Name: identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

이 작업은 NIH 보조금 R01DK130498, R01DK120639 및 R01HL141402의 지원을 받습니다.

모든 실험은 동물 프로토콜 A-1586에 따라 수행되었으며 매사추세츠 대학 찬 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 202200017.
참고: 여기에는 두 가지 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다: 첫째, 유세포 분석 분석(섹션 1), 유세포 분석 분류를 위한 프로토콜 조정(섹션 2). 아래 프로토콜은 10개 채널이 있는 유세포분석기/분류기를 사용합니다. 예제 설정은 단계 1.14.5?...

<ol>
	<li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies.">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development:+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing.">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).</li><li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro.">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. , (1974).</li><li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation.">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li><li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture.">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li><li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+State+of+differentiation.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li><li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li><li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system:+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture.">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li><li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).</li><li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis.">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).</li><li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities.">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways.">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li><li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo.">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li><li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response.">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors.">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors:+BFU-E+and+CFU-E.">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal.">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li><li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis.">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li><li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro.">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li><li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia.">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action.">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li></ol>

BFU-e 및 CFU-e 전구 세포를 고순도의 신선한 조직에서 직접 전향 적으로 분리 할 수있는 능력은 이전에 연구자를 피했습니다. scRNAseq 및 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 검증된 당사의 새로운 접근법은 이제 이를 수행할 수 있는 도구를 제공합니다.
분류 프로토콜과 분석 프로토콜을 모두 성공적으로 실행하기 위한 몇 가지 핵심 사항?...

