Name: identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Este trabajo es apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK130498, R01DK120639 y R01HL141402

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos animales A-1586 y 202200017 aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts.
NOTA: Aquí se detallan dos protocolos: primero, análisis citométrico de flujo (sección 1), seguido de ajustes de protocolo para la clasificación por citometría de flujo (sección 2). El siguiente protocolo utiliza un citómetro/clasificador de flujo con 10 ...

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	<li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies.">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development:+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing.">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).</li><li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro.">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. , (1974).</li><li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation.">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li><li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture.">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li><li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+State+of+differentiation.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li><li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li><li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system:+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture.">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li><li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).</li><li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis.">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).</li><li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities.">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways.">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li><li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo.">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li><li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response.">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors.">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors:+BFU-E+and+CFU-E.">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal.">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li><li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis.">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li><li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro.">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li><li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia.">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action.">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li></ol>

La capacidad de aislar prospectivamente progenitores de BFU-e y CFU-e directamente de tejido fresco con alta pureza había eludido previamente a los investigadores. Nuestro nuevo enfoque, validado utilizando scRNAseq y ensayos de destino celular 1,27, ahora ofrece las herramientas para hacer esto.
Hay una serie de puntos clave para ejecutar con éxito tanto la clasificación como los protocolos analíticos. Primero, las células deben ...

