Name: addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants at JoVE.com

Благодарим хирургов-ортопедов отделения ортопедической хирургии Университетской клиники Тюбингена за предоставленные образцы тканей.

Использовались мыщелки бедренной кости, собранные у пациентов, перенесших тотальное эндопротезирование коленного сустава в университетской клинике Тюбингена, Германия. В исследование были включены только образцы суставного хряща пациентов с дегенеративными и посттравматическими п...

Являясь прогрессирующим и многофакторным заболеванием, ОА вызывает структурные и функциональные изменения в суставном хряще. На протяжении всего течения ОА нарушения механических свойств сопровождаются структурными и биохимическими изменениями на поверхности суставного хряща<sup cla...

В связи с постоянно уменьшающимися размерами электронных устройств и систем набирает обороты стремительное развитие микро- и нанотехнологий и оборудования. Одним из таких устройств является атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая может сканировать биологические поверхности и извлекать топографическую или биомеханическую информацию как в нано-, так и в микрометровом масштабе 1,2. Среди его обширных возможностей можно отметить, что этот прибор может работать как в микро-, так и в нано-инденторе для получения информации о механических свойствах различных биологических систем 3,4,5,6. Данные собираются путем физического контакта с поверхностью с помощью механического зонда, который может иметь размер около 1 нм на конце7. Результирующая деформация образца затем отображается в зависимости от глубины вдавливания консольного наконечника и силы, приложенной к образцу8.
Остеоартроз (ОА) – это длительное дегенеративное хроническое заболевание, характеризующееся ухудшением состояния суставного хряща в суставах и окружающих тканей, что может привести к полному обнажению костных поверхностей. Бремя ОД является существенным; В настоящее время половина всех женщин и одна треть всех мужчин в возрасте 65 лет и старше страдают от ОА9. Травмы, ожирение и, как следствие, изменение биомеханики сустава10 определяют дегенерацию суставного хряща, которая рассматривается как общий конечный результат. Новаторское исследование Ganz et al. постулировало, что ранние стадии процесса ОА могут быть связаны с биомеханическими свойствами хряща11, и с тех пор исследователи подтвердили эту гипотезу12. Кроме того, принято считать, что биомеханические свойства ткани функционально управляются ультраструктурной организацией, а также перекрестными помехами между клетками и клетками-матриксами. Любые изменения могут существенно повлиять на общее биомеханическое функционирование тканей13. На сегодняшний день диагноз ОА носит клинический характер и основывается на рентгенографии на обычной пленке14. Этот подход является двусторонним: во-первых, отсутствие определенного дегенеративного порога отсечения для постановки диагноза ОА затрудняет количественную оценку этого состояния, и, во-вторых, методы визуализации не обладают достаточной чувствительностью и стандартизацией и не могут обнаружить локализованное повреждение хряща15,16,17. С этой целью оценка механических свойств хряща имеет решающее преимущество в том, что она описывает параметр, который изменяется в течение ОА независимо от этиологии заболевания и оказывает непосредственное влияние на функциональность тканей на самой ранней стадии. Инструменты для индентирования измеряют силу, с которой ткань сопротивляется вдавливанию. Это, на самом деле, не новая концепция; Самые ранние исследования датируются 1980-ми и 1990-ми годами. В этот период многочисленные исследования показали, что инструменты для индентирования, предназначенные для артроскопических измерений суставного хряща, могут быть хорошо приспособлены для обнаружения дегенеративных изменений в хряще. Еще 30 лет назад некоторые исследования смогли продемонстрировать, что инструменты для индентирования способны обнаруживать in vivo изменения поверхности хряща при дегенерации тканей путем проведения измерений компрессионной жесткости во время артроскопии18,19,20.
АСМ индентирование (АСМ-ИТ) суставного хряща дает информацию об основных механических свойствах ткани, а именно о жесткости. Это механический параметр, описывающий связь между приложенной неразрушающей нагрузкой и результирующей деформацией вдавленной областиткани 21. Было показано, что AFM-IT способна количественно оценивать возрастные изменения жесткости в макроскопически непораженных коллагеновых сетях, таким образом, дифференцировать патологические изменения, связанные с началом ОА (степень 0 по шкале Outerbridge в суставном хряще)22. Ранее мы показали, что АСМ-ИТ на основе пространственной организации хондроцитов в качестве биомаркера ранней дегенерации хряща на основе изображений позволяют не только количественно оценить, но и фактически точно определить самые ранние дегенеративные механические изменения. Эти выводы уже подтверждены другими23,24. Таким образом, AFM-IT выступает в качестве интересного инструмента для диагностики и выявления ранних дегенеративных изменений. Эти изменения уже могут быть измерены на клеточном уровне, что меняет понимание патофизиологического процесса ОА.
В этом протоколе мы демонстрируем полную процедуру гистологической и биомеханической классификации эксплантов суставного хряща, начиная с подготовки экплантов из нативного хряща и заканчивая сбором и обработкой данных АСМ. С помощью пошагового подхода мы показываем, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать суставную хрящевую ткань в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью 2D-визуализации большой мозаики с последующей микро-АСМ индентацией.
Несмотря на то, что в настоящее время АСМ-ИТ является одним из наиболее чувствительных инструментов для измерения биомеханических изменений в хряще7, как и любой другой инструментальный метод, он имеет ограничения и практические особенности25, которые могут привести к ошибочному получению данных. С этой целью мы тщательно рассмотрим наиболее распространенные проблемы, возникающие при АСМ измерениях хрящевых эксплантов, и опишем, где это возможно, способы их минимизации или преодоления. К ним относятся топографические аспекты образцов и трудности их стабилизации в АСМ-совместимой среде, физические особенности поверхности ткани и, как следствие, трудности при проведении АСМ измерений на таких поверхностях. Также приведены примеры ошибочных кривых зависимости силы от расстояния с акцентом на условия, которые могут их вызвать. Также обсуждаются дополнительные ограничения, присущие геометрии консольного наконечника и использованию модели Герца для анализа данных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscop (AFM) head&#160;</td>
			<td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue&#160;</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>14948</td>
			<td>Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SAA-SPH-5UM</td>
			<td>Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115&#956;m, width nom: 40&#956;m,&#160; geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5&#956;m end radius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage ctting device&#160;</td>
			<td>Self-made&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the AFM</td>
			<td>The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany</td>
			<td>DFK 31BF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DFC3000G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotome</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>CM3050S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing Software for the AFM</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 5.0.86,&#160; can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope (Leica DMi8)</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass block cantiliver holder</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SP-90-05</td>
			<td>Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine&#160;</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium With DAPI</td>
			<td>ibidi GmbH, Gr&#228;felfing, Germany</td>
			<td>50011</td>
			<td>Mounting media with nuclear DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs&#160; side view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather Medical Products, Osaka, Japan</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Skirt</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent&#160; medium condensation in the AFM head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical program - SPSS</td>
			<td>IBM, Armonk, New York, USA</td>
			<td>SPSS Statistics 22</td>
			<td>Vesion 280.0.0.0 (190)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td>Water-soluble embedding medium&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants

Без сомнения, атомно-силовая микроскопия (АСМ) в настоящее время является одним из самых мощных и полезных методов для оценки микро- и даже наносигналов в биологической области. Однако, как и в случае с любым другим микроскопическим подходом, могут возникнуть методологические проблемы. В частности, характеристики образца, пробоподготовки, тип прибора и датчик для индентирования могут привести к появлению нежелательных артефактов. В этом протоколе мы иллюстрируем эти возникающие проблемы на здоровых, а также на костно-артритных эксплантатах суставного хряща. С этой целью мы сначала покажем с помощью пошагового подхода, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать диски суставного хряща ex vivo в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью большой 2D-мозаичной флуоресцентной визуализации всей ткани. Основное преимущество модели ex vivo заключается в том, что она включает в себя старые, естественные хрящи человека, что позволяет исследовать изменения, связанные с остеоартритом, от раннего начала до прогрессирования. Кроме того, представлены общие подводные камни при подготовке тканей, а также сама процедура АСМ вместе с последующим анализом данных. Мы показываем, как основные, но важные этапы, такие как подготовка и обработка образцов, характеристики топографических образцов, вызванные прогрессирующей дегенерацией, и взаимодействие образца с наконечником образца, могут повлиять на сбор данных. Мы также тщательно изучаем наиболее распространенные проблемы в АСМ и описываем, где это возможно, способы их преодоления. Знание этих ограничений имеет первостепенное значение для правильного сбора данных, интерпретации и, в конечном счете, включения полученных результатов в широкий научный контекст.

