Name: addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants at JoVE.com

Agradecemos aos cirurgiões ortopédicos do Departamento de Cirurgia Ortopédica do Hospital Universitário de Tuebingen pelo fornecimento das amostras de tecido.

Foram utilizados côndilos femorais coletados de pacientes submetidos à artroplastia total do joelho no Hospital Universitário de Tübingen, Alemanha. Apenas amostras de cartilagem articular de pacientes com patologias articulares degenerativas e pós-traumáticas foram incluídas neste estudo. Antes do início do estudo, foram obtidas aprovações departamentais, institucionais e de comitês de ética locais (Projeto nº 674/2016BO2). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da p...

Como doença progressiva e multifatorial, a OA desencadeia alterações estruturais e funcionais da cartilagem articular. Ao longo do curso da OA, o comprometimento das características mecânicas é acompanhado por alterações estruturais e bioquímicas na superfície da cartilagem articular 27,31. Os eventos patológicos mais precoces que ocorrem na OA são a depleção de proteoglicanos associada à ruptura da rede de colágeno32,33,34...

Devido ao tamanho cada vez menor dos dispositivos e sistemas eletrônicos, o rápido desenvolvimento de tecnologia e equipamentos baseados em micro e nano ganhou impulso. Um desses dispositivos é a microscopia de força atômica (AFM), que pode escanear superfícies biológicas e recuperar informações topográficas ou biomecânicas em escalas nano e micrométricas 1,2. Dentre suas vastas características, essa ferramenta pode ser operada tanto como micro quanto como nano-indenter para obter informações sobre as propriedades mecânicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6. Os dados são coletados pelo contato físico com a superfície através de uma sonda mecânica, que pode ser tão pequena quanto cerca de 1 nm em sua ponta7. A deformação resultante da amostra é então exibida com base na profundidade de indentação da ponta do cantilever e na força aplicada na amostra8.
A osteoartrite (OA) é uma doença crônica degenerativa de longa duração caracterizada pela deterioração da cartilagem articular nas articulações e tecidos circundantes, que pode levar à exposição completa das superfícies ósseas. O peso dos AT é substancial; atualmente, metade das mulheres e um terço de todos os homens com 65 anos ou mais sofrem de OA9. Traumas, obesidade e a consequente alteração biomecânica da articulação10 determinam a degeneração da cartilagem articular, que é vista como um resultado final comum. O estudo pioneiro de Ganz e col. postula que os passos iniciais do processo de OA podem envolver as propriedades biomecânicas da cartilagem11 e, desde então, pesquisadores têm confirmado essa hipótese12. Da mesma forma, é geralmente aceito que as propriedades biomecânicas do tecido são funcionalmente orquestradas pela organização ultraestrutural, bem como pelo crosstalk célula-célula e célula-matriz. Qualquer alteração pode afetar drasticamente o funcionamento biomecânico tecidual como um todo13. Até o momento, o diagnóstico da OA é clínico e baseado em radiografias simples14. Essa abordagem é bilateral: em primeiro lugar, a falta de um limiar de corte degenerativo definido para formular o diagnóstico de OA torna a condição difícil de quantificar e, em segundo lugar, os métodos de imagem carecem de sensibilidade e padronização e não conseguem detectar dano localizado da cartilagem15,16,17. Para tanto, a avaliação das propriedades mecânicas da cartilagem tem a vantagem decisiva de descrever um parâmetro que se modifica durante o curso da OA, independentemente da etiologia da doença, e tem influência direta na funcionalidade tecidual em estágio muito precoce. Os instrumentos de indentação medem a força pela qual o tecido resiste à indentação. Este não é, de facto, um conceito novo; Os primeiros estudos datam das décadas de 1980 e 1990. Nesse período, numerosos estudos sugeriram que instrumentos de indentação projetados para as medidas artroscópicas da cartilagem articular poderiam ser bem adequados para detectar alterações degenerativas na cartilagem. Há 30 anos, alguns estudos conseguiram demonstrar que instrumentos de indentação eram capazes de detectar in vivo alterações na superfície da cartilagem durante a degeneração tecidual, realizando medidas de rigidez compressiva durante a artroscopia18,19,20.
