Name: addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00
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我们感谢图宾根大学医院骨科的骨科医生提供组织样本。

使用从德国图宾根大学医院接受全膝关节置换术的患者身上采集的股骨髁。本研究仅包括来自退行性和创伤后关节病变患者的关节软骨样本。在研究开始之前，已获得部门、机构和地方伦理委员会的批准（项目编号：674/2016BO2）。在参与之前，已收到所有患者的书面知情同意书。
注：图1中给出了按时间顺序排列的实验步骤的流程 图。
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作为一种进行性和多因素疾病，OA会引发关节软骨的结构和功能变化。在整个 OA 过程中，机械特征的损伤伴随着关节软骨表面的结构和生化变化27,31。OA中最早发生的病理事件是蛋白多糖耗竭伴胶原网络破坏32,33,34。这种早期的细微表面变化很难通过批量测试来精确定位和识别，因为?...

由于电子设备和系统的尺寸不断缩小，微纳基技术和装备的快速发展势头强劲。其中一种设备是原子力显微镜 （AFM），它可以扫描生物表面并在纳米和微米尺度上检索地形或生物力学信息1,2。在其广泛的功能中，该工具可以作为微压头和纳米压头操作，以获取有关各种生物系统的机械性能的信息3,4,5,6。数据是通过机械探针与表面的物理接触来收集的，机械探针的尖端可以小至约 1 nm7。然后根据悬臂尖端的压痕深度和施加在样品上的力8 显示样品的变形。
骨关节炎（OA）是一种长期退行性慢性疾病，其特征是关节和周围组织中的关节软骨恶化，这可能导致骨表面完全暴露。OA的负担是沉重的;目前，65岁及以上的女性中有一半和男性中有三分之一患有OA9。创伤、肥胖和由此导致的关节10 生物力学改变决定了关节软骨退化，这被视为常见的最终结果。Ganz 等人的开创性研究认为，OA 过程的早期步骤可能涉及软骨的生物力学特性11，从那时起，研究人员证实了这一假设12。同样，人们普遍认为，组织的生物力学特性在功能上是由超微结构组织以及细胞-细胞和细胞-基质串扰协调的。任何改变都会极大地影响整体组织的生物力学功能13。迄今为止，OA 诊断是临床诊断，并且基于平片 X 线照相14。这种方法是双面的：首先，缺乏明确的退行性临界阈值来制定 OA 的诊断，使得病情难以量化，其次，成像方法缺乏敏感性和标准化，无法检测局部软骨损伤15,16,17。为此，软骨机械性能的评估具有决定性的优势，即它描述了在OA过程中变化的参数，无论疾病的病因如何，并且在非常早期的阶段对组织功能有直接影响。压痕仪器测量组织抵抗压痕的力。事实上，这并不是一个新概念;最早的研究可以追溯到 1980 年代和 1990 年代。在此期间，大量研究表明，设计用于关节软骨关节镜测量的压痕仪器可能非常适合检测软骨的退行性变化。甚至在 30 年前，一些研究就能够证明压痕仪器能够通过在关节镜检查期间进行压缩刚度测量来检测组织变性过程中软骨表面的体内变化18,19,20。
关节软骨的 AFM 压痕 （AFM-IT） 提供有关组织的关键机械特性（即刚度）的信息。这是一个机械参数，描述了施加的无损载荷与缩进组织区域21的变形之间的关系。AFM-IT 已被证明能够量化宏观上未受影响的胶原网络中僵硬的年龄依赖性变化，从而区分与 OA 发病相关的病理变化（关节软骨外桥量表 0 级）22。我们之前已经证明，AFM-ITs基于空间软骨细胞组织作为早期软骨退行性变的基于图像的生物标志物，不仅可以量化，而且可以实际确定最早的退行性机械变化。这些发现已经得到其他人的证实 23,24.因此，AFM-IT是诊断和识别早期退行性变化的有趣工具。这些变化已经可以在细胞水平上测量，重塑对OA病理生理过程的理解。
在该协议中，我们展示了关节软骨外植体的完整组织学和生物力学分级程序，从天然软骨外植体制备到 AFM 数据采集和处理。通过循序渐进的方法，我们展示了如何通过二维大马赛克成像，然后进行微AFM压痕，根据变性的不同阶段对关节软骨组织进行生成、分级和视觉分类。
尽管目前，AFM-IT 是测量软骨生物力学变化的最灵敏的工具之一7，但与任何其他仪器技术一样，它具有局限性和实际特性25，可能导致错误的数据采集。为此，我们仔细研究了软骨外植体AFM测量过程中出现的最常见问题，并在可能的情况下描述了如何最大限度地减少或克服这些问题。这些因素包括样品的形貌方面和在与AFM兼容的环境中稳定它们的困难，组织表面的物理特性，以及在这些表面上进行AFM测量的困难。还给出了错误的力-距离曲线的示例，强调了可能导致它们的条件。还讨论了悬臂尖端几何形状固有的其他限制以及使用赫兹模型进行数据分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscop (AFM) head&#160;</td>
			<td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue&#160;</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>14948</td>
			<td>Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SAA-SPH-5UM</td>
			<td>Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115&#956;m, width nom: 40&#956;m,&#160; geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5&#956;m end radius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage ctting device&#160;</td>
			<td>Self-made&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the AFM</td>
			<td>The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany</td>
			<td>DFK 31BF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DFC3000G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotome</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>CM3050S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing Software for the AFM</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 5.0.86,&#160; can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope (Leica DMi8)</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass block cantiliver holder</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SP-90-05</td>
			<td>Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine&#160;</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium With DAPI</td>
			<td>ibidi GmbH, Gr&#228;felfing, Germany</td>
			<td>50011</td>
			<td>Mounting media with nuclear DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs&#160; side view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather Medical Products, Osaka, Japan</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Skirt</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent&#160; medium condensation in the AFM head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical program - SPSS</td>
			<td>IBM, Armonk, New York, USA</td>
			<td>SPSS Statistics 22</td>
			<td>Vesion 280.0.0.0 (190)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td>Water-soluble embedding medium&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants

毫无疑问，原子力显微镜（AFM）是目前评估生物领域微观甚至纳米线索的最强大和最有用的技术之一。然而，与任何其他微观方法一样，可能会出现方法学挑战。特别是，样品的特性、样品制备、仪器类型和压痕探头都可能导致不必要的伪影。在该协议中，我们举例说明了健康和骨关节炎关节软骨外植体的这些新问题。为此，我们首先通过分步方法展示如何 通过 整个组织外植体的大型 2D 镶嵌荧光成像，根据变性的不同阶段生成、分级和视觉分类离 体 关节软骨盘。 离体 模型的主要优势在于它由老化的、天然的、人类软骨组成，可以研究骨关节炎从早发到进展的相关变化。此外，还介绍了组织制备中的常见陷阱，以及实际的AFM程序以及随后的数据分析。我们展示了样品制备和处理、高级退化引起的形貌样品特性以及样品-尖端相互作用等基本但关键的步骤如何影响数据采集。我们还仔细研究了AFM中最常见的问题，并在可能的情况下描述了如何克服这些问题。了解这些局限性对于正确的数据采集、解释以及最终将研究结果嵌入到广泛的科学背景中至关重要。

使用自制的切割装置，我们能够从新鲜的人髁突中取出并生成小（4 mm x 1 mm）软骨盘，其中包含单细胞空间模式30，包括单串（SS，图2A），双串（DS），小簇（SC），大簇（BC;图2A）和漫反射（图2B）。具有代表性的软骨外植体如图3A所示。使用自上而下的荧光成像选择仅显示一种类型图案的?...

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Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

我们提出了一种循序渐进的方法来识别和解决与原子力显微镜微压痕相关的最常见问题。我们举例说明了以不同程度的骨关节炎驱动的变性为特征的天然人类关节软骨外植体的新问题。

