Name: identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Ce travail est soutenu par les subventions NIH R01DK130498, R01DK120639 et R01HL141402

Toutes les expériences ont été menées conformément aux protocoles animaux A-1586 et 202200017 approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’école de médecine Chan de l’Université du Massachusetts.
REMARQUE: Deux protocoles sont détaillés ici: premièrement, l’analyse cytométrique en flux (section 1), suivie des ajustements de protocole pour le tri cytométrique en flux (section 2). Le protocole ci-dessous utilise un cytomètre/trieur en f...

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	<li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies.">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development:+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing.">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).</li><li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro.">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. , (1974).</li><li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation.">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li><li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture.">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li><li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+State+of+differentiation.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li><li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li><li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system:+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture.">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li><li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).</li><li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis.">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).</li><li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities.">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways.">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li><li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo.">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li><li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response.">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors.">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors:+BFU-E+and+CFU-E.">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal.">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li><li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis.">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li><li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro.">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li><li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia.">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action.">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li></ol>

La capacité d’isoler prospectivement les progéniteurs BFU-e et CFU-e directement à partir de tissus frais de haute pureté avait auparavant échappé aux chercheurs. Notre nouvelle approche, validée à l’aide de scRNAseq et des essais de destin cellulaire 1,27, offre maintenant les outils pour y parvenir.
Il existe un certain nombre de points clés pour exécuter avec succès les protocoles de tri et d’analyse. Tout d’abord...

