Name: identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

هذا العمل مدعوم بمنح المعاهد الوطنية للصحة R01DK130498 و R01DK120639 و R01HL141402

أجريت جميع التجارب وفقا لبروتوكولات الحيوانات A-1586 و 202200017 المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان.
ملاحظة: تم تفصيل بروتوكولين هنا: أولا ، تحليل التدفق الخلوي (القسم 1) ، متبوعا بتعديلات البروتوكول للفرز الخلوي للتدفق (القسم 2...

<ol>
	<li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies.">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development:+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing.">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).</li><li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro.">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. , (1974).</li><li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation.">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li><li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture.">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li><li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+State+of+differentiation.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li><li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li><li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system:+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture.">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li><li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).</li><li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis.">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).</li><li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities.">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways.">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li><li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo.">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li><li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response.">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors.">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors:+BFU-E+and+CFU-E.">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal.">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li><li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis.">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li><li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro.">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li><li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia.">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action.">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li></ol>

القدرة على عزل أسلاف BFU-e و CFU-e بشكل مستقبلي مباشرة من الأنسجة الطازجة ذات النقاء العالي قد استعصت على الباحثين في السابق. نهجنا الجديد ، الذي تم التحقق من صحته باستخدام scRNAseq ومقايسات مصير الخلية1،27 ، يقدم الآن الأدوات اللازمة للقيام بذلك.
هناك...

