Name: addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants at JoVE.com

Wir danken den orthopädischen Chirurgen der Klinik für Orthopädische Chirurgie des Universitätsklinikums Tübingen für die Bereitstellung der Gewebeproben.

Es wurden Femurkondylen von Patienten verwendet, die sich am Universitätsklinikum Tübingen einer Knietotalendoprothetik unterzogen. In diese Studie wurden nur Gelenkknorpelproben von Patienten mit degenerativen und posttraumatischen Gelenkerkrankungen eingeschlossen. Vor Beginn der Studie wurde die Zustimmung der Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikkommission eingeholt (Projekt Nr. 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
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Als fortschreitende und multifaktorielle Erkrankung löst Arthrose strukturelle und funktionelle Veränderungen im Gelenkknorpel aus. Im Verlauf der Arthrose gehen Beeinträchtigungen der mechanischen Eigenschaften mit strukturellen und biochemischen Veränderungen an der Oberfläche des Gelenkknorpels einher27,31. Die frühesten pathologischen Ereignisse, die bei OA auftreten, sind die Erschöpfung von Proteoglykanen in Verbindung mit einer Störung des Kollagen...

Aufgrund der immer kleiner werdenden Größe elektronischer Geräte und Systeme hat die rasante Entwicklung von mikro- und nanobasierten Technologien und Geräten an Dynamik gewonnen. Ein solches Gerät ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM), die biologische Oberflächen scannen und topografische oder biomechanische Informationen sowohl im Nano- als auch im Mikrometerbereich abrufen kann 1,2. Zu seinen umfangreichen Funktionen gehört, dass dieses Werkzeug sowohl als Mikro- als auch als Nano-Eindringkörper betrieben werden kann, um Informationen über die mechanischen Eigenschaften verschiedener biologischer Systeme zu erhalten 3,4,5,6. Die Daten werden durch physischen Kontakt mit der Oberfläche durch eine mechanische Sonde gesammelt, die an ihrer Spitze7 nur etwa 1 nm betragen kann. Die resultierende Verformung der Probe wird dann basierend auf der Eindringtiefe der Cantilever-Spitze und der auf die Probe8 ausgeübten Kraft angezeigt.
Arthrose (OA) ist eine langfristige degenerative chronische Erkrankung, die durch eine Verschlechterung des Gelenkknorpels in den Gelenken und dem umliegenden Gewebe gekennzeichnet ist, was zu einer vollständigen Freilegung der Knochenoberflächen führen kann. Die Belastung durch Open Access ist erheblich; derzeit leidet die Hälfte aller Frauen und ein Drittel aller Männer ab 65 Jahren an OA9. Traumata, Fettleibigkeit und die daraus resultierende veränderte Biomechanik des Gelenks10 bestimmen die Degeneration des Gelenkknorpels, die als häufiges Endergebnis angesehen wird. Die bahnbrechende Studie von Ganz et al. postulierte, dass die frühen Schritte des OA-Prozesses die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels beinhalten könnten11, und seitdem haben Forscher diese Hypothese bestätigt12. Ebenso ist es allgemein anerkannt, dass die biomechanischen Eigenschaften des Gewebes funktionell durch die ultrastrukturelle Organisation sowie durch Zell-Zell- und Zell-Matrix-Übersprechen orchestriert werden. Jede Veränderung kann sich dramatisch auf die gesamte biomechanische Funktion des Gewebes auswirken13. Bisher ist die Arthrose-Diagnose klinisch und basiert auf der Röntgenaufnahme14. Dieser Ansatz hat zwei Seiten: Erstens erschwert das Fehlen einer definierten degenerativen Cut-off-Schwelle zur Formulierung der Diagnose Arthrose die Quantifizierung der Erkrankung, und zweitens mangelt es den bildgebenden Verfahren an Sensitivität und Standardisierung und sie können lokalisierte Knorpelschäden nicht erkennen15,16,17. Dazu hat die Beurteilung der mechanischen Eigenschaften des Knorpels den entscheidenden Vorteil, dass sie einen Parameter beschreibt, der sich im Verlauf der Arthrose unabhängig von der Ätiologie der Erkrankung verändert und bereits in einem sehr frühen Stadium einen direkten Einfluss auf die Gewebefunktionalität hat. Eindringinstrumente messen die Kraft, mit der das Gewebe dem Einzug widersteht. Dies ist in der Tat kein neues Konzept; Die frühesten Studien stammen aus den 1980er und 1990er Jahren. In dieser Zeit deuteten zahlreiche Studien darauf hin, dass Eindringinstrumente, die für die arthroskopischen Messungen von Gelenkknorpel konzipiert sind, gut geeignet sein könnten, degenerative Veränderungen des Knorpels zu erkennen. Bereits vor 30 Jahren konnten einige Studien zeigen, dass Indentationsinstrumente in der Lage sind, in vivo Veränderungen der Knorpeloberfläche während der Gewebedegeneration durch Drucksteifigkeitsmessungen während der Arthroskopie zu erkennen18,19,20.