적혈구 생성은 초기 적혈구 생성과 적혈구 말단 분화의 두 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다(그림 1)1,2,3. 초기 적혈구 생성에서 조혈 줄기 세포는 적혈구 계통에 전념하고 초기 적혈구 전구 세포를 생성하며, 이는 반고체 배지에서 집락 형성 잠재력을 기반으로 1970 년대에 처음 확인되었습니다 4,5,6,7,8,9 . 대체로 적혈구 전구 세포는 두 가지 범주로 나뉩니다 : 각각 "파열 형성 단위 적혈구"또는 BFU-e 4,5,6으로 명명 된 "파열"(더 작은 적혈구 세포 클러스터의 큰 집합체)을 일으키는 초기 전구 세포; 그리고 그들의 자손은 각각 "콜로니 형성 단위 적혈구" 또는 CFU-e 7,8,9로 명명된 하나의 작은 적혈구 세포 클러스터 또는 콜로니를 형성합니다. BFU-e 및 CFU-e는 아직 말단 적혈구 유전자를 발현하지 않으며 형태 학적으로 인식 할 수 없습니다. 다수의 자가 갱신 또는 확장 세포 분열 후, CFU-e는 글로빈과 같은 적혈구 유전자가 유도되는 전사 전환을 거쳐 적혈구 말단 분화(ETD)1,10로 전환됩니다. ETD 동안, 적혈구 세포는 적혈구로 성숙하는 망상 적혈구를 형성하기 전에 3-5 개의 성숙한 세포 분열을 거칩니다.
말단 분화 중 적혈구 세포는 원래 형태에 따라 전 적혈구 모세포, 호 염기성, 다색 성 및 직교 색성으로 분류되었습니다. 유세포분석법의 출현으로 세포 크기(순방향 산란, FSC로 측정)와 두 개의 세포 표면 마커인 CD71 및 Ter11911,12,13을 기반으로 전향적 분류 및 분리가 가능해졌습니다(그림 1). 이것과 유사한 유세포분석접근법(14)은 ETD의 분자 및 세포 측면의 조사에 혁명을 일으켜, 생체내 및 시험관내 10,15,16,17,18,19,20의 발달 단계 특이적 분석을 가능하게 한다. CD71/Ter119 접근법은 이제 적혈구 전구체 분석에 일상적으로 사용됩니다.
최근까지 마우스 조직에서 CFU-e 및 BFU-e의 직접적이고 고순도 전향적 분리를 위한 유사하고 접근 가능한 유세포측정 접근 방식은 연구자를 피했습니다. 대신에, 연구자들은 종종 동일한 유세포측정 서브세트21 내에서 공동-정제되는 비-적혈구 세포의 존재 하에서, 이들 전구세포의 일부만을 단리하는 유동 세포측정 전략을 사용하였다. 결과적으로, BFU-e 및 CFU-e의 조사는 초기 골수 전구 세포로부터 BFU-e 및 CFU-e를 유도하고 증폭하는 시험관 내 분화 시스템으로 제한되었다. 이어서, 이들 적혈구 전구세포-농축 배양물(22,23)에서 CFU-e와 BFU-e를 구별하는 유세포측정 전략을 적용하는 것이 가능하다. 대안적인 접근법은 태아 CFU-e 및 BFU-e를 사용하는데, 이는 임신 중기10,24,25에서 마우스 태아 간의 Ter119- 음성 분획에서 고도로 풍부합니다. 그러나 이러한 접근법 중 어느 것도 생체 내 생리적 상태에서 성인 BFU-e 및 CFU-e를 조사 할 수 없습니다. 도전의 규모는 콜로니 형성 분석에 기초하여, 이들 세포가 각각 단지 0.025% 및 0.3%의 빈도로 성인 골수에 존재한다는 것을 상기할 때 이해될 수있다6.
여기에 설명된 프로토콜은 새로 수확한 Kit+ 마우스 골수 세포의 단일 세포 전사체 분석을 기반으로 하는 새로운 유세포 분석 접근 방식입니다(키트는 골수의 모든 초기 전구 집단에서 발현됨)1. 우리의 접근법에는 Pronk et al.21,26에 의해 이미 사용되었던 일부 세포 표면 마커가 포함되어 있습니다. 단일 세포 전사체는 적혈구 및 기타 초기 조혈 전구 세포를 식별하는 세포 표면 마커의 조합을 결정하는 데 사용되었습니다 (그림 2). 특히, 계통 음성(Lin-) Kit+ 세포의 CD55+ 분획은 5개의 집단으로 세분될 수 있으며, 그 중 3개는 적혈구 궤적의 연속 세그먼트를 생성합니다(그림 2). 이들 집단 각각의 전사체 정체성은 정렬한 다음, scRNAseq 및 정렬된 단일 세포 전사체를 원래의 전사체 맵에 다시 투영하여 확인하였다(5개 집단 각각의 유전자 발현 및 전체 골수 데이터 세트는 https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html 에서 탐색할 수 있음)1 . 각 집단의 세포 운명 잠재력은 전통적인 콜로니 형성 분석(그림 2)과 새로운 고처리량 단일 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 확인되었습니다. 이러한 분석은 새로운 유세포 분석 접근법이 신선한 성인 골수 및 비장의 모든 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 고순도 분리를 초래한다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 집단 1(P1)은 CFU-e만 포함하고 다른 조혈 전구 세포는 포함하지 않으며, 집단 2(P2)는 골수의 모든 BFU-e 전구 세포와 소수의 CFU-e를 포함하지만 다른 선조1는 포함하지않는다. 아래의 상세한 프로토콜은 식염수 또는 적혈구 생성 자극 호르몬 인 에리스로포이에틴 (Epo)을 주사 한 마우스에서의 예제 실험으로 더 설명됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L large orifice tips</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1011-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557395</td>
			<td>M1/70 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553784</td>
			<td>1D3 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553045</td>
			<td>RM4-5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553029</td>
			<td>53-6.7 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123106</td>
			<td>BM8 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>RB6-8C5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>TER-119 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma aldritch</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital DIVA hardware and software for LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>version 10</td>
			<td>Flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NewlineNY Stainless Steel Hand Masher &#38; Bowl, Mortar and Pestle Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD105 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>120408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 10x Solution</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480016</td>
			<td>Magnetic beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry

초기 적혈구 전구 세포는 원래 시험관 내에서 콜로니 형성 잠재력에 의해 정의되었으며 BFU-e 및 CFU-e로 알려진 파열 형성 및 집락 형성 "단위"로 분류되었습니다. 최근까지, 새로 분리된 성인 마우스 골수로부터 순수한 BFU-e 및 CFU-e 전구세포를 직접 전향적이고 완전히 분리하는 방법은 이용 가능하지 않았다. 이러한 격차를 해소하기 위해 마우스 골수의 단일 세포 RNA-seq (scRNAseq) 데이터 세트를 분석하여 세포 표면 마커를 암호화하는 유전자의 발현을 분석했습니다. 이 분석은 세포 운명 분석과 결합되어 마우스 골수 또는 비장에서 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 완전하고 순수한 하위 집합을 식별하고 분리할 수 있는 새로운 유세포 분석 접근법을 개발할 수 있었습니다. 이 접근법은 또한 호염기구/비만 세포 및 거핵구 전위에 대해 풍부한 하위세트를 포함하는 다른 전구 하위세트를 식별한다. 이 방법은 신선한 골수 또는 비장 세포를 Kit 및 CD55로 향하는 항체로 표지하는 것으로 구성됩니다. 이 두 마커를 모두 발현하는 전구 세포는 5 개의 주요 집단으로 세분됩니다. 집단 1(P1 또는 CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high)은 모든 CFU-e 전구 세포를 포함하며, 각각 초기 및 후기 CFU-e에 해당하는 P1-low(CD71med CD150 high) 및 P1-hi(CD71 high CD150low)로 더 세분화될 수 있다. 인구 2 (P2 또는 BFU-e, 키트 + CD55 + CD49f med / 낮은 CD105 med / 높은 CD71 낮은 CD150높음)는 모든 BFU-e 전구 세포를 포함합니다. 집단 P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f 중간/높은 CD105 중간/낮은 CD150낮은 CD41낮음)은 호염기구/비만 세포 전구체에 대해 풍부합니다. 인구 4 (P4, Kit + CD55 + CD49f 중간 / 높은 CD105중간 / 낮은 CD150높은 CD41 +)는 거대 핵 세포 전구 세포에 대해 풍부합니다. 및 인구 5(P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-)에는 적혈구, 호염기구/비만 세포 및 거대핵구 전위(EBMP) 및 적혈구/거핵세포/호염기구 편향 다중 전위 전구체(MPP)가 있는 전구체가 포함됩니다. 이 새로운 접근 방식은 적혈구 및 기타 조혈 전구 세포를 분석할 때 더 높은 정밀도를 허용하고 유세포 측정적으로 정의된 각 집단에 대한 전사체 정보를 참조할 수도 있습니다.

이 프로토콜은 새로 수확한 골수 및 비장 세포에서 BFU-es 및 CFU-es를 식별하기 위한 유세포 분석 접근 방식을 설명합니다. 생쥐에서 신선한 BM과 비장을 채취하고 즉시 조직을 얼음 위에 놓는 것으로 시작합니다. 모든 절차는 세포 생존력을 보존하기 위해 추위에서 수행됩니다. 세포는 분화된 혈통의 마커를 발현하는 모든 세포의 배제를 허용하는 "계통" 항체 칵테일로 표지된다 (유동 세포측정 분석...

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Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

