Name: identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH R01DK130498, R01DK120639 ו- R01HL141402

כל הניסויים נערכו בהתאם לפרוטוקולים של בעלי חיים A-1586 ו-202200017 שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן.
הערה: שני פרוטוקולים מפורטים כאן: ראשית, ניתוח ציטומטרי של זרימה (סעיף 1), ואחריו התאמות פרוטוקול למיון ציטומטרי ש...

<ol>
	<li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies.">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development:+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing.">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).</li><li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro.">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. , (1974).</li><li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation.">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li><li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture.">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li><li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+State+of+differentiation.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li><li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li><li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system:+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture.">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li><li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).</li><li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis.">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).</li><li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities.">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways.">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li><li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo.">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li><li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response.">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors.">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors:+BFU-E+and+CFU-E.">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal.">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li><li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis.">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li><li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro.">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li><li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia.">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action.">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li></ol>

היכולת לבודד באופן פרוספקטיבי אבות BFU-e ו-CFU-e ישירות מרקמה טרייה בעלת טוהר גבוה חמקה בעבר מהחוקרים. הגישה החדשנית שלנו, שאומתה באמצעות scRNAseq ומבחני גורל התא 1,27, מציעה כעת את הכלים לעשות זאת.
ישנן מספר נקודות מפתח לביצוע מוצלח הן של המיון והן של ה?...