A indentação de AFM (AFM-IT) da cartilagem articular fornece informações sobre uma propriedade mecânica fundamental do tecido, a rigidez. Trata-se de um parâmetro mecânico que descreve a relação entre uma carga aplicada não destrutiva e a deformação resultante da área de tecido recuada21. O AMO-TI mostrou-se capaz de quantificar modificações idade-dependentes na rigidez em redes de colágeno macroscopicamente não afetadas, diferenciando as alterações patológicas associadas ao aparecimento da OA (grau 0 na escala de Outerbridge na cartilagem articular)22. Nós mostramos anteriormente que AFM-ITs, com base na organização espacial dos condrócitos como um biomarcador baseado em imagem para a degeneração precoce da cartilagem, permitem não apenas quantificar, mas também identificar as alterações mecânicas degenerativas mais precoces. Esses achados já foram confirmados por outros23,24. Assim, o AFM-IT atua como uma ferramenta interessante para diagnosticar e identificar alterações degenerativas precoces. Essas alterações já podem ser medidas em nível celular, remodelando a compreensão do processo fisiopatológico da OA.
Neste protocolo, demonstramos um completo procedimento de graduação histológica e biomecânica dos explantes da cartilagem articular, desde o preparo dos explantes da cartilagem nativa até a aquisição e processamento dos dados de MFA. Através de uma abordagem passo a passo, mostramos como gerar, graduar e classificar visualmente o tecido cartilaginoso articular de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens 2D de mosaico grande, seguidas de micro-AFM.
Embora atualmente o AFM-IT seja uma das ferramentas mais sensíveis para mensurar alterações biomecânicas nacartilagem7, como qualquer outra técnica instrumental, apresenta limitações e peculiaridadespráticas25 que podem levar à aquisição errônea de dados. Para tanto, submetemos ao exame os problemas mais comuns que surgem durante as medidas de MFA dos explantes cartilaginosos e descrevemos, sempre que possível, como minimizá-los ou superá-los. Estes incluem aspectos topográficos das amostras e as dificuldades para estabilizá-las em um ambiente compatível com AFM, peculiaridades físicas da superfície do tecido e as dificuldades resultantes na realização de medidas de AFM nessas superfícies. Exemplos de curvas força-distância errôneas também são apresentados, enfatizando as condições que podem ocasioná-las. Limitações adicionais inerentes à geometria da ponta do cantilever e ao uso do modelo de Hertz para a análise dos dados também são discutidas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscop (AFM) head&#160;</td>
			<td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue&#160;</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>14948</td>
			<td>Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SAA-SPH-5UM</td>
			<td>Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115&#956;m, width nom: 40&#956;m,&#160; geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5&#956;m end radius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage ctting device&#160;</td>
			<td>Self-made&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the AFM</td>
			<td>The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany</td>
			<td>DFK 31BF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DFC3000G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotome</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>CM3050S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing Software for the AFM</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 5.0.86,&#160; can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope (Leica DMi8)</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass block cantiliver holder</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SP-90-05</td>
			<td>Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine&#160;</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium With DAPI</td>
			<td>ibidi GmbH, Gr&#228;felfing, Germany</td>
			<td>50011</td>
			<td>Mounting media with nuclear DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs&#160; side view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather Medical Products, Osaka, Japan</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Skirt</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent&#160; medium condensation in the AFM head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical program - SPSS</td>
			<td>IBM, Armonk, New York, USA</td>
			<td>SPSS Statistics 22</td>
			<td>Vesion 280.0.0.0 (190)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td>Water-soluble embedding medium&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants

Sem dúvida, a microscopia de força atômica (AFM) é atualmente uma das técnicas mais poderosas e úteis para avaliar micro e até mesmo nanopistas no campo biológico. No entanto, como em qualquer outra abordagem microscópica, desafios metodológicos podem surgir. Em particular, as características da amostra, a preparação da amostra, o tipo de instrumento e a sonda de recuo podem levar a artefatos indesejados. Neste protocolo, exemplificamos essas questões emergentes em explantes de cartilagem articular saudável e osteoartrítica. Para isso, primeiramente mostramos, por meio de uma abordagem passo a passo, como gerar, graduar e classificar visualmente discos de cartilagem articular ex vivo de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens de fluorescência em mosaico 2D de todo o tecido explante. A maior força do modelo ex vivo é que ele compreende cartilagem humana envelhecida, nativa, que permite a investigação de alterações relacionadas à osteoartrite desde o início precoce até a progressão. Além disso, armadilhas comuns na preparação tecidual, bem como o procedimento real de AFM juntamente com a análise subsequente dos dados, também são apresentados. Mostramos como etapas básicas, mas cruciais, como preparação e processamento de amostras, características topográficas de amostras causadas por degeneração avançada e interação amostra-ponta podem afetar a aquisição de dados. Também submetemos ao escrutínio os problemas mais comuns no AFM e descrevemos, sempre que possível, como superá-los. O conhecimento dessas limitações é de extrema importância para a correta aquisição, interpretação e, em última análise, incorporação dos achados em um amplo contexto científico.

Usando um dispositivo de corte de fabricação própria, foi possível explantar e gerar discos de cartilagem pequenos (4 mm x 1 mm) a partir de côndilos humanos frescos contendo um padrão espacial celular único30 de cordas simples (SS, Figura 2A), cordas duplas (DS), pequenos aglomerados (SC), grandes aglomerados (BC; Figura 2A) e difusa (Figura 2B). Um explante representativo da cartilagem está represen...

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Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