La eritropoyesis puede dividirse en dos fases principales: eritropoyesis precoz y diferenciación terminal eritroide (Figura 1)1,2,3. En la eritropoyesis temprana, las células madre hematopoyéticas se comprometen con el linaje eritroide y dan lugar a progenitores eritroides tempranos, que se identificaron por primera vez en la década de 1970 en función de su potencial de formación de colonias en medio semisólido 4,5,6,7,8,9 . En términos generales, los progenitores eritroides se dividen en dos categorías: progenitores anteriores que dan lugar a un "estallido" (un gran agregado de grupos de células eritroides más pequeños), llamado "eritroide unitario formador de estallido" o BFU-e 4,5,6; y su progenie, que forman cada uno un único grupo o colonia de células eritroides pequeñas, denominadas "unidad formadora de colonias eritroides" o UFC-e 7,8,9. BFU-e y CFU-e aún no expresan genes eritroides terminales y no son morfológicamente reconocibles. Después de una serie de divisiones celulares de auto-renovación o expansión, la UFC-e experimenta un cambio transcripcional en el que se inducen genes eritroides como globinas, pasando así a la diferenciación terminal eritroide (ETD)1,10. Durante la ETD, los eritroblastos se someten a tres a cinco divisiones celulares madurativas antes de enuclearse para formar reticulocitos, que maduran en glóbulos rojos.
Los eritroblastos durante la diferenciación terminal se clasificaron originalmente en función de su morfología en proeritroblastos, basófilos, policromáticos y ortocromáticos. El advenimiento de la citometría de flujo permitió su clasificación y aislamiento prospectivo basado en el tamaño celular (medido por dispersión directa, FSC) y dos marcadores de superficie celular, CD71 y Ter11911,12,13 (Figura 1). Este y otros enfoques citométricos de flujo similares 14 han revolucionado la investigación de los aspectos moleculares y celulares de la ETD, permitiendo el análisis específico de la etapa de desarrollo de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. El enfoque CD71/Ter119 ahora se usa rutinariamente en el análisis de precursores eritroides.
Hasta hace poco, un enfoque citométrico de flujo similar y accesible para el aislamiento prospectivo directo y de alta pureza de CFU-e y BFU-e de tejido de ratón ha eludido a los investigadores. En cambio, los investigadores han utilizado estrategias citométricas de flujo que aíslan solo una fracción de estos progenitores, a menudo en presencia de células no eritroides que se purifican conjuntamente dentro de los mismos subconjuntos citométricos de flujo21. En consecuencia, la investigación de BFU-e y CFU-e se limitó a sistemas de diferenciación in vitro que derivan y amplifican BFU-e y CFU-e de progenitores de médula ósea anteriores. Entonces es posible aplicar estrategias citométricas de flujo que distinguan la UFC-e de la BFU-e en estos cultivos enriquecidos con progenitores eritroides22,23. Un enfoque alternativo hace uso de UFC-e fetal y BFU-e, que están altamente enriquecidas en la fracción Ter119-negativa del hígado fetal de ratón a mediados de la gestación 10,24,25. Ninguno de estos enfoques, sin embargo, permite la investigación de BFU-e y UFC-e adultos en su estado fisiológico in vivo. La magnitud del desafío puede apreciarse cuando se recuerda que, según los ensayos de formación de colonias, estas células están presentes en la médula ósea adulta con una frecuencia de solo 0,025% y 0,3%, respectivamente6.
El protocolo descrito aquí es un nuevo enfoque citométrico de flujo basado en el análisis transcriptómico de células transcriptómicas de células de médula ósea de ratón Kit+ recién cosechadas (Kit es expresado por todas las poblaciones progenitoras tempranas de la médula ósea)1. Nuestro enfoque contiene algunos marcadores de superficie celular que ya estaban en uso por Pronk et al.21,26. Se utilizaron transcriptomas unicelulares para determinar combinaciones de marcadores de superficie celular que identifican progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos tempranos (Figura 2). Específicamente, la fracción CD55+ de las células Kit+ negativas para linaje (Lin-) puede subdividirse en cinco poblaciones, tres de las cuales producen segmentos contiguos de la trayectoria eritroide (Figura 2). Las identidades transcriptómicas de cada una de estas poblaciones se confirmaron mediante clasificación, seguido de scRNAseq y proyección de los transcriptomas unicelulares ordenados en el mapa transcriptómico original (la expresión génica en cada una de las cinco poblaciones y todo el conjunto de datos de médula ósea se puede explorar en https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . El potencial de destino celular de cada una de las poblaciones se confirmó mediante ensayos tradicionales de formación de colonias (Figura 2), así como un nuevo ensayo de destino unicelular de alto rendimiento 1,27. Estos análisis muestran que el nuevo enfoque citométrico de flujo da como resultado un aislamiento de alta pureza de todos los progenitores BFU-e y CFU-e de la médula ósea y el bazo adultos frescos. Específicamente, la población 1 (P1) contiene solo UFC-e y ningún otro progenitor hematopoyético, y la población 2 (P2) contiene todos los progenitores BFU-e de la médula ósea y un pequeño número de UFC-e pero ningún otro progenitor1. El protocolo detallado a continuación se ilustra con un experimento de ejemplo en ratones que fueron inyectados con solución salina o con la hormona estimulante de la eritropoyesis eritropoyetina (Epo).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L large orifice tips</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1011-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557395</td>
			<td>M1/70 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553784</td>
			<td>1D3 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553045</td>
			<td>RM4-5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553029</td>
			<td>53-6.7 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123106</td>
			<td>BM8 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>RB6-8C5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>TER-119 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma aldritch</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital DIVA hardware and software for LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>version 10</td>
			<td>Flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NewlineNY Stainless Steel Hand Masher &#38; Bowl, Mortar and Pestle Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD105 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>120408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 10x Solution</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480016</td>
			<td>Magnetic beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry

Los progenitores eritroides tempranos se definieron originalmente por su potencial de formación de colonias in vitro y se clasificaron en "unidades" formadoras de ráfagas y colonias conocidas como BFU-e y UFC-e. Hasta hace poco, no se disponía de métodos para el aislamiento prospectivo directo y completo de progenitores puros de BFU-e y UFC-e de médula ósea de ratón adulta recién aislada. Para abordar esta brecha, se analizó un conjunto de datos de RNA-seq de una sola célula (scRNAseq) de médula ósea de ratón para la expresión de genes que codifican marcadores de superficie celular. Este análisis se combinó con ensayos de destino celular, lo que permitió el desarrollo de un nuevo enfoque citométrico de flujo que identifica y permite el aislamiento de subconjuntos completos y puros de progenitores BFU-e y CFU-e en médula ósea o bazo de ratón. Este enfoque también identifica otros subconjuntos progenitores, incluidos los subconjuntos enriquecidos para los potenciales basófilos/mastocitos y megacariocíticos. El método consiste en marcar células frescas de médula ósea o bazo con anticuerpos dirigidos a Kit y CD55. Los progenitores que expresan ambos marcadores se subdividen en cinco poblaciones principales. La población 1 (P1 o UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/bajo CD105 med/alto CD71 med/alto) contiene todos los progenitores CFU-e y puede subdividirse en P1-bajo (CD71 med CD150 alto) y P1-hi (CD71alto CD150 bajo), correspondiente a CFU-e temprano y tardío, respectivamente; La población 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 low CD150high) contiene todos los progenitores BFU-e; La población P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150 low CD41low) está enriquecida para progenitores basófilos/mastocitos; La población 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) está enriquecida para progenitores megacariocíticos; y la población 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-) contiene progenitores con eritroides, basófilos/mastocitos y potencial megacariocítico (EBMP) y progenitores multipotenciales eritroses/megacariocíticos/basófilos (MPP). Este nuevo enfoque permite una mayor precisión al analizar progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos y también permite hacer referencia a la información del transcriptoma para cada población citométricamente definida por flujo.

El protocolo describe un enfoque citométrico de flujo para identificar BFU-es y UFC-es en células de médula ósea y bazo recién cosechadas. Comienza con la recolección de BM fresco y bazo de ratones e inmediatamente la colocación del tejido en hielo. Todos los procedimientos se realizan en el frío para preservar la viabilidad celular. Las células se marcan con un cóctel de anticuerpos de "linaje" que permite la exclusión de todas las células que expresan marcadores de linajes sanguíneos diferenciados (el cóc...

