Name: addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants at JoVE.com

Vi tackar ortopedkirurgerna från avdelningen för ortopedisk kirurgi vid universitetssjukhuset i Tübingen för att de har tillhandahållit vävnadsprover.

Lårbenskondyler som samlats in från patienter som genomgick total knäprotesplastik vid universitetssjukhuset i Tübingen, Tyskland, användes. Endast ledbroskprover från patienter med degenerativa och posttraumatiska ledpatologier inkluderades i denna studie. Godkännande från avdelnings-, institutions- och lokaletiska kommittéer erhölls innan studien påbörjades (projekt nr 674/2016BO2). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter före deltagandet.
OBS: Ett flödessc...

Som en progressiv och multifaktoriell sjukdom utlöser artros strukturella och funktionella förändringar i ledbrosket. Under hela artrosförloppet åtföljs försämringar av mekaniska egenskaper av strukturella och biokemiska förändringar på ledbroskets yta27,31. De tidigaste patologiska händelserna som inträffar vid artros är proteoglykanutarmning i kombination med störning av kollagennätverket32,33,34<sup class="xre...

På grund av den ständigt krympande storleken på elektroniska enheter och system har den snabba utvecklingen av mikro- och nanobaserad teknik och utrustning tagit fart. En sådan anordning är atomkraftsmikroskopi (AFM), som kan skanna biologiska ytor och hämta topografisk eller biomekanisk information på både nano- och mikrometerskala 1,2. Bland dess stora funktioner kan detta verktyg användas som en mikro- såväl som en nanoindenter för att få information om de mekaniska egenskaperna hos olika biologiska system 3,4,5,6. Data samlas in genom fysisk kontakt med ytan genom en mekanisk sond, som kan vara så liten som cirka 1 nm vid spetsen7. Den resulterande deformationen av provet visas sedan baserat på intryckningsdjupet för den utskjutande spetsen och kraften som appliceras på provet8.
Artros (OA) är en långvarig degenerativ kronisk sjukdom som kännetecknas av försämring av ledbrosket i lederna och omgivande vävnader, vilket kan leda till fullständig exponering av benytorna. Bördan av OA är betydande; Idag lider hälften av alla kvinnor och en tredjedel av alla män över 65 år av artros9. Trauman, fetma och den resulterande förändrade biomekaniken i leden10 bestämmer ledbroskdegenerationen, vilket ses som ett vanligt slutresultat. Den banbrytande studien av Ganz et al. antog att de tidiga stegen i OA-processen kan involvera de biomekaniska egenskaperna hos brosk11, och sedan dess har forskare bekräftat denna hypotes12. På samma sätt är det allmänt accepterat att vävnadens biomekaniska egenskaper är funktionellt orkestrerade av den ultrastrukturella organisationen såväl som cell-cell och cell-matris överhörning. Eventuella förändringar kan dramatiskt påverka vävnadens övergripande biomekaniska funktion13. Hittills är artrosdiagnosen klinisk och baseras på vanlig filmröntgen14. Detta tillvägagångssätt är dubbelsidigt: för det första gör avsaknaden av en definierad degenerativ gränsvärde för att formulera diagnosen OA tillståndet svårt att kvantifiera, och för det andra saknar avbildningsmetoder känslighet och standardisering och kan inte upptäcka lokaliserade broskskador15,16,17. För detta ändamål har bedömningen av broskets mekaniska egenskaper den avgörande fördelen att den beskriver en parameter som förändras under artrosförloppet oavsett sjukdomens etiologi och har en direkt inverkan på vävnadens funktionalitet i ett mycket tidigt skede. Intryckningsinstrument mäter den kraft med vilken vävnaden motstår intryckningen. Detta är i själva verket inget nytt koncept. De tidigaste studierna går tillbaka till 1980- och 1990-talen. Under denna period tyder många studier på att intryckningsinstrument utformade för artroskopiska mätningar av ledbrosk kan vara väl lämpade för att upptäcka degenerativa förändringar i brosket. Redan för 30 år sedan kunde vissa studier visa att intryckningsinstrument kunde detektera in vivo-förändringar i broskytan under vävnadsdegeneration genom att utföra tryckstyvhetsmätningar under artroskopi18,19,20.
