och möjliggör studier av parakrin signalering mellan intilliggande vävnader med potentiellt olika cellulär sammansättning. Detta system har validerats i publicerade studier som beskriver tillämpningar inom sjukdomsmodellering 4,8, parakrin signalering 6,7, heterocellulär odling 5,9 och terapeutisk screening 7,9.
I detta system är hECT:erna utformade för att vara cirka 6 mm långa och 0,5 mm i diameter för att underlätta robust optisk spårning av kraftmätningar med lågt brus. Dessutom balanseras aspekter av vävnadskomplexitet såsom diffusionsgradienter och cellulär organisation med ett hanterbart behov av 1 miljon celler per vävnad. Med standard CCD-kamerateknik genererar krafter så svaga som 1 μN (vilket motsvarar mindre än 5 μm efterböjning) en tydlig signal, vilket säkerställer att även extremt svag kontraktil funktion, som observerats med vissa hECT-sjukdomsmodeller, kan mätas exakt. Detta underlättar också den detaljerade analysen av ryckkraftskurvan, vilket möjliggör analys med högt innehåll av upp till 16 kontraktilitetsmått41, inklusive utvecklad kraft, kontraktionshastigheter (+dF/dt) och relaxation (−dF/dt) och variationsfrekvens i svävningshastigheten.
Detta protokoll börjar med instruktioner för tillverkning av bioreaktorkomponenterna. Särskild uppmärksamhet ägnas åt stegen för att maximera hECT-utbytet, minska den tekniska variationen i vävnadsfunktionen och optimera kvaliteten och djupet i vävnadsbedömningen. De flesta studier av hjärtvävnadsteknik rapporterar inte vävnadsförlust under tillverkning och långtidstestning, även om det är en välkänd utmaning inom området ochminskar genomströmningen och effektiviteten i studierna. De vävnadstekniska metoder som beskrivs här har förfinats under årens lopp för att säkerställa retention av alla hECT:er i de flesta bioreaktorer (oavsett hur PDMS-racken är tillverkade). Men även en förlust av vävnader på 5–20 % kan avsevärt påverka den statistiska styrkan, särskilt i mindre experiment som begränsas av antalet tillgängliga kardiomyocyter (t.ex. på grund av differentieringsutmaningar med vissa sjuka cellinjer4 eller på grund av den höga kostnaden för kommersiellt inköpta kardiomyocyter), eller av behandlingstillståndet (t.ex. begränsad tillgänglighet eller höga kostnader för olika behandlingsföreningar).
Detta protokoll beskriver tillverkningen av stabila postspårare (SPoTs), en ny funktion i PDMS-racken, som fungerar som lock i ändarna av de kraftavkännande stolparna som håller hECTs27. Det demonstreras hur lockets geometri avsevärt minskar hECT-förlusten från att falla eller dra av stolparna, vilket öppnar nya möjligheter för att odla hECT med en större variation av styvheter och spänningar, vilket är utmanande att odla på otäckta stolpar. Dessutom ger SPoTs ett objekt med hög kontrast för att förbättra den optiska spårningen av hECT-kontraktionen genom en konsekvent och väldefinierad form27. Detta följs av en beskrivning av odling av humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och kardiomyocytdifferentiering baserat på tidigare publicerade protokoll 3,42,43 och en förklaring av hECT-tillverkning, odling och funktionella mätningar.
Den här artikeln tar också upp behovet av att mäta vävnadsfunktion vid fysiologisk temperatur. Humant myokardium (frisk och sjuk vävnad hos foster och vuxna) samt hjärtvävnad från ett brett spektrum av djurarter (inklusive råttor, katter, möss, illrar och kaniner)44,45, uppvisar en markant ökning av den frekvensmatchade ryckkraften vid temperaturer på 28 °C–32 °C jämfört med fysiologisk temperatur – ett fenomen som kallas hypotermisk inotropi45. 46. veckor Effekterna av temperatur på den konstruerade myokardvävnadens funktion är dock fortfarande understuderade. Många nyare konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen är utformade för att bedömas funktionellt vid 37 °C för att approximera fysiologiska förhållanden 13,14,37. Såvitt vi vet har dock de temperaturberoende effekterna på den kraft som genereras av konstruerad hjärtvävnad inte undersökts systematiskt. Detta protokoll beskriver en stimuleringselektroddesign som minimerar värmeförlusten under testningen, samt möjliggör införlivande av ett isolerat värmeelement i installationen för funktionella mätningar, vilket kan hålla hECT:erna vid fysiologisk temperatur utan att kompromissa med steriliteten27. Vi rapporterar sedan några av de observerade effekterna av temperatur på hECT-funktionen, inklusive på den utvecklade kraften, spontan slagfrekvens, +dF/dt och −dF/dt. Sammantaget ger denna artikel de detaljer som krävs för att tillverka detta kraftavkännande bioreaktorsystem för att tillverka mänsklig hjärtvävnad och för att bedöma deras kontraktila funktion, och en uppsättning data presenteras som ger en grund för jämförelse för mätningar vid rumstemperatur och vid 37 °C27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >6517K61&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.7 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 cm dishes (20 mm tall)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 N NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS225-1</td>
			<td>dilute 1:10 in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 - 200 &#956;L Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 &#956;L MicroPipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>6-000-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 cm Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>&#160;LED-6W&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90 degree angle mirror</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>45-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic bonding glue</td>
			<td>SCIGRIP</td>
			<td>#4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adjustable 10 cm x 10 cm jack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-673-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum 6061</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>9008K82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A-Plan 10X Objective Lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>1020-863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave Bags</td>
			<td>Propper</td>