O objetivo deste protocolo foi criar um modelo in vitro para o estudo das propriedades mecânicas da cartilagem articular durante o início e a progressão da osteoartrite. A principal vantagem da presente técnica é que os explantes cartilaginosos são de fácil geração e altamente representativos da cartilagem nativa da idade. Este modelo pode ser usado para analisar e monitorar várias abordagens osteoartrite, diagnósticas e terapêuticas no nível biomecânico.Para começar, corte a cartilagem longe do osso usando um bisturi. Usando um punch de biópsia, gere discos de quatro milímetros de diâmetro. Coloque o disco em um dispositivo de corte personalizado.Usando uma espátula, fixe e estabilize o disco de cartilagem. Corte o disco de cartilagem com uma lâmina de barbear. Usando uma espátula, colete o disco e coloque-o em um tubo de 1,5 mililitro.Para permanecer nas amostras de cartilagem, adicione 130 microlitros de corante de fluorescência permeável celular a cada poço da placa de 96 poços e distribua o disco na placa como um disco por poço. Coloque a placa de poço 96 no suporte da placa do microscópio de fluorescência. Selecione o filtro de fluorescência apropriado e o objetivo.Posicione a objetiva abaixo do poço pré-selecionado contendo cartilagem individual. Concentre-se no disco para ver o padrão celular. Selecione a função de navegador para obter uma visão geral de todo o poço.Use o botão esquerdo do mouse e arraste-o para navegar para uma posição de palco diferente. Selecione um quadrado que englobe a área de interesse a ser digitalizada. Selecione a opção de ponto do mapa de foco do software e, em seguida, selecione cada bloco individual clicando com o botão esquerdo do mouse no centro dele.Selecione o mapa de foco de opção na janela exibida com todos os blocos selecionados anteriormente. Clique duas vezes em um bloco para exibi-lo e colocá-lo em foco adequado. Em seguida, clique em definir Z para salvar o plano focal e prossiga para o próximo bloco.Depois de ajustar o plano focal para cada bloco individual, inicie a aquisição de imagem pressionando Start Scan. Fixe cada disco de cartilagem pré-selecionado contendo um padrão celular em placas de Petri adicionando cola biocompatível suficiente nos lados superior, inferior, esquerdo e direito do disco. Cubra os discos com 2,5 mililitros de meio Leibovitz sem L-glutamina.Posicione a placa de Petri no porta-amostras dos dispositivos AFM. Para calibrar o cantilever AFM, coloque-o na superfície do cantilever do bloco de vidro para que ele fique apoiado no plano óptico polido no centro do bloco de vidro. Abaixe o cantilever em passos de 100 micrômetros usando a função do motor de passo até que ele fique completamente submerso no meio.Para identificar o local de medição da cartilagem desejado, inicie uma abordagem de scanner com o cantilever em uma área livre de amostra limpa da placa de Petri. Em seguida, retraia o cantilever a 1,5 milímetros de distância do fundo da placa. Alterne da visualização de campo brilhante para a visualização de fluorescência e identifique visualmente a parte superior do disco.Mova o suporte de amostra AFM exatamente dois milímetros em direção ao meio do disco. Execute uma abordagem de scanner para alcançar a superfície do disco de cartilagem e retrair o cantilever em 100 micrômetros. Para gerar uma curva de distância de força, concentre-se nas células posicionadas no local de medição desejado.Clique no botão Executar para iniciar as medições e adquirir cinco curvas de distância de força em cada local de medição. Salve as curvas depois que elas forem inspecionadas. Para estimar os módulos de Young, usando a opção abrir um lote de curvas de espectroscopia, abra as curvas de distância de força geradas a serem analisadas.Selecione o modelo de ajuste Hertz seguido pela opção de ajuste de elasticidade. Em seguida, visualize e documente o módulo de Young. Adapte-se usando a razão de poisson de 0,5 e o raio apropriado da ponta do cantilever.Em seguida, verifique visualmente o ajuste da curva de distância de força para garantir a correção. Para a determinação da profundidade de indentação, abra cada uma das curvas de distância de força geradas no software de análise de dados e selecione o modelo de ajuste de Hertz como processo de análise. Aplique a opção de deslocamento da linha de base subtrair para zerar o eixo de deflexão vertical e selecione a função deslocamento mais inclinação.Use a função localizar ponto de contato para identificar automaticamente o ponto de contato. Usando a função de posição vertical da ponta, subtraia a distância que contabiliza apenas a deflexão do cantilever da altura bruta do piezo durante o recuo. Selecione a opção de ajuste de elasticidade para exibir a curva de distância de força processada.Em seguida, selecione a área do gráfico para que ele se alinhe com o valor mais negativo no eixo vertical da posição da ponta. Na guia de parâmetros da caixa XMIN, leia e documente o recuo. Os discos contendo cordas simples apresentaram maiores valores de rigidez, com mediana de 2,6 quilo pascals, o que é representativo de áreas de cartilagem sadias e não comprometidas.Com o início e a progressão da osteoartrite, as medidas de MFA mostraram uma forte diminuição gradual na rigidez de 42% em cordas duplas, 77% em pequenos agrupamentos e, finalmente, 88% em estágios avançados representados por grandes agrupamentos. Os discos contendo um padrão difuso apresentaram-se em elevada elasticidade com uma variação importante dos valores únicos do módulo de elasticidade de Young. Para todos os discos de cartilagem com organização do padrão celular predominante, a profundidade de indentação associada ao setpoint empregado mostrou-se inversamente proporcional à rigidez.Os artefatos observados nas curvas de distância de força geradas são indicativos de um contato subótimo entre o cantilever de AFM e a superfície da cartilagem ou fixação inadequada da amostra à placa de Petri. Nossos explantes de cartilagem podem ser processados e analisados usando uma variedade de técnicas biológicas moleculares, como análise de proteínas via eliza, imunomarcação, moding ocidental ou análise de geração via PCR. Este método pode ser usado para estudar o impacto direto de novas terapias sobre o cartilego articular e pode ajudar os pesquisadores a obter informações importantes sobre os mecanismos de potoma da osteoartrite.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...