AFM-indrag (AFM-IT) av ledbrosket ger information om en central mekanisk egenskap hos vävnaden, nämligen styvhet. Detta är en mekanisk parameter som beskriver förhållandet mellan en applicerad, icke-destruktiv belastning och den resulterande deformationen av det indragna vävnadsområdet21. AFM-IT har visat sig kunna kvantifiera åldersberoende förändringar i styvhet i makroskopiskt opåverkade kollagennätverk, och därmed skilja mellan de patologiska förändringar som är förknippade med debut av artros (grad 0 på Outerbridge-skalan i ledbrosk)22. Vi har tidigare visat att AFM-ITs, på grundval av spatial kondrocytorganisation som en bildbaserad biomarkör för tidig broskdegeneration, inte bara möjliggör kvantifiering utan också faktiskt lokalisering av de tidigaste degenerativa mekaniska förändringarna. Dessa resultat har redan bekräftats av andra23,24. Därför fungerar AFM-IT som ett intressant verktyg för att diagnostisera och identifiera tidiga degenerativa förändringar. Dessa förändringar kan redan mätas på cellnivå, vilket omformar förståelsen av den patofysiologiska processen för artros.
I detta protokoll demonstrerar vi en komplett histologisk och biomekanisk graderingsprocedur för ledbroskexplantat, från naturlig broskexplantation till AFM-datainsamling och bearbetning. Genom ett steg-för-steg-tillvägagångssätt visar vi hur man genererar, graderar och visuellt klassificerar ledbroskvävnad enligt olika stadier av degeneration med hjälp av 2D stor mosaikavbildning, följt av mikro-AFM-intryck.
Även om AFM-IT för närvarande är ett av de känsligaste verktygen för att mäta biomekaniska förändringar i brosk7, har det, precis som alla andra instrumentella tekniker, begränsningar och praktiska egenheter25 som kan leda till felaktig datainsamling. För detta ändamål granskar vi de vanligaste problemen som uppstår vid AFM-mätningar av broskexplantat och beskriver, där det är möjligt, hur man kan minimera eller övervinna dem. Dessa inkluderar topografiska aspekter av proverna och svårigheterna att stabilisera dem i en AFM-kompatibel miljö, fysiska särdrag hos vävnadens yta och de resulterande svårigheterna att utföra AFM-mätningar på sådana ytor. Exempel på felaktiga kraft-avståndskurvor presenteras också, med betoning på de förhållanden som kan orsaka dem. Ytterligare begränsningar som är inneboende i geometrin hos den fribärande spetsen och användningen av Hertz-modellen för dataanalys diskuteras också.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscop (AFM) head&#160;</td>
			<td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible sample glue&#160;</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>H000033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA</td>
			<td>14948</td>
			<td>Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SAA-SPH-5UM</td>
			<td>Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115&#956;m, width nom: 40&#956;m,&#160; geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5&#956;m end radius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage ctting device&#160;</td>
			<td>Self-made&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the AFM</td>
			<td>The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany</td>
			<td>DFK 31BF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDD camera integrated in the fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DFC3000G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotome</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>CM3050S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing Software for the AFM</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 5.0.86,&#160; can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope (Leica DMi8)</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass block cantiliver holder</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>SP-90-05</td>
			<td>Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine&#160;</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium With DAPI</td>
			<td>ibidi GmbH, Gr&#228;felfing, Germany</td>
			<td>50011</td>
			<td>Mounting media with nuclear DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs&#160; side view imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather Medical Products, Osaka, Japan</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Skirt</td>
			<td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent&#160; medium condensation in the AFM head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical program - SPSS</td>
			<td>IBM, Armonk, New York, USA</td>
			<td>SPSS Statistics 22</td>
			<td>Vesion 280.0.0.0 (190)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td>Water-soluble embedding medium&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

addressing practical issues in atomic force microscopy-based micro-indentation on human articular cartilage explants