			<td>21002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B-27 supplement (without insulin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black ABS</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>2.85 mm wide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Collagen I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1064401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Class II Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3430009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Acrylic Sheeting</td>
			<td>estreetplastics</td>
			<td>1002502436</td>
			<td>6.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CNC Vertical Mill</td>
			<td>Haas</td>
			<td>VF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive Graphite Bars</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1763T33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td>Dilute to 70% in water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Automated Cell counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>E1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVE Cell Counting Slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine Curved Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>3110</td>
			<td>AKA &#34;incubator&#34;. With HEPA class 100 filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fusion360 software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>AKA &#34;CAD software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>1475</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC qualified matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>AKA &#34;basement membrane matrix&#34;. Store in frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed CCD Camera</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>P7410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Werk</td>
			<td>Axiovert 40 CFL</td>
			<td>10X phase contrast objective</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IWR-1</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabView Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow clean bench</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-201-330</td>
			<td>necessary for hECT functional analysis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laptop</td>
			<td>AsusTek</td>
			<td>Strix</td>
			<td>Intel Core i&#38; processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser Cutting Machine</td>
			<td>Epilog</td>
			<td>Helix 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnification headset</td>
			<td>ExcelBlades</td>
			<td>70020</td>
			<td>Recommended for steps requiring fine manipulations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Version 2019b or later</td>
			<td>AKA &#34;data analysis software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Vannas Scissors, 3 mm blade</td>
			<td>WPI Instruments</td>
			<td>501839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Boom Stand</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ2-STU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin stock solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 IU/ml penicillin; 10,000 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline without divalent cations</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Controller</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PixelLINK Capture OEM</td>
			<td>PixelLINK</td>
			<td>10.2.1.6</td>
			<td>AKA &#34;Camera Software&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polysulfone</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>86735K73</td>
			<td>translucent amber color</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polytetrafluoroethylene (PTFE)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8545K176&#160;</td>
			<td>Black, molded</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>AKA &#34;iPSC dissociation media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone Sheeting</td>
			<td >SMI manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>glossy, 0.02 in thickness, durometer 40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads</td>
			<td>Michael&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>color should withstand autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td>used for mixing PDMS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Pulse Stimulator&#160;</td>
			<td>Astro-Med / Grass Technologies</td>
			<td>S88X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Razoblades</td>
			<td>GEM</td>
			<td>62-0179-CTN</td>
			<td>preferred over non-stainless steel due to lower hardness</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stemflex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>AKA &#34;iPSC culture media&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile distilled water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 170 -&#160; Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DOWSIL 170 2LB KIT</td>
			<td>AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT</td>
			<td>AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature-controlled heated stage</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H401-HG-SMU</td>
			<td>Set height to 10 cm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermoplastic 3D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>Ultimaker 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Selleck Chem</td>
			<td>S1459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan Blue</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art Parts</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Mini Band Saw</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Variable Speed Miniature Drill Press</td>
			<td>Micro-Mark</td>
			<td>82959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibration Isolation Table</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>3618000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Weighing Boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Talon Cylinder Bench Clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97035-528</td>
			<td>AKA screw clamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing a bioreactor to improve data acquisition and model throughput of engineered cardiac tissues