Die AFM-Einkerbung (AFM-IT) des Gelenkknorpels gibt Aufschluss über eine zentrale mechanische Eigenschaft des Gewebes, nämlich die Steifigkeit. Hierbei handelt es sich um einen mechanischen Parameter, der den Zusammenhang zwischen einer aufgebrachten, zerstörungsfreien Belastung und der daraus resultierenden Verformung des eingedrückten Gewebebereichs21 beschreibt. Es hat sich gezeigt, dass AFM-IT in der Lage ist, altersabhängige Veränderungen der Steifigkeit in makroskopisch nicht beeinflussten Kollagennetzwerken zu quantifizieren und somit zwischen den pathologischen Veränderungen zu unterscheiden, die mit dem Ausbruch von Arthrose verbunden sind (Grad 0 auf der Outerbridge-Skala im Gelenkknorpel)22. Wir haben bereits gezeigt, dass AFM-ITs auf der Grundlage der räumlichen Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die frühe Knorpeldegeneration es ermöglichen, die frühesten degenerativen mechanischen Veränderungen nicht nur zu quantifizieren, sondern auch tatsächlich zu lokalisieren. Diese Befunde wurden bereits von anderen bestätigt23,24. Daher ist AFM-IT ein interessantes Werkzeug, um frühe degenerative Veränderungen zu diagnostizieren und zu identifizieren. Diese Veränderungen können bereits auf zellulärer Ebene gemessen werden, was das Verständnis des pathophysiologischen Prozesses der Arthrose verändert.
In diesem Protokoll demonstrieren wir ein vollständiges histologisches und biomechanisches Grading-Verfahren von Gelenkknorpel-Explantaten, von der nativen Knorpel-Explantat-Präparation bis hin zur AFM-Datenerfassung und -verarbeitung. Anhand eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes zeigen wir, wie Gelenkknorpelgewebe nach verschiedenen Stadien der Degeneration mit Hilfe von 2D-Bildgebung mit großem Mosaik, gefolgt von Mikro-AFM-Eindrücken, generiert, klassifiziert und visuell klassifiziert werden kann.
Auch wenn die AFM-IT derzeit eines der empfindlichsten Werkzeuge zur Messung biomechanischer Veränderungen im Knorpel ist7, wie jede andere instrumentelle Technik, hat sie Einschränkungen und praktische Besonderheiten25, die zu einer fehlerhaften Datenerfassung führen können. Zu diesem Zweck nehmen wir die häufigsten Probleme, die bei AFM-Messungen der Knorpelexplantate auftreten, unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie diese minimiert oder überwunden werden können. Dazu gehören topographische Aspekte der Proben und die Schwierigkeiten, sie in einer AFM-kompatiblen Umgebung zu stabilisieren, physikalische Besonderheiten der Gewebeoberfläche und die daraus resultierenden Schwierigkeiten bei der Durchführung von AFM-Messungen auf solchen Oberflächen. Es werden auch Beispiele für fehlerhafte Kraft-Weg-Kurven vorgestellt, wobei die Bedingungen hervorgehoben werden, die sie verursachen können. Weitere Einschränkungen, die sich aus der Geometrie der Kragarmspitze und der Verwendung des Hertz-Modells für die Datenanalyse ergeben, werden ebenfalls diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscop (AFM) head&#160;</td>
			<td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue&#160;</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>14948</td>
			<td>Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SAA-SPH-5UM</td>
			<td>Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115&#956;m, width nom: 40&#956;m,&#160; geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5&#956;m end radius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage ctting device&#160;</td>
			<td>Self-made&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the AFM</td>
			<td>The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany</td>
			<td>DFK 31BF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DFC3000G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotome</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>CM3050S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing Software for the AFM</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 5.0.86,&#160; can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope (Leica DMi8)</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass block cantiliver holder</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SP-90-05</td>
			<td>Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine&#160;</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium With DAPI</td>
			<td>ibidi GmbH, Gr&#228;felfing, Germany</td>
			<td>50011</td>
			<td>Mounting media with nuclear DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs&#160; side view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather Medical Products, Osaka, Japan</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Skirt</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent&#160; medium condensation in the AFM head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical program - SPSS</td>
			<td>IBM, Armonk, New York, USA</td>
			<td>SPSS Statistics 22</td>
			<td>Vesion 280.0.0.0 (190)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td>Water-soluble embedding medium&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants

Ohne Zweifel ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) derzeit eine der leistungsfähigsten und nützlichsten Techniken zur Beurteilung von Mikro- und sogar Nanosignalen im biologischen Bereich. Wie bei jedem anderen mikroskopischen Ansatz können jedoch methodische Herausforderungen auftreten. Insbesondere die Eigenschaften der Probe, der Probenvorbereitung, des Gerätetyps und der Eindringsonde können zu unerwünschten Artefakten führen. In diesem Protokoll veranschaulichen wir diese aufkommenden Probleme sowohl an gesunden als auch an osteoarthritischen Gelenkknorpelexplantaten. Zu diesem Zweck zeigen wir zunächst Schritt für Schritt, wie ex vivo Gelenkknorpelscheiben nach verschiedenen Degenerationsstadien mittels großer 2D-Mosaikfluoreszenz-Bildgebung der gesamten Gewebeexplantate erzeugt, klassifiziert und visuell klassifiziert werden können. Die große Stärke des Ex-vivo-Modells besteht darin, dass es aus gealtertem, nativem, menschlichem Knorpel besteht, der es ermöglicht, arthrosebedingte Veränderungen vom frühen Beginn bis zur Progression zu untersuchen. Darüber hinaus werden auch häufige Fallstricke bei der Gewebepräparation sowie das eigentliche AFM-Verfahren zusammen mit der anschließenden Datenanalyse vorgestellt. Wir zeigen, wie sich grundlegende, aber entscheidende Schritte wie die Probenvorbereitung und -verarbeitung, topografische Probeneigenschaften, die durch fortgeschrittene Degeneration verursacht werden, und die Interaktion zwischen Probe und Spitze auf die Datenerfassung auswirken können. Wir nehmen auch die häufigsten Probleme in der AFM unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie sie überwunden werden können. Die Kenntnis dieser Grenzen ist von größter Bedeutung für die korrekte Datenerfassung, Interpretation und letztlich die Einbettung der Ergebnisse in einen breiten wissenschaftlichen Kontext.

Mit Hilfe eines selbstgebauten Schneidegeräts konnten wir kleine (4 mm x 1 mm) Knorpelscheiben aus frischen menschlichen Kondylen explantieren und erzeugen, die ein einzelnes zelluläres Raummuster30 aus einzelnen Strängen (SS, Abbildung 2A), Doppelsträngen (DS), kleinen Clustern (SC), großen Clustern (BC; Abbildung 2A) und diffus (Abbildung 2B). Ein repräsentatives Knorpelexplantat ist in <strong class=...

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Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Wir stellen einen Schritt-für-Schritt-Ansatz vor, um die häufigsten Probleme im Zusammenhang mit Mikroeindrücken in der Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren und anzugehen. Wir veranschaulichen die aufkommenden Probleme an nativen menschlichen Gelenkknorpelexplantaten, die durch verschiedene Grade der Arthrose-bedingten Degeneration gekennzeichnet sind.