이 프로토콜을 사용하면 골수 및 비장과 같이 새로 수확한 마우스 조직에서 직접 BFU-E 및 CFU-E 적혈구 전구세포를 식별하고 분리할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 이전 흐름 프로토콜에서는 불가능했던 적혈구 전구 세포의 순수한 개체군을 분리 할 수 있습니다. 이 방법은 많은 다운스트림 실험에서 전구 분리를 허용함으로써 적혈구 질환 마우스 모델을 연구하는 능력을 크게 향상시킵니다.시작하려면 새로 해부 된 대퇴골과 경골을 차가운 염색 완충액 또는 SB-5에 직접 넣고 골수를 추출 할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 양동이의 얼음 위에 깨끗한 멸균 모르타르를 놓고 뼈를 박격포로 옮깁니다. 해부 가위를 사용하여 각 뼈의 약 1mm 끝을 잘라냅니다.SB-5가 들어있는 26 게이지 바늘이 장착 된 3 밀리리터 주사기를 사용하여 골수를 뼈에서 씻어 내고 절구에 모으고 뼈가 무색으로 보일 때까지 매번 신선한 완충액을 사용하여 3-5 회 반복합니다. 플러시 된 골수를 100 마이크로 미터 메쉬를 통해 여과하고 얼음 위에 놓인 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 세포를 수집합니다. 다음으로, 박격포와 유봉을 사용하여 5-10 밀리리터의 SB-5로 플러시 된 뼈를 분쇄하십시오.분쇄된 뼈의 혼합물을 여과하고 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 완충액을 여과하여 이전에 수집된 세포와 풀링합니다. 얼음 위에 놓인 빈 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 100 마이크로 미터 메쉬 필터를 설치하십시오. 메쉬 필터에 단일 비장을 놓고 0.5-1 밀리리터의 SB-5를 비장에 추가하여 건조되지 않도록합니다.3 또는 5 밀리리터 주사기 플런저의 고무면을 사용하여 비장을 메쉬를 통해 으깨십시오. 한 번에 5 밀리리터의 SB-5를 더 추가하고 모든 세포가 튜브에 수집 될 때까지 계속 으깨십시오. 큰 오리피스 팁을 사용하여 2 밀리리터의 SB-5로 수집된 세포를 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.FMO의 이름을 딴 항체를 제외한 모든 항체를 FACS 튜브의 세포 현탁액에 첨가하여 형광 마이너스 1 또는 FMO 대조군을 염색합니다. 단색 대조군을 염색하려면 FACS 튜브의 세포 현탁액에 단일 항체를 추가합니다. 각 컨트롤 튜브를 3000RPM에서 2-3초 동안 소용돌이시킨 다음 섭씨 4도에서 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들면서 배양합니다.배양 후 세포를 SB-5로 세척하고 SB-5로 세포 현탁액의 부피를 4 밀리리터로 구성합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 900g으로 회전시키고 상청액을 흡인합니다. 염색되지 않은 모든 단색 컨트롤을 300마이크로리터의 SB-5에 다시 현탁하고 40마이크로미터 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다.SB-5에서 DAPI 스톡을 1에서 10, 000의 비율로 희석하여 DAPI SB-5 솔루션을 만듭니다. 1.8 밀리리터의 DAPI SB-5 및 300 마이크로 리터의 DAPI SB-5에 DAPI 단색 제어에 FMOS를 다시 현탁 한 다음 40 마이크로 미터 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다. 항체 마스터 믹스를 각 샘플에 첨가한 후, 튜브를 3000rpm에서 2 내지 3초 동안 와동시킨 다음, 흔들림 조건에서 2.5시간 동안 암실에서 섭씨 4도에서 배양한다.이전에 입증된 대로 세포를 세척한 후 샘플을 1.8밀리리터의 DAPI SB-5에 다시 현탁시키고 40마이크로미터 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 여과하고 방광계를 사용하여 샘플을 분석합니다. 전방 산란을 사용하여 크기에 따라 파편을 제거한 다음 전방 산란 높이 대 전방 산란 영역 히스토그램을 사용하여 세포 응집체를 제외하고 단일 셀을 선택합니다. 측면 산란 높이 대 측면 산란 영역 히스토그램으로 제외를 반복합니다.DAPI에 대한 양성 세포를 게이팅하여 죽은 세포를 제외합니다. 계통 음성 TUR 19 음성 키트 양성 세포를 선택합니다. 그리고 이들로부터 CD 55를 표현하는 하위 집단을 선택하십시오.계통을 음성 TUR 19개, 음성 키트, 양성, CD55 양성 세포를 2개의 주요 집단, P6 및 P7개의 CD49F 및 CD1 0 5의 발현에 기초하여 세분한다. 이제 CD(150) 및 CD(41)의 발현에 기초하여, P6을 P3, P4 및 P5로 더 세분화한다. 유사하게, CD(150) 및 CD(71)의 발현에 기초하여, P7을 BFUE, 초기 CFUE 및 후기 CFUE로 더 세분화한다.본 연구에서, 파열 및 콜로니 형성 단위는 새로 수확 된 골수 및 비장 세포로부터 확인되었다. 마우스에서 72시간의 에리트로포이에틴 또는 비히클 주사 후, 에리트로포이에틴 자극은 수확된 골수 및 비장 세포에서 초기 및 후기 콜로니 형성 단위 집단 P1 낮음 및 P1 높음의 확장을 보였다. 생체내에서 에리트로포이에틴에 대한 골수 및 비장 전구세포의 반응은 또한 비히클 대조군에 비해 초기 및 후기 콜로니 형성 단위 집단에서 더 높은 수의 세포 P1 및 높은 P1을 보였다.세포를 항체로 표지하기 전에 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 가장 중요합니다. 이는 위아래로 반복적으로 피펫팅하고 버퍼에 EDTA를 포함시켜 달성할 수 있습니다. 정제된 전구체는 모든 다운스트림 세포 및 분자 분석에 사용할 수 있습니다.예를 들어, 단일 세포 전사체학, atesque, 콜로니 분석 및 생화학. 이 기술은 단일 세포 RNA-seq 실험의 예측을 테스트하는 데 도움이되었습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...