Hjärtsvikt är fortfarande den vanligaste dödsorsaken i världen, vilket skapar ett stort behov av bättre prekliniska modeller av det mänskliga hjärtat. Vävnadsteknik är avgörande för grundvetenskaplig hjärtforskning; In vitro human cellodling eliminerar skillnaderna mellan arterna i djurmodeller, medan en mer vävnadsliknande 3D-miljö (t.ex. med extracellulär matris och heterocellulär koppling) simulerar in vivo-förhållanden i större utsträckning än traditionell tvådimensionell odling på petriskålar av plast. Varje modellsystem kräver dock specialutrustning, till exempel specialdesignade bioreaktorer och funktionsbedömningsenheter. Dessutom är dessa protokoll ofta komplicerade, arbetsintensiva och plågas av att de små, ömtåliga vävnaderna misslyckas.
Denna artikel beskriver en process för att generera ett robust humant konstruerat hjärtvävnadsmodellsystem (hECT) med hjälp av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter för longitudinell mätning av vävnadsfunktion. Sex hECT:er med linjär bandgeometri odlas parallellt, där varje hECT är upphängd i ett par kraftavkännande polydimetylsiloxanstolpar (PDMS) fästa vid PDMS-rack. Varje inlägg är täckt med en svart PDMS stabil postspårare (SPoT), en ny funktion som förbättrar användarvänligheten, genomströmningen, vävnadsretentionen och datakvaliteten. Formen möjliggör tillförlitlig optisk spårning av stolpavböjningar, vilket ger förbättrade ryckkraftsspårningar med absolut aktiv och passiv spänning. Kapsylgeometrin eliminerar vävnadsfel på grund av att hECT:er glider av stolparna, och eftersom de involverar ett andra steg efter PDMS-racktillverkning kan SPoTs läggas till befintliga PDMS-efterbaserade konstruktioner utan större förändringar i bioreaktortillverkningsprocessen.
Systemet används för att demonstrera vikten av att mäta hECT-funktionen vid fysiologiska temperaturer och visar stabil vävnadsfunktion under datainsamlingen. Sammanfattningsvis beskriver vi ett state-of-the-art modellsystem som reproducerar viktiga fysiologiska förhållanden för att främja biotrohet, effektivitet och noggrannhet hos konstruerad hjärtvävnad för in vitro-applikationer .