Utan tvekan är atomkraftsmikroskopi (AFM) för närvarande en av de mest kraftfulla och användbara teknikerna för att bedöma mikro- och till och med nanosignaler inom det biologiska området. Men som med alla andra mikroskopiska metoder kan metodologiska utmaningar uppstå. I synnerhet kan egenskaperna hos provet, provberedningen, typen av instrument och intryckningssonden leda till oönskade artefakter. I detta protokoll exemplifierar vi dessa framväxande problem på friska såväl som osteoartritiska ledbroskexplantat. För detta ändamål visar vi först via en steg-för-steg-metod hur man genererar, graderar och visuellt klassificerar ex vivo ledbroskskivor enligt olika stadier av degeneration med hjälp av stor 2D-mosaikfluorescensavbildning av hela vävnadsexplantaten. Den största styrkan med ex vivo-modellen är att den består av åldrat, naturligt, humant brosk som gör det möjligt att undersöka artrosrelaterade förändringar från tidig debut till progression. Dessutom presenteras vanliga fallgropar vid vävnadspreparation, samt själva AFM-proceduren tillsammans med den efterföljande dataanalysen. Vi visar hur grundläggande men avgörande steg som provberedning och bearbetning, topografiska provegenskaper orsakade av avancerad degeneration och provspetsinteraktion kan påverka datainsamlingen. Vi granskar också de vanligaste problemen inom AFM och beskriver, där det är möjligt, hur man kan lösa dem. Kunskap om dessa begränsningar är av yttersta vikt för korrekt datainsamling, tolkning och i slutändan inbäddning av resultat i ett brett vetenskapligt sammanhang.

Med hjälp av en egentillverkad skäranordning kunde vi explantera och generera små (4 mm x 1 mm) broskskivor från färska mänskliga kondyler som innehåller ett enda cellulärt rumsligt mönster30 av enkla strängar (SS, figur 2A), dubbla strängar (DS), små kluster (SC), stora kluster (BC; (figur 2A) och diffus (figur 2B). En representativ broskexplantering visas i figur 3A...

Watch this Scientific Journal Video about Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants at JoVE.com

Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Vi presenterar ett steg-för-steg-tillvägagångssätt för att identifiera och ta itu med de vanligaste problemen i samband med mikrointryckningar i atomkraftsmikroskopi. Vi exemplifierar de framväxande problemen på naturliga mänskliga ledbroskexplantat som kännetecknas av olika grader av artrosdriven degeneration.

Att ta itu med praktiska frågor i atomkraftsmikroskopibaserad mikrointryckning på humant ledbroskexplantat