基于原子力显微镜的人关节软骨外植体微压痕研究的实际问题

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

该协议的目的是创建一个体外模型，用于研究骨关节炎发病和进展期间关节软骨的机械性能。本技术的主要优点是软骨外植体易于生成，并且高度代表了天然年龄的软骨。该模型可用于在生物力学水平上分析和监测各种骨关节炎、诊断和治疗方法。首先，用手术刀将软骨从骨头上切开。使用活检打孔器，生成直径为四毫米的椎间盘。将光盘放在定制的切割设备上。使用刮刀固定并稳定软骨盘。用剃须刀片切割软骨盘。使用刮刀，收集圆盘并将其放入 1.5 毫升的管中。为了留在软骨样品中，向96孔板的每个孔中加入130微升细胞渗透性荧光染料，并将圆盘分布在板上，每孔一个圆盘。将96孔板放在荧光显微镜的板架上。选择合适的荧光滤光片和物镜。将物镜放置在含有单个软骨的预选孔下方。将焦点放在椎间盘上以查看细胞模式。选择导航器功能以获取整个油井的概览。使用鼠标左键并拖动它以导航到不同的舞台位置。选择包含要扫描的感兴趣区域的正方形。选择软件的焦点图点选项，然后通过左键单击其中心来选择每个单独的图块。在出现的窗口中选择选项焦点图，其中包含所有先前选择的图块。双击要显示的磁贴，并将其置于适当的焦点。接下来，单击设置 Z 以保存焦点计划并继续下一个磁贴。调整每个单独瓷砖的焦平面后，按开始扫描开始图像采集。通过在培养皿的顶部，底部，左侧和右侧添加足够的生物相容性胶，将每个预先选择的含有细胞图案的软骨盘固定在培养皿中。用不含 L-谷氨酰胺的 2.5 毫升 Leibovitz 培养基覆盖光盘。将培养皿放置在AFM设备样品架中。要校准悬臂梁，请将其放置在玻璃块悬臂的表面上，使其位于玻璃块中心的抛光光学平面上。使用步进电机功能以 100 微米的步长降低悬臂，直到它完全浸没在介质中。为了确定所需的软骨测量部位，在培养皿的干净无样品区域上用悬臂开始扫描仪方法。然后将悬臂缩回距离板底部 1.5 毫米处。从明场视图切换到荧光视图，并直观地识别光盘的顶部。将 AFM 样品架向圆盘中间移动 2 毫米。运行扫描仪方法以到达软骨盘的表面并将悬臂缩回 100 微米。要生成力距离曲线，请关注位于所需测量位置的单元。单击运行按钮开始测量，并在每个测量点上获取五条力距离曲线。检查曲线后保存曲线。要估计杨氏模量，请使用打开一批光谱曲线选项，打开生成的要分析的力距离曲线。选择赫兹拟合模型，然后选择弹性拟合选项。然后可视化并记录杨氏模量。使用 0.5 的泊松比和适当的悬臂尖端半径进行调整。然后目视检查力距曲线拟合，确保正确性。对于压痕深度的确定，在数据分析软件中打开每个生成的力距离曲线，并选择赫兹拟合模型作为分析过程。应用减去基线偏移选项将垂直偏转轴归零，然后选择偏移加倾斜功能。使用查找接触点功能自动识别接触点。使用垂直尖端位置功能，从压痕期间的原始压电陶瓷高度减去仅考虑悬臂挠度的距离。选择弹性拟合选项以显示处理的力距离曲线。然后选择图形的区域，使其与垂直尖端位置轴上的最大负值对齐。在 XMIN 框的参数选项卡中，读取并记录缩进。包含单根弦的椎间盘显示出更高的刚度值，中位数为 2.6 千帕斯卡，这代表了未妥协的健康软骨区域。随着骨关节炎的发生和进展，AFM测量显示，双串的硬度逐渐下降42%，小簇的硬度下降77%，最终在大簇代表的晚期阶段下降88%。包含漫反射图案的圆盘以高弹性显示，杨氏模量单个值有重要变化。对于所有具有指定主要细胞模式组织的软骨盘，发现与所采用的设定点相关的压痕深度与刚度成反比。在生成的力距离曲线中看到的伪影表明悬臂梁和软骨表面之间的接触不理想，或者样品与培养皿的固定不当。我们的软骨外植体可以使用各种分子生物学技术进行进一步加工和分析，例如通过eliza进行蛋白质分析、免疫标记、蛋白质免疫印迹修饰或通过PCR进行基因分析。这种方法可用于研究新疗法对关节软骨的直接影响，并可能有助于研究人员获得对骨关节炎的软脂肪机制的重要见解。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

原子力显微镜成像的细菌固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

科研

生物工程

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

重组DNA和蛋白质复合物，用原子力显微镜的可视化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

量化的内皮细胞糖复合物的力学性能，用原子力显微镜

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

使用原子力显微镜测量活细胞的力学性能

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

人体软骨组织制作采用三维喷墨打印技术

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

新型原子力显微镜基于生物淘选的形态特殊试剂对TDP-43变型肌萎缩侧索硬化症隔离

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

原子力显微镜成像和支持的脂质双层力谱

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D水凝胶支架的关节软骨细胞培养及软骨生成

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

实验和有限元议定书调查中性和带电溶质的跨关节软骨运输

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

全完整型小鼠软骨外种机械负荷对软骨细胞损伤的实时可视化与分析

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...