Используя самодельное режущее устройство, мы смогли эксплантировать и получить небольшие (4 мм х 1 мм) хрящевые диски из свежих мыщелков человека, содержащих единый ячеистый пространственный паттерн30 одиночных нитей (SS, рис. 2A), двойных нитей (DS), малых класте?...

Watch this Scientific Journal Video about Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants at JoVE.com

Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Представлен пошаговый подход к выявлению и решению наиболее распространенных проблем, связанных с микровдавливаниями в атомно-силовой микроскопии. В качестве примера мы приводим возникающие проблемы на экплантах суставного хряща человека, характеризующихся различными степенями дегенерации, вызванной остеоартритом.

Решение практических вопросов микроиндентирования на основе атомно-силовой микроскопии на эксплантах суставного хряща человека

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

Целью данного протокола было создание модели in vitro для изучения механических свойств суставного хряща в период возникновения и прогрессирования остеоартроза. Основное преимущество данной методики заключается в том, что хрящевые экспланты легко генерируются и очень репрезентативны для хряща нативного возраста. Эта модель может быть использована для анализа и мониторинга различных остеоартрозных, диагностических и терапевтических подходов на биомеханическом уровне.Для начала отрежьте хрящ от кости с помощью скальпеля. С помощью биопсийного перфоратора сгенерируйте диски диаметром четыре миллиметра. Поместите диск на изготовленное по индивидуальному заказу режущее устройство.С помощью шпателя зафиксируйте и стабилизируйте хрящевой диск. Разрежьте хрящевой диск лезвием бритвы. С помощью шпателя соберите диск и поместите его в пробирку объемом 1,5 миллилитра.Чтобы остаться в образцах хряща, добавьте 130 микролитров проницаемого для клеток флуоресцентного красителя в каждую лунку 96-луночной пластины и распределите диск на пластине как один диск на лунку. Поместите планшет 96 лунок на держатель пластины флуоресцентного микроскопа. Выберите подходящий флуоресцентный фильтр и объектив.Поместите объектив под предварительно выбранную лунку, содержащую отдельные хрящи. Сосредоточьтесь на диске, чтобы увидеть клеточный рисунок. Выберите функцию навигатора, чтобы получить обзор всей скважины.Используйте левую кнопку мыши и перетащите ее, чтобы перейти в другую позицию. Выберите квадрат, охватывающий область интереса для сканирования. Выберите параметр точки карты фокусировки программного обеспечения, а затем выберите каждую отдельную плитку, щелкнув левой кнопкой мыши в ее центре.В появившемся окне выберите вариант карты фокусировки со всеми ранее выбранными плитками. Дважды щелкните плитку, чтобы отобразить ее и сфокусироваться. Затем нажмите кнопку Set Z, чтобы сохранить фокальный план, и перейдите к следующему фрагменту.После настройки фокального плана для каждой отдельной плитки начните получение изображения, нажав кнопку «Начать сканирование». Закрепите каждый предварительно выбранный хрящевой диск, содержащий клеточный рисунок, в чашках Петри, добавив достаточное количество биосовместимого клея на верхнюю, нижнюю, левую и правую стороны диска. Залейте диски 2,5 миллилитрами лейбовицкой среды без L-глютамина.Поместите чашку Петри в держатель образцов устройств АСМ. Чтобы откалибровать консоль АСМ, поместите ее на поверхность консоли стеклоблока так, чтобы она опиралась на полированную оптическую плоскость в центре стеклоблока. Опустите консоль с шагом 100 микрометров с помощью функции шагового двигателя до полного погружения в среду.Чтобы определить желаемое место измерения хряща, начните сканирование с помощью кантилевера на чистом участке чашки Петри, свободном от образцов. Затем отодвиньте консоль на 1,5 миллиметра от нижней части пластины. Переключитесь с яркого поля на флуоресцентный вид и визуально определите верхнюю часть диска.