Enligt ovanstående protokoll genererades kardiomyocyter från en frisk iPSC-linje som tidigare använts av vår grupp 9,15 och tillverkades till hECT efter 8-61 dagar i odling. Figur 9A visar representativa bilder av hECT:er sedda nedifrån, som skapades utan (överst) och med (nederst) SPoTs. Funktionella mätningar gjordes vid rumstemperatur (23 °C) och vid fysiologisk temperatur (36 °C) mellan 37 dagar och 52 dagar efter hECT-t...

Watch this Scientific Journal Video about Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues at JoVE.com

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Tredimensionell hjärtvävnad som biokonstruerats med hjälp av stamcellshärledda kardiomyocyter har dykt upp som lovande modeller för att studera friskt och sjukt humant myokardium in vitro samtidigt som man rekapitulerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen. Detta manuskript beskriver ett protokoll för tillverkning och analys av högteknologisk hjärtvävnad genererad från humana inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter.

Designa en bioreaktor för att förbättra datainsamling och modellera genomströmning av konstruerad hjärtvävnad

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

Vår invitro-modell av tredimensionell stamcellshärledd mänsklig hjärtmuskel förbättrar biotroheten hos traditionell tvådimensionell cellkultur samtidigt som den eliminerar de skillnader mellan arter som är förknippade med laboratoriedjursförsök. Vår bioreaktordesign med flera vävnader och stabila postspårare maximerar vävnadsframgången och förbättrar noggrannheten för djupgående karakterisering av hjärtvävnadsfunktionen. Eftersom hjärtsvikt fortsätter att vara den främsta dödsorsaken över hela världen, gör våra konstruerade hjärtvävnader det möjligt för forskare att modellera mänskliga hjärtsjukdomar, samt screena potentiella terapier.Till att börja med, placera fyra negativa mastergjutningar i aluminium i gjuthållaren så att stolphålen är i linje med dödutrymmet mittemot triangelhyllorna. Placera apparaten mellan två parallella fästen och clamp ihop sidorna med en rektangulär bit av 0.5 millimeter tjock silikonplåt som packning för att förhindra läckage av vätskan PDMS. Blanda 0,5 milliliter PDMS-härdare med fem milliliter PDMS-elastomerbas i en grund behållare i förhållandet ett till 10 och rör om kraftigt i fem minuter.Avgasa PDMS-blandningen i en vakuumkammare under starkt vakuum tills bubblorna försvinner. Häll sedan PDMS-blandningen på gjutapparaten och överfyll för att säkerställa fullständig täckning av varje skåra. Lägg till små färgade glaspärlor på PDMS-rackens kropp mittemot sidan med stolparna för den unika identifieringen av varje rack.Placera gjutapparaten vågrätt i vakuumkammaren under starkt vakuum i minst 12 timmar. Låt PDMS härda i rumstemperatur borta från damm i 48 timmar för att möjliggöra fullständig härdning och maximal styrka hos de ömtåliga stolparna. Ta bort clamp, fästen och silikonplåt från gjutapparaten.Använd ett rakblad i rostfritt stål och klipp bort PDMS-filmen på toppen av gjutapparaten och ramstöden. Använd fingrarna för att separera PDMS-ställena från sidorna av gjuthållaren. Sätt in ett trubbigt rakblad i rostfritt stål i dödutrymmet mellan gjutningen och gjuthållaren och bänd isär dem, se till att PDMS som fyller dödutrymmet förblir med gjuthållaren.Använd sedan ett vasst blad i rostfritt stål för att skära bort de återstående PDMS-filmerna och PDMS:en med dödutrymme från stolparnas spetsar. Använd fingrarna för att långsamt separera PDMS-stället från gipset på sidan mittemot stolparna. Fortsätt att alternera sidor tills stolparna är fria från huvudkasten.Frigör alla PDMS-ställ och stolparna som tidigare visats och använd ett vasst rakblad för att trimma bort eventuellt kvarvarande överflödigt PDMS från racken. Använd en termoplastisk smält deponeringsmodellering 3D-skrivare, skriv ut komponenterna i den stabila postspåraren, eller SPoT, gjutningsapparaten. Säkerställ en säker presspassning mellan de 3D-utskrivna bitarna och mellan PDMS-racken och den treuddiga jiggen.Kontrollera också att PDMS-ställena passar tätt med stolparna som precis når botten av brunnarna utan att böjas. Blanda 0,5 milliliter svart PDMS del A till 0,5 milliliter del B i en liten våg eller en grund behållare tills lösningen är enhetlig i färgen. Avgasa den blandade svarta PDMS:en i en vakuumkammare under starkt vakuum i 20 minuter.Häll den avgasade svarta PDMS:en på den 3D-utskrivna basen för att fylla hålen och knacka för att säkerställa att inga bubblor finns kvar. Skrapa bort så mycket överflödig PDMS från basen som möjligt. Snäpp fast den treuddiga biten på basen och placera PDMS-ställen i spåren på den treuddiga jiggen, se till att ändarna på stolparna doppar i den svarta PDMS i de cirkulära brunnarna.Låt den svarta PDMS härda i rumstemperatur borta från damm i 48 timmar. Skjut ut den treuddiga delen, minimera spänningen på stolparna. Använd en liten pincett och skrapa bort den tunna svarta PDMS-filmen som omger varje SPoT och sätt sedan in den böjda pincetten med fin spets i SPoT-brunnen för att frigöra den från den 3D-utskrivna basen.Inspektera SPoTs och trimma eventuell kvarvarande svart PDMS-film från gjutningsprocessen med en fin vannas-sax. Se till att de färdiga stolparna har rätt längd genom att montera PDMS-ställena på polys-mobiltelefonramen och sedan skjuta detta på den svarta bottenplattan. Efter autoklavering av bioreaktorn och beredning av cellblandningen, fortsätt att tillverka hECT.Använd sterila handskar och ta bort den svarta bottenplattan från den autoklaverade påsen som innehåller bioreaktordelarna och placera den i en 60 ml-skål med brunnarna