L’érythropoïèse peut être divisée en deux phases principales : l’érythropoïèse précoce et la différenciation érythroïde terminale (Figure 1)1,2,3. Dans l’érythropoïèse précoce, les cellules souches hématopoïétiques s’engagent dans la lignée érythroïde et donnent naissance à des progéniteurs érythroïdes précoces, qui ont été identifiés pour la première fois dans les années 1970 en fonction de leur potentiel de formation de colonies en milieu semi-solide 4,5,6,7,8,9 . En gros, les progéniteurs érythroïdes sont divisés en deux catégories: les progéniteurs antérieurs qui donnent chacun lieu à un « éclatement » (un grand agrégat de petits amas de cellules érythroïdes), appelé « unité érythroïde formant un éclatement » ou BFU-e 4,5,6; et leur descendance, qui forment chacune un seul petit amas de cellules érythroïdes ou une seule colonie, appelée « unité érythroïde formant colonie » ou UFC-e 7,8,9. BFU-e et CFU-e n’expriment pas encore de gènes érythroïdes terminaux et ne sont pas morphologiquement reconnaissables. Après un certain nombre de divisions cellulaires d’auto-renouvellement ou d’expansion, l’UFC-e subit un commutateur transcriptionnel dans lequel des gènes érythroïdes tels que les globines sont induits, passant ainsi à la différenciation terminale érythroïde (ETD)1,10. Au cours de l’ETD, les érythroblastes subissent trois à cinq divisions cellulaires de maturation avant d’énucléer pour former des réticulocytes qui mûrissent en globules rouges.
Les érythroblastes au cours de la différenciation terminale ont été classés à l’origine en fonction de leur morphologie en proérythroblastes, basophiles, polychromatiques et orthochromatiques. L’avènement de la cytométrie en flux a permis leur tri prospectif et leur isolement en fonction de la taille des cellules (mesurée par diffusion directe, FSC) et de deux marqueurs de surface cellulaire, CD71 et Ter11911,12,13 (Figure 1). Cette approche et des approches similaires de cytométrie en flux 14 ont révolutionné l’étude des aspects moléculaires et cellulaires de l’ETD, permettant une analyse spécifique au stade de développement des érythroblastes in vivo et in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L’approche CD71/Ter119 est maintenant couramment utilisée dans l’analyse des précurseurs érythroïdes.
Jusqu’à récemment, une approche cytométrique en flux similaire et accessible pour l’isolement prospectif direct et de haute pureté de CFU-e et BFU-e à partir de tissus de souris a échappé aux chercheurs. Au lieu de cela, les chercheurs ont utilisé des stratégies de cytométrie en flux qui n’isolent qu’une fraction de ces progéniteurs, souvent en présence de cellules non érythroïdes qui co-purifient dans les mêmes sous-ensembles cytométriquesen flux 21. Par conséquent, l’étude de BFU-e et CFU-e s’est limitée aux systèmes de différenciation in vitro qui dérivent et amplifient BFU-e et CFU-e à partir de progéniteurs antérieurs de la moelle osseuse. Il est alors possible d’appliquer des stratégies de cytométrie en flux qui distinguent CFU-e de BFU-e dans ces cultures enrichies en progéniteurs érythroïdes22,23. Une autre approche utilise l’UFC-e et l’UFB-e fœtales, qui sont hautement enrichies en la fraction Ter119-négative du foie fœtal de souris au milieu de la gestation 10,24,25. Cependant, aucune de ces approches ne permet d’étudier l’état physiologique in vivo de l’UFC-e et de l’UFC-e chez l’adulte. L’ampleur du défi peut être appréciée si l’on se souvient que, sur la base des essais de formation de colonies, ces cellules sont présentes dans la moelle osseuse adulte à une fréquence de seulement 0,025% et 0,3%, respectivement6.
Le protocole décrit ici est une nouvelle approche de cytométrie en flux basée sur l’analyse transcriptomique unicellulaire de cellules de moelle osseuse de souris Kit+ fraîchement récoltées (Kit est exprimé par toutes les premières populations progénitrices de la moelle osseuse)1. Notre approche contient certains marqueurs de surface cellulaire qui étaient déjà utilisés par Pronk et al.21,26. Des transcriptomes unicellulaires ont été utilisés pour déterminer des combinaisons de marqueurs de surface cellulaire qui identifient les progéniteurs érythroïdes et autres progéniteurs hématopoïétiques précoces (Figure 2). Plus précisément, la fraction CD55+ des cellules Kit+ de lignée négative peut être subdivisée en cinq populations, dont trois produisent des segments contigus de la trajectoire érythroïde (figure 2). Les identités transcriptomiques de chacune de ces populations ont été confirmées par tri, suivi d’un scRNAseq et d’une projection des transcriptomes unicellulaires triés sur la carte transcriptomique originale (l’expression génique dans chacune des cinq populations et l’ensemble des données sur la moelle osseuse peuvent être explorés dans https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Le potentiel de devenir cellulaire de chacune des populations a été confirmé à l’aide d’essais traditionnels de formation de colonies (figure 2), ainsi que d’un nouveau test de devenir unicellulaire à haut débit 1,27. Ces analyses montrent que la nouvelle approche de cytométrie en flux permet d’isoler de haute pureté tous les progéniteurs BFU-e et CFU-e de la moelle osseuse et de la rate adultes fraîches. Plus précisément, la population 1 (P1) ne contient que l’UFC-e et aucun autre progéniteur hématopoïétique, et la population 2 (P2) contient tous les progéniteurs BFU-e de la moelle osseuse et un petit nombre d’UFC-e mais aucun autre progéniteur1. Le protocole détaillé ci-dessous est illustré par un exemple d’expérience chez des souris qui ont reçu une injection de solution saline ou de l’hormone stimulant l’érythropoïèse érythropoïétine (Epo).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L large orifice tips</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1011-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557395</td>
			<td>M1/70 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553784</td>
			<td>1D3 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553045</td>
			<td>RM4-5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553029</td>
			<td>53-6.7 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123106</td>
			<td>BM8 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>RB6-8C5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>TER-119 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma aldritch</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital DIVA hardware and software for LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>version 10</td>
			<td>Flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NewlineNY Stainless Steel Hand Masher &#38; Bowl, Mortar and Pestle Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD105 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>120408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 10x Solution</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480016</td>
			<td>Magnetic beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry

Les premiers progéniteurs érythroïdes ont été définis à l’origine par leur potentiel de formation de colonies in vitro et classés en « unités » formant des éclatements et des colonies connues sous le nom de BFU-e et CFU-e. Jusqu’à récemment, il n’existait pas de méthodes pour l’isolement prospectif direct et complet des progéniteurs BFU-e et CFU-e purs de la moelle osseuse de souris adulte fraîchement isolée. Pour combler cette lacune, un ensemble de données monocellulaire RNA-seq (scRNAseq) de moelle osseuse de souris a été analysé pour l’expression de gènes codant pour des marqueurs de surface cellulaire. Cette analyse a été combinée à des essais de devenir cellulaire, ce qui a permis le développement d’une nouvelle approche cytométrique en flux qui identifie et permet l’isolement de sous-ensembles complets et purs de progéniteurs BFU-e et CFU-e dans la moelle osseuse ou la rate de souris. Cette approche identifie également d’autres sous-ensembles de progéniteurs, y compris des sous-ensembles enrichis en potentiels basophiles/mastocytes et mégacaryocytaires. La méthode consiste à marquer des cellules fraîches de la moelle osseuse ou de la rate avec des anticorps dirigés contre Kit et CD55. Les progéniteurs qui expriment ces deux marqueurs sont ensuite subdivisés en cinq populations principales. La population 1 (P1 ou UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/CD105 faible/CD71 élevé/élevé) contient tous les progéniteurs de l’UFC-e et peut être subdivisée en P1-faible (CD71med CD150 élevé) et P1-hi (CD71 élevé CD150faible), correspondant respectivement au début et à la fin de l’UFC-e; La population 2 (P2 ou BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 faible/CD71élevé faible CD150) contient tous les progéniteurs BFU-e; La population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/CD105élevé/CD150 faibleCD41 faible) est enrichie pour les progéniteurs basophiles/mastocytes; La population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 élevé/CD150faible à CD41+) est enrichie en progéniteurs mégacaryocytaires; et la population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/CD105 élevé/CD150faible CD41-) contient des progéniteurs à potentiel érythroïde, basophile/mastocytes et mégacaryocytaire (EBMP) et érythroïdes/mégacaryocytaires/basophiles. Cette nouvelle approche permet une plus grande précision lors de l’analyse des progéniteurs érythroïdes et autres progéniteurs hématopoïétiques et permet également de faire référence à des informations de transcriptome pour chaque population définie cytométriquement en flux.

Le protocole décrit une approche cytométrique en flux pour identifier les UFC-es et les UFC-es dans les cellules de moelle osseuse et de rate fraîchement récoltées. Cela commence par la récolte de BM fraîche et de rate de souris et la mise immédiatement du tissu sur la glace. Toutes les procédures sont effectuées dans le froid pour préserver la viabilité cellulaire. Les cellules sont marquées avec un cocktail d’anticorps « lignée » qui permet l’exclusion de toutes les cellules exprimant des marqueurs ...

