Name: identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH-bidrag R01DK130498, R01DK120639 och R01HL141402

Alla experiment utfördes i enlighet med djurprotokollen A-1586 och 202200017 godkända av University of Massachusetts Chan Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.
OBS: Två protokoll beskrivs här: först flödescytometrisk analys (avsnitt 1), följt av protokolljusteringar för flödescytometrisk sortering (avsnitt 2). Protokollet nedan använder en flödescytometer/sorterare med 10 kanaler. Ett exempel på inställningar finns i tabell 1, som det hänvis...

<ol>
	<li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies.">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development:+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing.">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).</li><li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro.">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. , (1974).</li><li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation.">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li><li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture.">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li><li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+State+of+differentiation.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li><li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li><li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system:+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture.">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li><li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).</li><li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis.">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).</li><li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities.">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways.">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li><li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo.">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li><li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response.">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors.">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors:+BFU-E+and+CFU-E.">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal.">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li><li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis.">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li><li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro.">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li><li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia.">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action.">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li></ol>

Förmågan att prospektivt isolera BFU-e och CFU-e stamfäder direkt från färsk vävnad med hög renhet hade tidigare gäckat utredare. Vårt nya tillvägagångssätt, validerat med hjälp av scRNAseq och cellödeanalyser 1,27, erbjuder nu verktygen för att göra detta.
Det finns ett antal viktiga punkter för att framgångsrikt genomföra både sorterings- och analysprotokollen. Först måste cellerna snurras vid 900 x g f...