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

Målet med detta protokoll var att skapa en in vitro-modell för att studera ledbroskets mekaniska egenskaper under uppkomsten och progressionen av artros. Den största fördelen med den nuvarande tekniken är att broskexplantaten är lätta att generera och mycket representativa för brosk i naturlig ålder. Denna modell kan användas för att analysera och övervaka olika artros-, diagnostiska och terapeutiska metoder på biomekanisk nivå.Börja med att skära bort brosket från benet med hjälp av en skalpell. Använd en biopsistans för att generera skivor med fyra millimeters diameter. Placera skivan på en skräddarsydd skäranordning.Använd en spatel för att fixera och stabilisera broskskivan. Skär av broskskivan med ett rakblad. Använd en spatel, samla upp skivan och placera den i ett 1,5 milliliters rör.För att stanna kvar i broskproverna, tillsätt 130 mikroliter cellpermeabelt fluorescensfärgämne till varje brunn på plattan med 96 brunnar och fördela skivan på plattan som en skiva per brunn. Placera brunnsplattan 96 på platthållaren på fluorescensmikroskopet. Välj lämpligt fluorescensfilter och mål.Placera objektivet under den förvalda brunnen som innehåller individuellt brosk. Fokusera på skivan för att se det cellulära mönstret. Välj navigatorfunktionen för att få en översikt över hela brunnen.Använd vänster musknapp och dra den för att navigera till en annan scenposition. Välj en fyrkant som omfattar det intresseområde som ska skannas. Välj programvarans alternativ för fokuskartpunkt och välj sedan varje enskild ruta genom att vänsterklicka i mitten av den.Välj alternativet fokuskarta i det fönster som visas med alla tidigare valda rutor. Dubbelklicka på en bricka för att visa och få den i rätt fokus. Klicka sedan på ställ in Z för att spara fokusplanen och gå vidare till nästa bricka.När du har justerat fokusplanen för varje enskild bricka börjar du ta bilder genom att trycka på starta skanning. Fixera varje förvald broskskiva som innehåller ett cellmönster i petriskålar genom att tillsätta tillräckligt med biokompatibelt lim på skivans övre, nedre, vänstra och högra sida. Täck skivorna med 2,5 milliliter Leibovitz medium utan L-glutamin.Placera petriskålen i AFM-enheterna sample hållare. För att kalibrera AFM-konsolen, placera den på ytan av glasblockets konsol så att den vilar på det polerade optiska planet i mitten av glasblocket. Sänk konsolen i steg om 100 mikrometer med hjälp av stegmotorfunktionen tills den är helt nedsänkt i mediet.För att identifiera det önskade broskmätningsstället, starta en skannermetod med utskjutaren på ett rent provfritt område av petriskålen. Dra sedan tillbaka konsolen 1,5 millimeter från plattans botten. Växla från ljusfält till fluorescensvy och identifiera skivans ovansida visuellt.Flytta AFM-provhållaren exakt två millimeter mot mitten av skivan. Kör en skannermetod för att nå broskskivans yta och dra tillbaka konsolen med 100 mikrometer. För att generera en kraftavståndskurva, fokusera på cellerna som är placerade på önskad mätplats.Klicka på körknappen för att starta mätningarna och få fem kraftavståndskurvor på varje mätplats. Spara kurvorna när de har inspekterats. För att uppskatta Youngs moduler, med hjälp av alternativet öppna en batch av spektroskopikurvor, öppna de genererade kraftavståndskurvorna som ska analyseras.Välj Hertz-fit-modellen följt av alternativet elasticity-fit. Visualisera och dokumentera sedan Youngs modul. Anpassa med hjälp av poissonförhållandet på 0,5 och lämplig utskjutande spetsradie.Kontrollera sedan visuellt kraftavståndskurvans passform för att säkerställa korrekthet. För bestämning av indragsdjup, öppna var och en av de genererade kraftavståndskurvorna i dataanalysprogrammet och välj Hertz-fit-modellen som analysprocess. Använd alternativet subtrahera baslinjeförskjutning för att nollställa den vertikala avböjningsaxeln och välj funktionen offset plus lutning.Använd funktionen för att hitta kontaktpunkt för att automatiskt identifiera kontaktpunkten. Med hjälp av den vertikala spetspositionsfunktionen subtraherar du avståndet och tar endast hänsyn till utskjutande avböjning från den råa piezohöjden under fördjupningen. Välj alternativet elasticitetspassning för att visa den bearbetade kraftavståndskurvan.Markera sedan området i diagrammet så att det ligger i linje med det mest negativa värdet på den lodräta spetspositionsaxeln. På parameterfliken i rutan XMIN läser och dokumenterar du indraget. Skivorna som innehöll enstaka strängar uppvisade högre styvhetsvärden med en median på 2,6 kilo pascal, vilket är representativt för okomprometterade, friska broskområden.Vid debut och progression av artros visade AFM-mätningarna en stark stegvis minskning av styvheten med 42 % i dubbla strängar, 77 % i små kluster och slutligen 88 % i avancerade stadier som representeras av stora kluster. Skivorna som innehåller ett diffust mönster uppvisas i förhöjd elasticitet med en viktig variation av Youngs modul enkelvärden. För alla broskskivor med tilldelad dominerande cellulär mönsterorganisation visade sig intryckningsdjupet associerat med det använda börvärdet vara omvänt proportionellt mot styvheten.Artefakterna som ses i de genererade kraftavståndskurvorna tyder antingen på en suboptimal kontakt mellan AFM-konsolen och broskytan eller felaktig provfixering på petriskålen. Våra broskexplantat kan bearbetas och analyseras ytterligare med hjälp av en mängd olika molekylärbiologiska tekniker såsom proteinanalys via eliza, immunmärkning, västerländsk moding eller genanalys via PCR. Denna metod kan användas för att studera den direkta effekten av nya terapier på ledbroskighet och kan hjälpa forskare att få viktiga insikter om potomamekanismerna vid artros.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakteriell Immobilisering for Imaging genom atomkraftsmikroskopi

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisering av Rekombinant DNA och proteinkomplex Använda atomkraftsmikroskopi

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantifiering De mekaniska egenskaperna hos den endoteliala glykokalyx med atomkraftsmikroskopi

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning för Isolering av morfologi Särskilda reagenser mot TDP-43 varianter i amyotrofisk lateralskleros

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Byggnadsställningar för Articular kondrocyt kultur och brosk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En Experimental och Finite Element protokoll för att undersöka transport av neutrala och laddade Lösta ämnen över Ledbrosk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Realtid visualisering och analys av Chondrocyte skada på grund av mekanisk belastning i helt intakt murina brosk bladsticklingar

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...