ניתן לחלק את אריתרופואזיס לשני שלבים עיקריים: אריתרופואזיס מוקדם והבחנה סופנית אריתרואידית (איור 1)1,2,3. באריתרופויאזיס מוקדם, תאי גזע המטופויאטיים מתחייבים לשושלת האריתרואידים ומולידים אבות אריתרואידים מוקדמים, שזוהו לראשונה בשנות השבעים בהתבסס על פוטנציאל יצירת המושבה שלהם בתווך מוצק למחצה 4,5,6,7,8,9 . באופן כללי, אבות אריתרואידים מחולקים לשתי קטגוריות: אבות קדמונים יותר שכל אחד מהם מוליד "פרץ" (צבר גדול של אשכולות תאים אריתרואידים קטנים יותר), הנקראים "אריתרואיד יחידה יוצר פרץ" או BFU-e 4,5,6; וצאצאיהם, שכל אחד מהם יוצר אשכול או מושבה בודדים וקטנים של תאי אריתרואיד, הנקראים "אריתרואיד יחידה יוצרת מושבה" או CFU-e 7,8,9. BFU-e ו-CFU-e עדיין לא מבטאים גנים אריתרואידים סופניים ואינם ניתנים לזיהוי מורפולוגית. לאחר מספר חלוקות תא של התחדשות עצמית או התפשטות, ה-CFU-e עובר מתג שעתוק שבו מושרים גנים אריתרואידיים כגון גלובין, ובכך עובר להתמיינות מסוף אריתרואידים (ETD)1,10. במהלך ETD, אריתרובלסטים עוברים שלוש עד חמש חלוקות תאי התבגרות לפני שהם מתאחדים ליצירת רטיקולוציטים, אשר מבשילים לתאים אדומים.
אריתרובלסטים במהלך התמיינות סופנית סווגו במקור על סמך המורפולוגיה שלהם לפרואריתרובלסטים, בזופיליים, פוליכרומטיים ואורתוכרומטיים. הופעתה של ציטומטריה של זרימה אפשרה את המיון והבידוד הפרוספקטיביים שלהם בהתבסס על גודל התא (שנמדד על ידי פיזור קדימה, FSC) ושני סמני פני השטח של התא, CD71 ו-Ter11911,12,13 (איור 1). זרימה זו וגישות ציטומטריות דומות14 חוללו מהפכה בחקר ההיבטים המולקולריים והתאיים של ETD, ומאפשרות ניתוח ספציפי לשלב התפתחותי של אריתרובלסטים in vivo ו- in vitro 10,15,16,17,18,19,20. גישת CD71/Ter119 משמשת כיום באופן שגרתי בניתוח של מבשרי אריתרואידים.
עד לאחרונה, גישה ציטומטרית דומה ונגישה לזרימה לבידוד פרוספקטיבי ישיר וטהור של CFU-e ו-BFU-e מרקמת עכבר חמקה מהחוקרים. במקום זאת, חוקרים השתמשו באסטרטגיות ציטומטריות זרימה המבודדות רק חלק קטן מאבות אבותיהם, לעתים קרובות בנוכחות תאים שאינם אריתרואידים המטהרים יחד בתוך אותן תת-קבוצות ציטומטריות של זרימה21. כתוצאה מכך, החקירה של BFU-e ו- CFU-e הוגבלה למערכות הבחנה חוץ גופית הגוזרות ומגבירות את BFU-e ו- CFU-e מאבות מח עצם קודמים. לאחר מכן ניתן ליישם אסטרטגיות ציטומטריות של זרימה המבדילות בין CFU-e ל-BFU-e בתרביות מועשרות באב אריתרואידי22,23. גישה חלופית עושה שימוש ב- CFU-e ו- BFU-e עובריים, המועשרים מאוד בחלק Ter119-שלילי של כבד העובר של העכבר באמצע ההיריון 10,24,25. עם זאת, אף אחת מהגישות הללו אינה מאפשרת לחקור BFU-e ו-CFU-e בוגרים במצבם הפיזיולוגי in vivo. ניתן להעריך את גודל האתגר כאשר נזכרים כי בהתבסס על מבחני היווצרות מושבה, תאים אלה נמצאים במח העצם הבוגר בתדירות של 0.025% ו-0.3% בלבד,בהתאמה 6.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה ציטומטרית חדשנית של זרימה המבוססת על אנליזה של תעתיק חד-תאי של תאי מח עצם של עכבר Kit+ שזה עתה נקטפו (הערכה מתבטאת על ידי כל אוכלוסיות האב הקדום של מח העצם)1. הגישה שלנו מכילה כמה סמני פני שטח של תאים שכבר היו בשימוש על ידי Pronk et al.21,26. תעתיקים חד-תאיים שימשו לקביעת שילובים של סמני פני השטח של התא שמזהים אריתרואידים ואבות המטופויאטיים מוקדמים אחרים (איור 2). באופן ספציפי, חלק CD55+ של תאי Kit+ שליליים לשושלת (Lin-) עשוי להיות מחולק לחמש אוכלוסיות, ששלוש מהן מניבות מקטעים רציפים של מסלול האריתרואידים (איור 2). הזהויות השעתוק של כל אחת מאוכלוסיות אלה אושרו על ידי מיון, ולאחר מכן על ידי scRNAseq והשלכה של תעתיקים חד-תאיים ממוינים בחזרה למפת התעתיק המקורית (ניתן לחקור את ביטוי הגנים בכל אחת מחמש האוכלוסיות ואת כל מערך הנתונים של מח העצם ב-https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . פוטנציאל גורל התאים של כל אחת מהאוכלוסיות אושר באמצעות מבחני היווצרות מושבות מסורתיים (איור 2), כמו גם בדיקת גורל חד-תאית חדשהבתפוקה גבוהה 1,27. ניתוחים אלה מראים כי הגישה הציטומטרית החדשה של זרימה גורמת לבידוד בטוהר גבוה של כל אבות BFU-e ו- CFU-e של מח עצם וטחול בוגרים טריים. באופן ספציפי, אוכלוסייה 1 (P1) מכילה רק CFU-e ולא אבות המטופויאטיים אחרים, ואוכלוסיה 2 (P2) מכילה את כל אבות BFU-e של מח העצם ומספר קטן של CFU-e אך לא אבות אחרים1. הפרוטוקול המפורט שלהלן מודגם עוד יותר בניסוי לדוגמה בעכברים שהוזרק להם מי מלח או עם ההורמון המגרה אריתרופואזיס אריתרופואיטין (Epo).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L large orifice tips</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1011-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557395</td>
			<td>M1/70 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553784</td>
			<td>1D3 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553045</td>
			<td>RM4-5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553029</td>
			<td>53-6.7 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123106</td>
			<td>BM8 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>RB6-8C5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>TER-119 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma aldritch</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital DIVA hardware and software for LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>version 10</td>
			<td>Flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NewlineNY Stainless Steel Hand Masher &#38; Bowl, Mortar and Pestle Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD105 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>120408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 10x Solution</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480016</td>
			<td>Magnetic beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry

אבות אריתרואידים מוקדמים הוגדרו במקור על ידי פוטנציאל יצירת המושבה שלהם במבחנה וסווגו ל"יחידות" יוצרות התפרצויות ויוצרות מושבות הידועות בשם BFU-e ו- CFU-e. עד לאחרונה, שיטות לבידוד פרוספקטיבי ישיר ומלא של אבות טהורים של BFU-e ו- CFU-e ממח עצם של עכבר בוגר שבודד זה עתה לא היו זמינות. כדי להתמודד עם פער זה, נותח מערך נתונים חד-תאי של RNA-seq (scRNAseq) של מח עצם עכבר לביטוי גנים המקודדים עבור סמני פני השטח של התא. ניתוח זה שולב עם מבחני גורל התא, ואיפשר פיתוח של גישה ציטומטרית חדשנית לזרימה המזהה ומאפשרת בידוד של תת-קבוצות שלמות וטהורות של אבות BFU-e ו-CFU-e במח עצם או טחול של עכבר. גישה זו מזהה גם תת-קבוצות אבות אחרות, כולל תת-קבוצות מועשרות עבור תאים בזופיליים/פיטום ופוטנציאלים מגה-קריוציטיים. השיטה כוללת תיוג של תאי מח עצם או טחול טריים עם נוגדנים המכוונים לקיט ו-CD55. אבות אבות המבטאים את שני הסמנים הללו מחולקים לאחר מכן לחמש אוכלוסיות עיקריות. אוכלוסייה 1 (P1 או CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) מכילה את כל אבות ה-CFU-e ועשויה להיות מחולקת ל-P1-low (CD71 med CD150גבוה) ו-P1-hi (CD71גבוה CD150נמוך), המתאים ל-CFU-e מוקדם ומאוחר, בהתאמה; אוכלוסייה 2 (P2 או BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105med/high CD71נמוך CD150 גבוה) מכילה את כל אבות ה-BFU-e; אוכלוסייה P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/גבוה CD105 med/נמוך CD150נמוך CD41 נמוך) מועשרת עבור אבות אבזם של תאי בזופיל/פיטום; אוכלוסייה 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150גבוה CD41+) מועשרת עבור אבות מגה-קריוציטים; ואוכלוסיה 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150גבוה CD41-) מכילה אבות עם אריתרואיד, תא בזופיל/פיטום, ופוטנציאל מגה-קריוציטי (EBMP) ואריתרואיד/מגה-קריוציטית/בזופילים רב-פוטנציאליים (MPPs). גישה חדשנית זו מאפשרת דיוק רב יותר בעת ניתוח אריתרואידים ואבות המטופויאטיים אחרים וגם מאפשרת התייחסות למידע תעתיק עבור כל אוכלוסייה מוגדרת ציטומטרית של זרימה.