يمكن تقسيم تكون الكريات الحمر إلى مرحلتين رئيسيتين: تكون الكريات الحمر المبكر والتمايز النهائي للإريثرويد (الشكل 1) 1،2،3. في الكريات الحمر المبكرة ، تلتزم الخلايا الجذعية المكونة للدم بسلالة الكريات الحمر وتؤدي إلى ظهور أسلاف الإريثرويد المبكرة ، والتي تم تحديدها لأول مرة في 1970s بناء على إمكاناتها في تكوين مستعمرة في وسط شبه صلب4،5،6،7،8،9 . على نطاق واسع ، تنقسم أسلاف الإريثرويد إلى فئتين: السلف السابقة التي يؤدي كل منها إلى "انفجار" (مجموعة كبيرة من مجموعات خلايا الإريثرويد الأصغر) ، تسمى "وحدة تشكيل الانفجار erythroid" أو BFU-e4،5،6 ؛ وذريتهم ، التي يشكل كل منها مجموعة خلايا أو مستعمرة واحدة صغيرة من الكريات الحمر ، تسمى "وحدة تشكيل مستعمرة erythroid" أو CFU-e7،8،9. BFU-e و CFU-e لا يعبران بعد عن جينات الإريثرويد الطرفية ولا يمكن التعرف عليهما شكليا. بعد عدد من انقسامات خلايا التجديد الذاتي أو التوسع ، يخضع CFU-e لتبديل نسخي يتم فيه تحفيز جينات الإريثرويد مثل الغلوبين ، وبالتالي الانتقال إلى التمايز الطرفي الإريثرويد (ETD)1,10. أثناء ETD ، تخضع الأرومات الحمراء لثلاثة إلى خمسة انقسامات خلوية قبل استئصالها لتشكيل خلايا شبكية تنضج إلى خلايا حمراء.
تم تصنيف الأرومات الحمراء أثناء التمايز النهائي في الأصل بناء على مورفولوجيتها إلى أرومات الدم الحمراء ، والقاعدية ، ومتعددة الألوان ، وتقويم الألوان. سمح ظهور قياس التدفق الخلوي بفرزها وعزلها المحتمل بناء على حجم الخلية (يقاس بالتشتت الأمامي ، FSC) وعلامتين لسطح الخلية ، CD71 و Ter119 11،12،13 (الشكل 1). أحدث هذا النهج ونهج قياس التدفق الخلويالمماثل 14 ثورة في التحقيق في الجوانب الجزيئية والخلوية ل ETD ، مما يسمح بتحليل المرحلة التنموية الخاصة بالأرومات الحمراء في الجسم الحي وفي المختبر 10،15،16،17،18،19،20. يستخدم نهج CD71 / Ter119 الآن بشكل روتيني في تحليل سلائف الإريثرويد.
حتى وقت قريب ، كان نهج قياس التدفق الخلوي المماثل الذي يمكن الوصول إليه للعزل المباشر وعالي النقاء ل CFU-e و BFU-e من أنسجة الفئران قد استعصى على المحققين. بدلا من ذلك ، استخدم الباحثون استراتيجيات قياس التدفق الخلوي التي تعزل جزءا صغيرا فقط من هذه الأسلاف ، غالبا في وجود خلايا غير حمراء تشارك في التنقية داخل نفس المجموعات الفرعية لقياس التدفق الخلوي21. وبالتالي ، اقتصر التحقيق في BFU-e و CFU-e على أنظمة التمايز في المختبر التي تستمد وتضخم BFU-e و CFU-e من أسلاف نخاع العظم السابقة. من الممكن بعد ذلك تطبيق استراتيجيات قياس التدفق الخلوي التي تميز CFU-e عن BFU-e في هذه الثقافات المخصب بالسلف الإريثرويد22،23. يستخدم نهج بديل CFU-e الجنيني و BFU-e ، والتي يتم تخصيبها بدرجة عالية في الجزء السلبي Ter119 من كبد الجنين الفأر في منتصف الحمل10،24،25. ومع ذلك ، لا يسمح أي من هذين النهجين بالتحقيق في البالغين BFU-e و CFU-e في حالتهم الفسيولوجية في الجسم الحي. يمكن تقدير حجم التحدي عند تذكر أنه بناء على فحوصات تكوين المستعمرة ، توجد هذه الخلايا في نخاع العظم البالغ بتردد 0.025٪ و 0.3٪ فقط على التوالي6.
البروتوكول الموصوف هنا هو نهج جديد لقياس التدفق الخلوي يعتمد على التحليل النسخي أحادي الخلية لخلايا نخاع عظم الفأر Kit + التي تم حصادها حديثا (يتم التعبير عن Kit من قبل جميع مجموعات السلف المبكرة لنخاع العظام)1. يحتوي نهجنا على بعض علامات سطح الخلية التي كانت قيد الاستخدام بالفعل بواسطة Pronk et al.21,26. تم استخدام النسخ أحادي الخلية لتحديد مجموعات من علامات سطح الخلية التي تحدد الكريات الحمر وغيرها من السلف المكونة للدم المبكرة (الشكل 2). على وجه التحديد ، يمكن تقسيم جزء CD55 + من خلايا Kit + سالبة النسب (Lin-) إلى خمس مجموعات ، ثلاثة منها تنتج أجزاء متجاورة من مسار الكريات الحمر (الشكل 2). تم تأكيد الهويات النسخية لكل من هذه المجموعات السكانية عن طريق الفرز ، متبوعا ب scRNAseq وإسقاط النسخ أحادية الخلية المصنفة مرة أخرى على خريطة النسخ الأصلية (يمكن استكشاف التعبير الجيني في كل من المجموعات السكانية الخمس ومجموعة بيانات نخاع العظم بأكملها في https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . تم تأكيد إمكانات مصير الخلية لكل مجموعة من المجموعات باستخدام مقايسات تكوين المستعمرة التقليدية (الشكل 2) ، بالإضافة إلى مقايسة مصير خلية واحدة جديدة عالية الإنتاجية 1,27. تظهر هذه التحليلات أن نهج قياس التدفق الخلوي الجديد يؤدي إلى عزل عالي النقاء لجميع أسلاف BFU-e و CFU-e لنخاع العظم والطحال البالغين الجدد. على وجه التحديد ، يحتوي السكان 1 (P1) فقط على CFU-e ولا يحتوي على أسلاف أخرى مكونة للدم ، ويحتوي السكان 2 (P2) على جميع أسلاف BFU-e في نخاع العظم وعدد صغير من CFU-e ولكن لا يوجد أسلاف أخرى1. يتم توضيح البروتوكول المفصل أدناه بمزيد من التفصيل مع مثال على تجربة في الفئران التي تم حقنها إما بالمحلول الملحي أو بهرمون الإريثروبويتين المنبه لتكوين الكريات الحمر (Epo).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L large orifice tips</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1011-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557395</td>
			<td>M1/70 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553784</td>
			<td>1D3 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553045</td>
			<td>RM4-5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553029</td>
			<td>53-6.7 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123106</td>
			<td>BM8 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>RB6-8C5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>TER-119 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma aldritch</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital DIVA hardware and software for LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>version 10</td>
			<td>Flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NewlineNY Stainless Steel Hand Masher &#38; Bowl, Mortar and Pestle Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD105 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>120408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 10x Solution</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480016</td>
			<td>Magnetic beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry

تم تعريف أسلاف الإريثرويد المبكرة في الأصل من خلال قدرتها على تكوين مستعمرة في المختبر وتصنيفها إلى "وحدات" لتشكيل الانفجار وتشكيل المستعمرات المعروفة باسم BFU-e و CFU-e. حتى وقت قريب ، لم تكن طرق العزل المباشر والكامل والمحتمل لأسلاف BFU-e و CFU-e النقية من نخاع عظم الفأر البالغ المعزول حديثا متاحة. لمعالجة هذه الفجوة ، تم تحليل مجموعة بيانات RNA-seq أحادية الخلية (scRNAseq) لنخاع عظم الفأر للتعبير عن الجينات المشفرة لعلامات سطح الخلية. تم دمج هذا التحليل مع فحوصات مصير الخلية ، مما يسمح بتطوير نهج جديد لقياس التدفق الخلوي يحدد ويسمح بعزل مجموعات فرعية كاملة ونقية من أسلاف BFU-e و CFU-e في نخاع عظم الفأر أو الطحال. يحدد هذا النهج أيضا مجموعات فرعية سلفية أخرى ، بما في ذلك مجموعات فرعية مخصبة للخلية القاعدية / البدينة وإمكانات الخلايا الضخمة النواة. تتكون الطريقة من وضع علامات على نخاع العظم الطازج أو خلايا الطحال بأجسام مضادة موجهة إلى Kit و CD55. ثم تنقسم الأسلاف التي تعبر عن هاتين العلامتين إلى خمس مجموعات سكانية رئيسية. تحتوي المجموعة 1 (P1 أو CFU-e ، Kit + CD55 + CD49f med / low CD105 med / high CD71 med/ high) على جميع أسلاف CFU-e ويمكن تقسيمها أيضا إلى P1-low (CD71med CD150 high) و P1-hi (CD71 high CD150low) ، المقابلة ل CFU-e المبكر والمتأخر ، على التوالي ؛ السكان 2 (P2 أو BFU-e ، Kit + CD55 + CD49f med / low CD105 med / high CD71منخفض CD150مرتفع) يحتوي على جميع أسلاف BFU-e ؛ السكان P3 (P3 ، Kit + CD55 + CD49f med / high CD105 med /low CD150 منخفض CD41منخفض) مخصب لأسلاف الخلايا القاعدية/ الخلايا البدينة. يتم إثراء السكان 4 (P4 ، Kit + CD55 + CD49f med / high CD105med / low CD150High CD41 +) للأسلاف الضخمة النواة. والسكان 5 (P5 ، Kit + CD55 + CD49f med / high CD105 med /low CD150High CD41-) يحتوي على أسلاف مع إريثرويد ، خلية قاعدية / بدينة ، وإمكانات خلايا النواة الضخمة (EBMP) وأسلاف متعددة الإمكانات متحيزة لخلايا الدم الحمراء / ضخمة النواة/ متحيزة ل القاعدية (MPPs). يسمح هذا النهج الجديد بدقة أكبر عند تحليل الكريات الحمر وغيرها من الأسلاف المكونة للدم ويسمح أيضا بالرجوع إلى معلومات النسخ لكل مجموعة محددة خلويا.