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Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Este protocolo permite la identificación y el aislamiento de progenitores eritroides BFU-E y CFU-E directamente de tejido de ratón recién cosechado como médula ósea y bazo. Utilizando esta técnica, podemos aislar poblaciones puras de progenitores eritroides, lo que no era posible con los protocolos de flujo anteriores. Este método mejora en gran medida nuestra capacidad para estudiar modelos de ratón con enfermedad eritroide al permitir el aislamiento de progenitores para muchos experimentos posteriores.Para comenzar, coloque los fémures y la tibia recién disecados directamente en el tampón de tinción fría o SB-5 y mantenga los tubos en hielo hasta que estén listos para extraer la médula ósea. Coloque un mortero esterilizado limpio sobre hielo en un cubo y transfiera los huesos al mortero. Usando las tijeras de disección, corte aproximadamente 1 milímetro de cada hueso.Use una jeringa de 3 mililitros equipada con una aguja de calibre 26 que contenga SB-5 para eliminar la médula de los huesos y recogerla en el mortero y repita el proceso de 3 a 5 veces usando tampón nuevo cada vez hasta que los huesos parezcan incoloros. Filtre la médula enjuagada a través de una malla de 100 micrómetros y recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 mililitros colocado en hielo. A continuación, use el mortero para aplastar los huesos enjuagados en 5 a 10 mililitros de SB-5.Filtre la mezcla de huesos triturados y tampare a través del filtro celular de 100 micrómetros para agruparlo con las células recolectadas previamente. Coloque un filtro de malla de 100 micrómetros en un tubo centrífugo vacío de 50 mililitros colocado sobre hielo. Coloque un solo bazo en el filtro de malla y agregue de 0.5 a 1 mililitro de SB-5 al bazo para asegurarse de que no se seque.Usando el lado de goma de un émbolo de jeringa de 3 o 5 mililitros, machaca el bazo a través de la malla. Agregue más SB-5, 5 mililitros a la vez, y continúe triturando hasta que todas las células se hayan recogido en el tubo. Prepare una suspensión de una sola célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo las celdas recolectadas con 2 mililitros de SB-5 usando una punta de orificio grande.Manche la fluorescencia menos uno o los controles FMO agregando todos los anticuerpos excepto el anticuerpo homónimo del FMO a la suspensión celular en el tubo FACS. Para teñir los controles de un solo color, agregue un solo anticuerpo a la suspensión celular en el tubo FACS. Vortex cada tubo de control durante 2 a 3 segundos a 3000 RPM y luego incubar a 4 grados centígrados balanceándose durante 2.5 horas en la oscuridad.Después de la incubación, lave las células con SB-5 y enrase el volumen de la suspensión celular a 4 mililitros con SB-5. Gire las células a 900 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados y aspire el sobrenadante. Vuelva a suspender los controles sin teñir y todos los controles de un solo color en 300 microlitros de SB-5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 micrómetros en nuevos tubos FACS.Haga una solución DAPI SB-5 diluyendo el stock DAPI en una proporción de 1 a 10, 000 en SB-5. Vuelva a suspender el FMOS en 1.8 mililitros de DAPI SB-5 y el control de un solo color DAPI en 300 microlitros de DAPI SB-5, luego fíjelos a través de una malla de filtro de 40 micrómetros en nuevos tubos FACS. Después de agregar la mezcla maestra de anticuerpos a cada muestra, haga un vórtice de los tubos durante 2 a 3 segundos a 3000 rpm, seguido de la incubación a 4 grados centígrados en la oscuridad durante 2,5 horas en condiciones de balanceo.Después de lavar las células como se demostró anteriormente, vuelva a suspender las muestras en 1,8 mililitros de DAPI SB-5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 micrómetros en un nuevo tubo FACS y analice las muestras con un cistómetro. Utilice la dispersión directa para eliminar los residuos en función del tamaño y, a continuación, utilice el histograma de altura de dispersión directa frente al área de dispersión directa para excluir agregados de celdas y seleccionar celdas individuales. Repita la exclusión con el histograma de altura de dispersión lateral frente a la altura de dispersión lateral.Excluya las células muertas eliminando las células positivas para DAPI. Seleccione el linaje negativo TUR uno 19 células negativas kit positivo. Y de estos seleccionamos una subpoblación que expresa CD 55.Subdividir el linaje negativo TUR uno 19, kit negativo, positivo, células CD 55 positivas en 2 poblaciones principales, P seis y P siete basadas en la expresión de CD 49 F y CD 1 0 5. Ahora basado en la expresión de CD 150 y CD 41, subdivida P 6 en P 3, P 4 y P 5. Del mismo modo, basándose en la expresión de CD 150 y CD 71, subdivida P 7 en BFUE, CFUE temprana y CFUE tardía.En el presente estudio, se identificaron unidades formadoras de estallidos y colonias a partir de las células de médula ósea y bazo recién cosechadas. Después de 72 horas de eritropoyetina, o inyección de vehículo en los ratones, la estimulación de eritropoyetina mostró expansión de las poblaciones de unidades formadoras de colonias tempranas y tardías P 1 baja y P 1 alta en la médula ósea y las células del bazo cosechadas. La respuesta de los progenitores de médula ósea y bazo a la eritropoyetina in vivo también mostró un mayor número de células en la colonia temprana y tardía formando las poblaciones de unidades P 1 baja y P 1 alta, en comparación con el vehículo control.Es muy importante generar una suspensión de una sola célula antes de etiquetar las células con anticuerpos. Esto se puede lograr pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente e incluyendo EDTA en el búfer. Los progenitores purificados se pueden utilizar para cualquier análisis celular y molecular posterior.Por ejemplo, transcriptómica de células individuales, atesque, ensayos de colonias y bioquímica. Esta técnica nos ayudó a probar las predicciones de experimentos de RNA-seq de una sola célula.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Aislar y analizar células del páncreas mesénquima por Citometría de Flujo

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Citometría de flujo en tiempo real de células vivas para investigar la afluencia del calcio, formación de poro y fagocitosis por los receptores P2X7 en células progenitoras neurales adultas

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...