uppåt. Pipettera långsamt 44 mikroliter av cellblandningen i varje brunn för att undvika att införa bubblor. Bär ett nytt par sterila handskar och ta bort polysulfonramen med PDMS-ställen från autoklavpåsen.Sänk ner ramen på bottenplattan så att ramens ändar passar in i spåren i änden av bottenplattan. Se till att stolparna är raka och att ramen inte lutar, placera bioreaktorn i en 60 millimeters skål. Tillsätt en milliliter 10%FBS i kardiomyocytunderhållsmedium till 60 milliliterskålen för att öka luftfuktigheten när hECT:erna stelnar.Placera skålen utan lock i en 100-millimeters skål med hög profil och täck den med ett 100 millimeters skållock, sätt sedan tillbaka bioreaktorn till en 37 grader Celsius, 5 % koldioxidinkubator så att kollagenet kan bilda en gel med cellerna i suspension. Efter två timmar tar du ut skålen ur inkubatorn. Tillsätt 13 milliliter 10%FBS i kardiomyocytunderhållsmediet, luta skålen så att mediet kan flöda mellan PTFE-basplattan och PDMS-racken.Inspektera bioreaktorn från sidan för att se om det finns några luftbubblor och sätt tillbaka skålen i inkubatorn. Om luft fastnar, luta bioreaktorn ur mediet för att låta bubblan spricka och sänk den långsamt igen, eller använd en mikropipett med en gelladdningsspets för att suga upp luften utan att störa stolparna. Inspektera hECT-komprimeringen genom fönstret i ramen.Under 24 till 96 timmar komprimeras hECT:erna och blir ogenomskinliga. Ta bort bottenplattan när hECT:erna är komprimerade med minst 30 % jämfört med den ursprungliga diametern. Fyll 60 millimeterskålen som innehåller bioreaktorn med underhållsmedium för kardiomyocyter tills vätskan spolas med skålens kant och tillsätt 14 milliliter till en ny 60-millimetersskål.Medan du bär sterila handskar, vänd bioreaktorn i sin skål så att bottenplattan är ovanpå. Efter att ha inspekterat för instängda luftbubblor, lyft långsamt bottenplattan och håll den jämn. Se till att inläggstipsen är i fokus.Slå på tröskelomkopplaren och justera reglaget tills SPoTs är snyggt avgränsade och inte ändrar form när hECT drar ihop sig. Använd rektangelverktyget för att rita en rektangel runt en av SPoT:erna och klicka på knappen Ställ in en i rutan för inläggsgränser för att ställa in rektangelns position runt SPoT, så att SPoT alltid håller sig inom rektangelns gräns. Upprepa processen till det andra inlägget och spela in det under set två.Justera inställningarna för objektstorlek för att förhindra att programmet spårar mindre objekt och se till att antalet objekt som spåras i varje rektangel förblir konstant. Gränssnittet visar det uppmätta avståndet mellan de spårade objekten i realtid. Använd det här diagrammet för att övervaka bruset.Under stimuleringsfrekvensens hertz-rubrik anger du intervallet för önskade frekvenser och önskat intervall för stegning från min till max. I rutorna till höger väljer du önskad inställningstid för att låta hECT anpassa sig till den nya stimuleringsfrekvensen, ange sedan inspelningstid och stimuleringsspänning. Starta programmet genom att klicka på knappen starta program.Efter att data från en frekvens har spelats in, öka stimulatorfrekvensen med önskat intervall för en ny inspelning tills maxfrekvensen har uppnåtts. Representativa bilder av hECT:er visas här sett nedifrån, skapade utan SPoTs och med SPoTs. SPoTs tillhandahöll en enda definierad form att spåra under datainsamlingen.I vissa extrema fall var spårningsobjektet till och med dolt. En mer tillförlitlig form för optisk spårning och brusreducering gjorde det möjligt att mäta svaga vävnader med en utvecklad kraft så låg som en mikro Newton. SPoTs tillhandahöll en lockgeometri som förhindrade hECT-förlusten.Den uppmätta hECT-funktionen var stabil under förlängd odlingstid i den aktuella stimuleringsinställningen med den uppvärmda stage. Jämfört med mätningar vid fysiologisk temperatur visade hECT förändrad kontraktionsdynamik vid rumstemperatur, med långsammare kontraktions- och relaxationshastigheter. Vid högre frekvenser tenderade hECT att vara svagare vid rumstemperatur.Vid lägre frekvenser tenderade hECT:erna att vara starkare vid rumstemperatur. När tempot var 36 grader Celsius hade hECT:erna en högre spontan slagfrekvens och ett mer expansivt omfång av fångstfrekvenser. Den temperaturkontrollerade miljön säkerställer den fysiologiska relevansen av den uppmätta hECT-funktionen.Dessutom underlättar det delade mediebadet i bioreaktorn med flera vävnader studier av parakrin signalering mellan hECT av olika cellulära sammansättningar. Tillägget av SPoTs till vår bioreaktor med flera vävnader gör det möjligt för forskare att effektivt studera sjukt myokardium med onormalt hög eller låg spänning, som annars skulle glida av ändarna på otäckta stolpar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Drift av Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generation och Nagelvävnadstekniska Fartyg i en musmodell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Athymiska Rat modell för utvärdering av Engineered främre korsband Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiserad Contraction analys av Human Engineered hjärtvävnad för Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Sådd och Implantation av en biosyntetiska vävnadstekniska trakeal transplantat i en musmodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjärtelektrofysiologisk bedömning av dubbel spänning och kalciumoptisk kartläggning av mänskliga organotypiska hjärtskivor

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Beredning av Mesh-formade Engineered Hjärt vävnader som härrör från mänskliga iPS-celler för In Vivo hjärtinfarkt Reparation

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...