يصف البروتوكول نهج قياس التدفق الخلوي لتحديد BFU-es و CFU-es في خلايا نخاع العظم والطحال التي تم حصادها حديثا. يبدأ بحصاد BM الطازج والطحال من الفئران ووضع الأنسجة على الجليد على الفور. يتم إجراء جميع الإجراءات في البرد للحفاظ على صلاحية الخلية. يتم تصنيف الخلايا بكوكتيل الأجسام المضادة "النسب" ا...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

هنا ، نصف طريقة جديدة لقياس التدفق الخلوي للعزل المحتمل لوحدة تشكيل الانفجار المبكر erythroid (BFU-e) ووحدة تشكيل المستعمرة erythroid (CFU-e) مباشرة من نخاع عظم الفأر الطازج والطحال. هذا البروتوكول ، الذي تم تطويره بناء على بيانات النسخ أحادية الخلية ، هو الأول الذي يعزل جميع أسلاف الإريثرويد في الأنسجة بنقاوة عالية.

تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

يسمح هذا البروتوكول بتحديد وعزل أسلاف الكريات الحمر BFU-E و CFU-E مباشرة من أنسجة الفئران التي تم حصادها حديثا مثل نخاع العظام والطحال. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا عزل مجموعات نقية من أسلاف الإريثرويد ، وهو ما لم يكن ممكنا مع بروتوكولات التدفق السابقة. تعزز هذه الطريقة بشكل كبير قدرتنا على دراسة نماذج فأر مرض الإريثرويد من خلال السماح بعزل السلف للعديد من التجارب النهائية.للبدء ، ضع عظم الفخذ والساق الذي تم تشريحه حديثا مباشرة في مخزن تلطيخ بارد أو SB-5 واحتفظ بالأنابيب على الثلج حتى تصبح جاهزة لاستخراج نخاع العظام. ضع ملاطا معقم نظيفا على الثلج في دلو وانقل العظام إلى الهاون. باستخدام مقص التشريح ، قم بقص نهايات 1 ملليمتر تقريبا من كل عظم.استخدم حقنة سعة 3 ملليلتر مزودة بإبرة قياس 26 تحتوي على SB-5 لطرد النخاع من العظام وتجميعه في الهاون وكرر العملية من 3 إلى 5 مرات باستخدام مخزن مؤقت جديد في كل مرة حتى تظهر العظام عديمة اللون. قم بتصفية النخاع المتدفق من خلال شبكة 100 ميكرومتر وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يوضع على الثلج. بعد ذلك ، استخدم الهاون والمدقة لسحق العظام المتدفقة في 5 إلى 10 ملليلتر من SB-5.قم بتصفية خليط العظام المسحوقة والعازلة من خلال مصفاة الخلايا 100 ميكرومتر لتجميعها مع الخلايا التي تم جمعها مسبقا. قم بإعداد مرشح شبكي 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 50 ملليلتر يوضع على الجليد. ضع طحالا واحدا على مرشح الشبكة وأضف 0.5 إلى 1 ملليلتر من SB-5 إلى الطحال لضمان عدم جفافه.باستخدام الجانب المطاطي من مكبس حقنة 3 أو 5 ملليلتر ، اهرس الطحال من خلال الشبكة. أضف المزيد من SB-5 ، 5 ملليلتر في المرة الواحدة ، واستمر في الهرس حتى يتم جمع جميع الخلايا في الأنبوب. قم بإعداد تعليق أحادي الخلية عن طريق سحب الخلايا المجمعة لأعلى ولأسفل باستخدام 2 ملليلتر من SB-5 باستخدام طرف فتحة كبير.قم بتلطيخ مضان ناقص واحد أو ضوابط FMO عن طريق إضافة جميع الأجسام المضادة باستثناء الجسم المضاد الذي يحمل الاسم نفسه ل FMO إلى تعليق الخلية في أنبوب FACS. لتلطيخ عناصر التحكم أحادية اللون ، أضف جسما مضادا واحدا إلى معلق الخلية في أنبوب FACS. دوامة كل أنبوب تحكم لمدة 2 إلى 3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة ثم احتضان عند 4 درجات مئوية هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام.بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام SB-5 وقم بتكوين حجم تعليق الخلية إلى 4 ملليلتر مع SB-5. قم بتدوير الخلايا عند 900 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق عناصر التحكم غير الملوثة وجميع عناصر التحكم أحادية اللون في 300 ميكرولتر من SB-5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنابيب FACS الجديدة.