Auseinandersetzung mit praktischen Fragen der Rasterkraftmikroskopie-basierten Mikroeindringung an menschlichen Gelenkknorpelexplantaten

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

Das Ziel dieses Protokolls war es, ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Gelenkknorpel während des Beginns und des Fortschreitens von Arthrose zu erstellen. Der Hauptvorteil der vorliegenden Technik besteht darin, dass die Knorpelexplantate leicht zu erzeugen sind und in hohem Maße repräsentativ für den Knorpel des nativen Alters sind. Mit diesem Modell können verschiedene Arthrose-, Diagnose- und Therapieansätze auf biomechanischer Ebene analysiert und überwacht werden.Zu Beginn schneidest du den Knorpel mit einem Skalpell vom Knochen weg. Erzeugen Sie mit einer Biopsiestanze Scheiben mit einem Durchmesser von vier Millimetern. Legen Sie die Scheibe auf ein speziell angefertigtes Schneidegerät.Fixieren und stabilisieren Sie die Knorpelscheibe mit einem Spatel. Schneiden Sie die Knorpelscheibe mit einer Rasierklinge auf. Sammeln Sie die Scheibe mit einem Spatel und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Um in den Knorpelproben zu bleiben, geben Sie 130 Mikroliter zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoff in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und verteilen Sie die Scheibe auf der Platte als eine Scheibe pro Well. Platzieren Sie die 96-Well-Platte auf dem Plattenhalter des Fluoreszenzmikroskops. Wählen Sie den passenden Fluoreszenzfilter und das Objektiv aus.Positionieren Sie das Objektiv unter der vorausgewählten Vertiefung, die den einzelnen Knorpel enthält. Fokussieren Sie sich auf die Scheibe, um das Zellmuster zu erkennen. Wählen Sie die Navigator-Funktion, um einen Überblick über das gesamte Well zu erhalten.Verwenden Sie die linke Maustaste und ziehen Sie sie, um zu einer anderen Bühnenposition zu navigieren. Wählen Sie ein Quadrat aus, das den zu scannenden Interessenbereich umfasst. Wählen Sie die Fokus-Map-Option der Software aus und wählen Sie dann jede einzelne Kachel aus, indem Sie mit der linken Maustaste in die Mitte klicken.Wählen Sie im angezeigten Fenster die Option Fokuskarte mit allen zuvor ausgewählten Kacheln aus. Doppelklicken Sie auf eine Kachel, um sie anzuzeigen und in den richtigen Fokus zu bringen. Klicken Sie anschließend auf Z festlegen, um den Fokusplan zu speichern und mit der nächsten Kachel fortzufahren.Nachdem Sie den Fokusplan für jede einzelne Kachel angepasst haben, starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf Scan starten drücken. Fixieren Sie jede vorausgewählte Knorpelscheibe mit einem Zellmuster in Petrischale, indem Sie ausreichend biokompatiblen Kleber auf die obere, untere, linke und rechte Seite der Scheibe auftragen. Bedecken Sie die Scheiben mit 2,5 Milliliter Leibovitz-Medium ohne L-Glutamin.Positionieren Sie die Petrischale im Probenhalter des AFM-Geräts. Um den AFM-Cantilever zu kalibrieren, platzieren Sie ihn auf der Oberfläche des Glasbaustein-Cantilevers, so dass er auf der polierten optischen Ebene in der Mitte des Glasblocks aufliegt. Senken Sie den Ausleger mit der Schrittmotorfunktion in 100-Mikrometer-Schritten ab, bis er vollständig in das Medium eingetaucht ist.Um die gewünschte Knorpelmessstelle zu identifizieren, starten Sie einen Scanneransatz mit dem Cantilever auf einem sauberen, probenfreien Bereich der Petrischale. Ziehen Sie dann den Ausleger 1,5 Millimeter vom Boden der Platte entfernt ein. Wechseln Sie von der Hellfeld- zur Fluoreszenzansicht und identifizieren Sie visuell die Oberseite der Scheibe.Bewegen Sie den AFM-Probenhalter genau zwei Millimeter in Richtung Mitte der Scheibe. Führen Sie einen Scanneransatz durch, um die Oberfläche der Knorpelscheibe zu erreichen, und ziehen Sie den Ausleger um 100 Mikrometer zurück. Um eine Kraft-Weg-Kurve zu erzeugen, konzentrieren Sie sich auf die Zellen, die sich an der gewünschten Messstelle befinden.Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", um die Messungen zu starten und fünf Kraft-Abstands-Kurven an jeder Messstelle zu erfassen. Speichern Sie die Kurven, sobald sie inspiziert wurden. Um die Elastizitätsmodule von Young zu schätzen, öffnen Sie mit der Option "Stapel von Spektroskopiekurven öffnen" die generierten Kraft-Weg-Kurven, die analysiert werden sollen.Wählen Sie das Hertz-Fit-Modell und anschließend die Elastizitätsanpassungsoption. Visualisieren und dokumentieren Sie dann den Elastizitätsmodul. Passen Sie sich mit dem Poisson-Verhältnis von 0,5 und dem entsprechenden Auslegerspitzenradius an.Überprüfen Sie dann visuell die Passung der Kraft-Weg-Kurve, um die Richtigkeit sicherzustellen. Für die Bestimmung der Eindringtiefe öffnen Sie jede der generierten Kraft-Weg-Kurven in der Datenanalysesoftware und wählen das Hertz-Fit-Modell als Analyseprozess aus. Wenden Sie die Option Basislinienversatz subtrahieren an, um die vertikale Durchbiegungsachse auf Null zu setzen, und wählen Sie die Funktion Versatz plus Neigung aus.Verwenden Sie die Funktion "Kontaktpunkt suchen", um die Kontaktstelle automatisch zu identifizieren. Subtrahieren Sie mit der Funktion "Vertikale Spitzenposition" den Abstand, wobei nur die Auslenkung des Auslegers von der rohen Piezohöhe während des Eindrucks berücksichtigt wird. Wählen Sie die Option Elastizitätsanpassung aus, um die verarbeitete Kraft-Abstands-Kurve anzuzeigen.Wählen Sie dann den Bereich des Diagramms so aus, dass er mit dem negativsten Wert auf der vertikalen Spitzenpositionsachse übereinstimmt. Lesen und dokumentieren Sie auf der Registerkarte Parameter im Feld XMIN den Einzug. Die Bandscheiben mit den einzelnen Saiten wiesen mit einem Median von 2,6 Kilopascal höhere Steifigkeitswerte auf, was repräsentativ für unbeeinträchtigte, gesunde Knorpelbereiche ist.Mit Beginn und Fortschreiten der Arthrose zeigten die AFM-Messungen eine starke schrittweise Abnahme der Steifigkeit um 42 % bei Doppelsaiten, 77 % bei kleinen Clustern und schließlich 88 % in fortgeschrittenen Stadien, die durch große Cluster dargestellt werden. Die Scheiben, die ein diffuses Muster enthielten, zeigten eine erhöhte Elastizität mit einer signifikanten Variation der Einzelwerte des Elastizitätsmoduls. Für alle Knorpelscheiben mit zugeordneter vorherrschender zellulärer Musterorganisation wurde festgestellt, dass die mit dem verwendeten Sollwert assoziierte Eindringtiefe umgekehrt proportional zur Steifigkeit ist.Die Artefakte in den generierten Kraft-Distanz-Kurven deuten entweder auf einen suboptimalen Kontakt zwischen dem AFM-Cantilever und der Knorpeloberfläche oder auf eine unsachgemäße Fixierung der Probe an der Petrischale hin. Unsere Knorpelexplantate können mit einer Vielzahl molekularbiologischer Techniken weiterverarbeitet und analysiert werden, wie z.B. Proteinanalyse mittels Eliza, Immuno-Labeling, Western Moding oder Genanalyse mittels PCR. Diese Methode kann verwendet werden, um die direkten Auswirkungen neuer Therapien auf den Gelenkknorpel zu untersuchen und den Forschern zu helfen, wichtige Einblicke in die Potommechanismen der Arthrose zu gewinnen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Eine experimentelle und Finite-Elemente-Protokoll den Transport von neutralen und geladenen gelösten Stoffen durch Gelenkknorpel zur Untersuchung

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Echtzeit-Visualisierung und Analyse der Knorpelzelltransplantation Verletzungen aufgrund der mechanischen Belastung in völlig intakt murinen Knorpel Explantaten

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...