הפרוטוקול מתאר גישה ציטומטרית של זרימה לזיהוי BFU-es ו-CFU-es בתאי מח עצם וטחול שזה עתה נקטפו. זה מתחיל בקצירת BM וטחול טריים מעכברים ומיד הנחת הרקמה על קרח. כל ההליכים מתבצעים בקור כדי לשמור על כדאיות התא. התאים מסומנים בקוקטייל נוגדנים "שושלת" המאפשר הרחקה של כל התאים המבטאים סמנים של שושלות דם מ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי ובידוד של אבות אריתרואידים מסוג BFU-E ו-CFU-E ישירות מרקמת עכבר שזה עתה נקטפה כמו מח עצם וטחול. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לבודד אוכלוסיות טהורות של אבות אריתרואידים, דבר שלא היה אפשרי עם פרוטוקולי הזרימה הקודמים. שיטה זו משפרת מאוד את יכולתנו לחקור מודלים של עכברי מחלות אריתרואידים בכך שהיא מאפשרת בידוד אבות לניסויים רבים במורד הזרם.כדי להתחיל, הניחו את עצם הירך והטיביה שזה עתה נותחו ישירות לתוך חיץ מכתים קר או SB-5 והשאירו את הצינורות על הקרח עד שיהיו מוכנים לחילוץ מח העצם. מניחים טיט מעוקר נקי על קרח בדלי ומעבירים את העצמות לטיט. בעזרת מספריים לנתיחה, יש לחתוך קצוות של כמילימטר אחד מכל עצם.השתמש במזרק 3 מיליליטר המצויד במחט 26 מדים המכילה SB-5 כדי לשטוף את המוח מהעצמות ולאסוף אותו לתוך חומר המליטה ולחזור על התהליך 3 עד 5 פעמים באמצעות חיץ טרי בכל פעם עד שהעצמות נראות חסרות צבע. מסננים את המח הסמוק דרך רשת של 100 מיקרומטר ואוספים את התאים בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המונח על קרח. לאחר מכן, השתמש בטיט ובמזיק כדי למחוץ את העצמות הסמוקות ב 5 עד 10 מיליליטר של SB-5.מסננים את תערובת העצמות המרוסקות וחוצץ דרך מסננת התאים בגודל 100 מיקרומטר כדי להצטבר עם התאים שנאספו בעבר. הגדר מסנן רשת של 100 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה ריק של 50 מיליליטר המונח על קרח. מניחים טחול בודד על מסנן הרשת ומוסיפים 0.5 עד 1 מיליליטר של SB-5 לטחול כדי להבטיח שהוא לא יתייבש.באמצעות צד הגומי של בוכנה מזרק 3 או 5 מיליליטר, מועכים את הטחול דרך הרשת. מוסיפים עוד SB-5, 5 מיליליטר בכל פעם, וממשיכים למעוך עד שכל התאים נאספו בצינור. הכן תרחיף חד-תאי על-ידי צנרת מעלה ומטה של התאים שנאספו עם 2 מיליליטר של SB-5 באמצעות קצה פתח גדול.הכתימו את הפלואורסצנציה מינוס אחד או FMO על ידי הוספת כל הנוגדנים למעט הנוגדן הנושא את שמו של ה- FMO לתרחיף התאים בצינור FACS. כדי להכתים את הפקדים בצבע יחיד, הוסף נוגדן יחיד לתרחיף התאים בצינור FACS. מערבולות כל צינור בקרה במשך 2 עד 3 שניות ב-3000 סל"ד ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס מתנדנדת במשך 2.5 שעות בחושך.לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם SB-5 ולהפוך את נפח ההשעיה התא ל 4 מיליליטר עם SB-5. סובבו את התאים ב-900 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושאפו את הסופר-נטנט. השעה מחדש את הפקדים הלא מוכתמים ואת כל הפקדים בצבע יחיד ב-300 מיקרוליטרים של SB-5 וסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לצינורות FACS חדשים.בצע פתרון DAPI SB-5 על ידי דילול מלאי DAPI ביחס של 1 עד 10, 000 ב- SB-5. השעה מחדש את ה-FMOS ב-1.8 מיליליטר של DAPI SB-5 ובקרת צבע יחיד של DAPI ב-300 מיקרוליטרים של DAPI SB-5, ולאחר מכן סנן אותם דרך רשת סינון של 40 מיקרומטר לתוך צינורות FACS חדשים. לאחר הוספת תערובת מאסטר הנוגדנים לכל דגימה, מערבבים את הצינורות במשך 2 עד 3 שניות ב-3000 סל"ד ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 2.5 שעות במצב נדנדה.לאחר שטיפת התאים כפי שהוכח קודם לכן, השהה מחדש את הדגימות ב-1.8 מיליליטר של DAPI SB-5 וסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS חדש ונתח את הדגימות באמצעות ציסטומטר. השתמש בפיזור הקדמי כדי להסיר את הפסולת בהתבסס על גודל, ולאחר מכן השתמש בהיסטוגרמה של גובה הפיזור קדימה לעומת היסטוגרמה של אזור הפיזור קדימה כדי לא לכלול צברי תאים ולבחור תאים בודדים. חזור על ההחרגה עם גובה הפיזור הצדדי לעומת ההיסטוגרמה של אזור הפיזור הצדדי.אל תכלול את התאים המתים על-ידי מיון התאים החיוביים עבור DAPI. בחר את השושלת שלילית TUR אחד 19 תאים חיוביים הערכה שלילית. ומתוך אלה בחר תת-אוכלוסייה המבטאת CD 55.חלקו את השושלת השלילית TUR 19, ערכה שלילית, חיובית, CD 55 תאים חיוביים ל-2 אוכלוסיות עקרוניות, P 6 ו-P 7 בהתבסס על הביטוי של CD 49 F ו-CD 1 0 5. כעת, בהתבסס על הביטוי של CD 150 ו-CD 41, חלק את P 6 בהמשך ל-P 3, P 4 ו-P 5. באופן דומה, בהתבסס על הביטוי של CD 150 ו- CD 71, חלק את P 7 בהמשך ל- BFUE, CFUE מוקדם ו- CFUE מאוחר.במחקר הנוכחי זוהו יחידות יוצרות פרץ ומושבה מתאי מח העצם והטחול שזה עתה נקטפו. לאחר 72 שעות של אריתרופואיטין, או הזרקת רכב בעכברים, גירוי אריתרופואיטין הראה התרחבות של אוכלוסיות יחידות היוצרות את המושבה המוקדמת והמאוחרת P 1 נמוך ו- P 1 גבוה בתאי מח העצם והטחול שנקטפו. התגובה של מח העצם ואבות הטחול לאריתרופואיטין in vivo הראתה גם מספר גבוה יותר של תאים במושבה המוקדמת והמאוחרת היוצרים אוכלוסיות יחידות P 1 נמוך ו- P 1 גבוה, בהשוואה לבקרת כלי רכב.חשוב ביותר ליצור תרחיף של תא בודד לפני תיוג התאים בנוגדנים. ניתן להשיג זאת על ידי צנרת למעלה ולמטה שוב ושוב ועל ידי הכללת EDTA במאגר. אבות האב המטוהרים יכולים לשמש לכל אנליזה תאית ומולקולרית במורד הזרם.לדוגמה, תעתיק תא בודד, אטסק, מבחני מושבה וביוכימיה. טכניקה זו סייעה לנו לבחון את התחזיות מניסויי RNA-seq חד-תאיים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

בידוד ואפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מדגימות Bioptic Endomyocardial של שריר הלב Arrhythmogenic חולים

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת כדי לחקור סידן זרם היווצרות נקבובית, Phagocytosis על ידי רצפטורים P2X7 ובתאים עצבית למבוגרים

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...