اصنع حل DAPI SB-5 عن طريق تخفيف مخزون DAPI بنسبة 1 إلى 10،000 في SB-5. أعد تعليق FMOS في 1.8 ملليلتر من DAPI SB-5 والتحكم أحادي اللون DAPI في 300 ميكرولتر من DAPI SB-5 ، ثم قم بترشيحها من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنابيب FACS جديدة. بعد إضافة مزيج الأجسام المضادة الرئيسي إلى كل عينة ، دوامة الأنابيب لمدة 2 إلى 3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة تليها الحضانة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 2.5 ساعة في حالة هزاز.بعد غسل الخلايا كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق العينات في 1.8 ملليلتر من DAPI SB-5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد وتحليل العينات باستخدام مقياس المثانة. استخدم التشتت الأمامي لإزالة الحطام بناء على الحجم، ثم استخدم الرسم البياني لارتفاع التشتت الأمامي مقابل الرسم البياني لمنطقة التشتت الأمامي لاستبعاد مجاميع الخلايا وتحديد الخلايا المفردة. كرر الاستبعاد مع الرسم البياني لارتفاع التشتت الجانبي مقابل الرسم البياني لمنطقة التشتت الجانبي.استبعاد الخلايا الميتة عن طريق إخراج الخلايا الإيجابية ل DAPI. حدد النسب سلبي TUR واحد 19 خلية إيجابية مجموعة سلبية. ومن هذه حدد مجموعة سكانية فرعية تعبر عن CD 55.قسم النسب السالب TUR واحد 19 ، مجموعة سالبة ، إيجابية ، CD 55 خلايا موجبة إلى 2 مجموعات أساسية ، P ستة و P سبعة بناء على التعبير عن CD 49 F و CD 1 0 5. الآن استنادا إلى التعبير عن CD 150 و CD 41 ، قسم P 6 إلى P 3 و P 4 و P 5. وبالمثل ، بناء على تعبير CD 150 و CD 71 ، قم بتقسيم P 7 إلى BFUE و CFUE المبكر و CFUE المتأخر.في هذه الدراسة ، تم تحديد وحدات تشكيل الانفجار والمستعمرة من خلايا نخاع العظم والطحال التي تم حصادها حديثا. بعد 72 ساعة من الإريثروبويتين ، أو حقن السيارة في الفئران ، أظهر تحفيز الإريثروبويتين توسعا في مجموعات وحدة تشكيل المستعمرة المبكرة والمتأخرة P 1 منخفضة و P 1 عالية في خلايا نخاع العظم والطحال المحصودة. كما أظهرت استجابة أسلاف نخاع العظم والطحال للإريثروبويتين في الجسم الحي عددا أكبر من الخلايا في مجموعات الوحدات المكونة للمستعمرة المبكرة والمتأخرة P 1 منخفضة و P 1 عالية ، مقارنة بالتحكم في السيارة.من المهم للغاية إنشاء تعليق خلية واحدة قبل تسمية الخلايا بالأجسام المضادة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب الأنابيب لأعلى ولأسفل بشكل متكرر وعن طريق تضمين EDTA في المخزن المؤقت. يمكن استخدام السلف المنقى لأي تحليل خلوي وجزيئي في المصب.على سبيل المثال ، نسخ الخلية الواحدة ، atesque ، مقايسات مستعمرة والكيمياء الحيوية. ساعدتنا هذه التقنية في اختبار التنبؤات من تجارب RNA-seq أحادية الخلية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

خطوة محددة الفرز ماوس Spermatids بواسطة التدفق الخلوي

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

عزل وتحليل خلايا البنكرياس اللحمة المتوسطة عن طريق التدفق الخلوي

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

التوسع و أديبوجينيسيس تحريض الأسلاف خلية شحمية من الأنسجة الدهنية حول الأوعية معزولة من قبل المغناطيسي تنشيط الخلايا الفرز

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

عزل وتوصيف الخلايا اللحمية الوسيطة القلب من عينات مرضى اعتلال عضلة القلب أرهيثموجينيك بيوبتيك اندوميوكارديال

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

في الوقت الحقيقي يعيش خلية تدفق الخلوي للتحقيق في تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام والبلعمه من مستقبلات P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...