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Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Ce protocole permet l’identification et l’isolement des progéniteurs érythroïdes BFU-E et CFU-E directement à partir de tissus de souris fraîchement récoltés comme la moelle osseuse et la rate. En utilisant cette technique, nous pouvons isoler des populations pures de progéniteurs érythroïdes, ce qui n’était pas possible avec les protocoles d’écoulement précédents. Cette méthode améliore considérablement notre capacité à étudier des modèles murins de maladies érythroïdes en permettant l’isolement des progéniteurs pour de nombreuses expériences en aval.Pour commencer, placez les fémurs et le tibia fraîchement disséqués directement dans un tampon de coloration à froid ou SB-5 et gardez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à extraire la moelle osseuse. Placez un mortier stérilisé propre sur de la glace dans un seau et transférez les os dans le mortier. À l’aide des ciseaux à dissection, coupez environ 1 millimètre des extrémités de chaque os.Utilisez une seringue de 3 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 26 contenant du SB-5 pour rincer la moelle des os et la recueillir dans le mortier et répétez le processus 3 à 5 fois en utilisant un tampon frais à chaque fois jusqu’à ce que les os apparaissent incolores. Filtrez la moelle rincée à travers un maillage de 100 micromètres et recueillez les cellules dans un tube centrifuge de 50 millilitres placé sur de la glace. Ensuite, utilisez le mortier et le pilon pour écraser les os rincés dans 5 à 10 millilitres de SB-5.Filtrer le mélange d’os broyés et tamponner à travers la crépine cellulaire de 100 micromètres pour le mettre en commun avec les cellules précédemment collectées. Installez un filtre maillé de 100 micromètres sur un tube centrifuge vide de 50 millilitres placé sur de la glace. Placez une seule rate sur le filtre à mailles et ajoutez 0,5 à 1 millilitre de SB-5 à la rate pour vous assurer qu’elle ne sèche pas.À l’aide du côté en caoutchouc d’un piston de seringue de 3 ou 5 millilitres, écrasez la rate à travers le treillis. Ajouter plus de SB-5, 5 millilitres à la fois, et continuer à écraser jusqu’à ce que toutes les cellules aient été collectées dans le tube. Préparer une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas les cellules collectées avec 2 millilitres de SB-5 à l’aide d’une grande pointe d’orifice.Colorer les contrôles de fluorescence moins un ou FMO en ajoutant tous les anticorps sauf l’anticorps homonyme du FMO à la suspension cellulaire dans le tube FACS. Pour colorer les témoins monocolores, ajoutez un seul anticorps à la suspension cellulaire dans le tube FACS. Vortex chaque tube de contrôle pendant 2 à 3 secondes à 3000 tr / min, puis incuber à 4 degrés Celsius en se balançant pendant 2,5 heures dans l’obscurité.Après l’incubation, lavez les cellules avec SB-5 et comportez le volume de la suspension cellulaire à 4 millilitres avec SB-5. Faites tourner les cellules à 900 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius et aspirez le surnageant. Re-suspendez les commandes non tachées et toutes les commandes unicolores dans 300 microlitres de SB-5 et filtrez à travers un treillis filtrant de 40 micromètres dans de nouveaux tubes FACS.Fabriquer une solution DAPI SB-5 en diluant le stock DAPI dans un rapport de 1 à 10 000 dans SB-5. Re-suspendez le FMOS dans 1,8 millilitre de DAPI SB-5 et DAPI monocolore contrôle dans 300 microlitres de DAPI SB-5, puis filtrez-les à travers un treillis filtrant de 40 micromètres dans de nouveaux tubes FACS. Après avoir ajouté le mélange principal d’anticorps à chaque échantillon, vortex des tubes pendant 2 à 3 secondes à 3000 tr/min suivi d’une incubation à 4 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 2,5 heures dans les conditions de bascule.Après avoir lavé les cellules comme démontré précédemment, remettre les échantillons en suspension dans 1,8 millilitre de DAPI SB-5 et filtrer à travers un filtrage de 40 micromètres dans un nouveau tube FACS et analyser les échantillons à l’aide d’un cystomètre. Utilisez la dispersion vers l’avant pour éliminer les débris en fonction de leur taille, puis utilisez l’histogramme de la hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant pour exclure les agrégats de cellules et sélectionner des cellules individuelles. Répétez l’exclusion avec l’histogramme de la hauteur de diffusion latérale par rapport à la zone de diffusion latérale.Excluez les cellules mortes en bloquant les cellules positives pour DAPI. Sélectionnez la lignée négative TUR one 19 cellules positives de kit négatif. Et parmi ceux-ci, sélectionnez une sous-population qui exprime la DC 55.Subdiviser la lignée négative TUR one 19, kit négatif, positif, CD 55 cellules positives en 2 populations principales, P six et P sept basées sur l’expression de CD 49 F et CD 1 0 5. Maintenant basé sur l’expression de DC 150 et DC 41, subdiviser P 6 en P 3, P 4 et P 5. De même, sur la base de l’expression de la DC 150 et de la DC 71, subdiviser P 7 en BFUE, CFUE précoce et CFUE tardive.Dans la présente étude, des unités d’éclatement et de formation de colonies ont été identifiées à partir des cellules de moelle osseuse et de rate fraîchement récoltées. Après 72 heures d’érythropoïétine, ou injection de véhicule chez les souris, la stimulation de l’érythropoïétine a montré une expansion de la colonie précoce et tardive formant des populations unitaires P 1 faible et P 1 élevée dans les cellules de moelle osseuse et de rate récoltées. La réponse des progéniteurs de la moelle osseuse et de la rate à l’érythropoïétine in vivo a également montré un nombre plus élevé de cellules dans les colonies précoces et tardives formant des populations unitaires P 1 faible et P 1 élevée, par rapport au contrôle du véhicule.Il est très important de générer une suspension unicellulaire avant de marquer les cellules avec des anticorps. Cela peut être réalisé en pipetant de haut en bas à plusieurs reprises et en incluant l’EDTA dans le tampon. Les progéniteurs purifiés peuvent être utilisés pour toute analyse cellulaire et moléculaire en aval.Par exemple, la transcriptomique unicellulaire, l’atesque, les tests de colonies et la biochimie. Cette technique nous a aidés à tester les prédictions d’expériences de séquençage d’ARN unicellulaire.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Recherche

Biologie du développement

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isoler et analyse des cellules du pancréas Mesenchyme par cytométrie de flux

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansion et adipogénèse Induction de progéniteurs d&#39;adipocytes à partir de tissus adipeux périvasculaires isolés par tri magnétique de cellules activées

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolement et caractérisation de cardiaques cellules stromales mésenchymateuses d’endomyocardique Bioptic échantillons de Patients de la cardiomyopathie arythmogène

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Diriger la lignée reprogrammation de fibroblastes de souris adulte de progéniteurs érythroïdes

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Cytométrie en cellules vivantes en temps réel d’enquêter sur l’Influx calcique, la Formation de pores et phagocytose par les récepteurs P2X7 dans des cellules progénitrices neurales adultes

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...