Сдвиньте держатель образца АСМ ровно на два миллиметра к середине диска. Запустите сканирование, чтобы добраться до поверхности хрящевого диска и втянуть кантилевер на 100 микрометров. Чтобы построить кривую силового расстояния, сфокусируйтесь на ячейках, расположенных в нужной точке измерения.Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать измерения и получить пять кривых силового расстояния в каждой точке измерения. Сохраняйте кривые после их проверки. Чтобы оценить модули Юнга, с помощью опции открыть пакет спектроскопических кривых откройте сгенерированные кривые силовых расстояний для анализа.Выберите модель с подгонкой по Герцу, а затем с подгонкой по эластичности. Затем визуализируйте и задокументируйте модуль Юнга. Адаптируйте, используя коэффициент Пуассона 0,5 и соответствующий радиус кончика кантилевера.Затем визуально проверьте подгонку кривой силового расстояния, чтобы убедиться в правильности. Для определения глубины вдавливания откройте каждую из сгенерированных кривых силового расстояния в программном обеспечении для анализа данных и выберите модель Hertz-fit в качестве процесса анализа. Примените параметр смещения базовой линии для обнуления оси вертикального отклонения и выберите функцию смещения плюс наклон.Используйте функцию поиска точки контакта для автоматического определения точки контакта. Используя функцию вертикального положения зонда, вычтите расстояние, учитывающее исключительно отклонение кантилевера, из необработанной высоты пьезо во время отступа. Выберите параметр эластичности, чтобы отобразить обработанную кривую расстояния по силе.Затем выделите область графика так, чтобы она совпала с самым отрицательным значением на вертикальной оси положения наконечника. На вкладке параметров в поле XMIN прочтите и задокументируйте отступ. Диски, содержащие одинарные струны, показали более высокие значения жесткости со средним значением 2,6 килопаскаля, что является репрезентативным для бескомпромиссных, здоровых участков хряща.С началом и прогрессированием остеоартроза измерения АСМ показали сильное ступенчатое снижение жесткости на 42% в двойных струнах, на 77% в небольших кластерах и, в конечном счете, на 88% в поздних стадиях, представленных большими кластерами. Диски, содержащие диффузный рисунок, демонстрируют повышенную упругость с важным изменением единичных значений модуля Юнга. Было обнаружено, что для всех хрящевых дисков с преобладающей организацией клеточного рисунка глубина вдавливания, связанная с используемой установкой, обратно пропорциональна жесткости.Артефакты, наблюдаемые на сгенерированных кривых силовых расстояний, указывают либо на неоптимальный контакт между кантилевером АСМ и поверхностью хряща, либо на неправильную фиксацию образца в чашке Петри. Наши хрящевые эксплантаты могут быть дополнительно обработаны и проанализированы с использованием различных молекулярно-биологических методов, таких как анализ белка с помощью ИФА, иммунометирование, вестерн-модинг или генный анализ с помощью ПЦР. Этот метод может быть использован для изучения прямого воздействия новых методов лечения на суставной хрящевый сустав и может помочь исследователям получить важные сведения о потомских механизмах остеоартрита.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Визуализация рекомбинантных ДНК и белковых комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Роман Атомно-силовая микроскопия на основе Биопэннинг для изоляции морфологии специфических реагентов против TDP-43 варианты, в амиотрофического латерального склероза

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Экспериментальный и конечные элементы протокол по расследованию транспорта нейтральных и заряженных растворенных веществ через суставной хрящ

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

В реальном времени визуализации и анализа хондроцитов травмы вследствие механической загрузки в полной сохранности мышиных хряща эксплантов

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...