Erytropoies kan delas in i två huvudfaser: tidig erytropoies och erytroid terminal differentiering (figur 1)1,2,3. Vid tidig erytropoies förbinder sig hematopoetiska stamceller till erytroidlinjen och ger upphov till tidiga erytroidförfäder, som först identifierades på 1970-talet baserat på deras kolonibildande potential i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . I stort sett är erytroidförfäder indelade i två kategorier: tidigare förfäder som var och en ger upphov till en "burst" (ett stort aggregat av mindre erytroidcellkluster), namngivna "burst-forming unit erythroid" eller BFU-e 4,5,6; och deras avkomma, som var och en bildar ett enda, litet erytroidcellkluster eller koloni, som heter "kolonibildande enhet erytroid" eller CFU-e 7,8,9. BFU-e och CFU-e uttrycker ännu inte terminala erytroidgener och är inte morfologiskt igenkännliga. Efter ett antal självförnyelse- eller expansionscelldelningar genomgår CFU-e en transkriptionsomkopplare där erytroidgener såsom globiner induceras och därigenom övergår till erytroidterminal differentiering (ETD)1,10. Under ETD genomgår erytroblaster tre till fem mognadscelldelningar innan de enucleated för att bilda retikulocyter, som mognar till röda blodkroppar.
Erytroblaster under terminal differentiering klassificerades ursprungligen baserat på deras morfologi till proerytroblaster, basofila, polykromatiska och ortokromatiska. Tillkomsten av flödescytometri möjliggjorde deras prospektiva sortering och isolering baserat på cellstorlek (mätt med framåtspridning, FSC) och två cellytmarkörer, CD71 och Ter11911,12,13 (figur 1). Detta och liknande flödescytometriska tillvägagångssätt14 har revolutionerat undersökningen av de molekylära och cellulära aspekterna av ETD, vilket möjliggör utvecklingsstegspecifik analys av erytroblaster in vivo och in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-metoden används nu rutinmässigt vid analys av erytroidprekursorer.
Fram till nyligen har ett liknande, tillgängligt flödescytometriskt tillvägagångssätt för direkt, prospektiv isolering av CFU-e och BFU-e från musvävnad med hög renhet gäckat utredare. Istället har utredare använt flödescytometriska strategier som isolerar endast en bråkdel av dessa förfäder, ofta i närvaro av icke-erytroida celler som samrenar inom samma flödescytometriska delmängder21. Följaktligen begränsades undersökningen av BFU-e och CFU-e till in vitro-differentieringssystem som härleder och förstärker BFU-e och CFU-e från tidigare benmärgsförfäder. Det är sedan möjligt att tillämpa flödescytometriska strategier som skiljer CFU-e från BFU-e i dessa erytroida stamfaderberikade kulturer22,23. Ett alternativt tillvägagångssätt använder sig av fostrets CFU-e och BFU-e, som är mycket berikade i den Ter119-negativa fraktionen av musfostrets lever vid mitten av graviditeten 10,24,25. Inget av dessa tillvägagångssätt tillåter dock undersökning av vuxen BFU-e och CFU-e i deras fysiologiska tillstånd in vivo. Utmaningens storlek kan uppskattas när man påminner om att dessa celler, baserat på kolonibildningsanalyser, finns i den vuxna benmärgen med en frekvens av endast 0,025% respektive 0,3%6.
Protokollet som beskrivs här är ett nytt flödescytometriskt tillvägagångssätt baserat på encells transkriptomisk analys av nyskördade Kit + musbenmärgsceller (Kit uttrycks av alla tidiga stampopulationer i benmärgen)1. Vårt tillvägagångssätt innehåller några cellytmarkörer som redan användes av Pronk et al.21,26. Encelliga transkriptom användes för att bestämma kombinationer av cellytmarkörer som identifierar erytroid och andra tidiga hematopoetiska förfäder (figur 2). Specifikt kan CD55 + -fraktionen av härstamningsnegativa (Lin-) Kit + -celler delas in i fem populationer, varav tre ger sammanhängande segment av erytroidbanan (figur 2). De transkriptomiska identiteterna för var och en av dessa populationer bekräftades genom sortering, följt av scRNAseq och projektion av de sorterade encelliga transkriptomerna tillbaka till den ursprungliga transkriptomiska kartan (genuttrycket i var och en av de fem populationerna och hela benmärgsdatasetet kan utforskas i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Cellens ödespotential för var och en av populationerna bekräftades med hjälp av traditionella kolonibildningsanalyser (figur 2), liksom en ny högkapacitetsanalys av encells öde 1,27. Dessa analyser visar att det nya flödescytometriska tillvägagångssättet resulterar i isolering med hög renhet av alla BFU-e- och CFU-e-förfäder av färsk vuxen benmärg och mjälte. Specifikt innehåller population 1 (P1) endast CFU-e och inga andra hematopoetiska stamfäder, och population 2 (P2) innehåller alla benmärgens BFU-e-stamfäder och ett litet antal CFU-e men inga andra föregångare1. Det detaljerade protokollet nedan illustreras ytterligare med ett exempelexperiment på möss som injicerades med antingen saltlösning eller med det erytropoiesstimulerande hormonet erytropoietin (Epo).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L large orifice tips</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1011-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557395</td>
			<td>M1/70 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553784</td>
			<td>1D3 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553045</td>
			<td>RM4-5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553029</td>
			<td>53-6.7 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123106</td>
			<td>BM8 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>RB6-8C5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>TER-119 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma aldritch</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital DIVA hardware and software for LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>version 10</td>
			<td>Flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NewlineNY Stainless Steel Hand Masher &#38; Bowl, Mortar and Pestle Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD105 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>120408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 10x Solution</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480016</td>
			<td>Magnetic beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry

Tidiga erytroidförfäder definierades ursprungligen av deras kolonibildande potential in vitro och klassificerades i burstbildande och kolonibildande "enheter" som kallas BFU-e och CFU-e. Fram till nyligen fanns det inga metoder för direkt prospektiv och fullständig isolering av rena BFU-e- och CFU-e-förfäder från nyisolerade vuxna benmärg från möss. För att åtgärda detta gap analyserades en encells RNA-seq (scRNAseq) dataset av musbenmärg för uttryck av gener som kodar för cellytmarkörer. Denna analys kombinerades med cellödensanalyser, vilket möjliggjorde utvecklingen av ett nytt flödescytometriskt tillvägagångssätt som identifierar och möjliggör isolering av fullständiga och rena delmängder av BFU-e- och CFU-e-förfäder i musbenmärg eller mjälte. Detta tillvägagångssätt identifierar också andra stamfaderdelmängder, inklusive delmängder berikade för basofil/ mastcell och megakaryocytiska potentialer. Metoden består i att märka färska benmärgs- eller mjältceller med antikroppar riktade mot Kit och CD55. Förfäder som uttrycker båda dessa markörer delas sedan in i fem huvudpopulationer. Population 1 (P1 eller CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) innehåller alla CFU-e stamfäder och kan vidare delas in i P1-low (CD71med CD150 high) och P1-hi (CD71 high CD150low), motsvarande tidig respektive sen CFU-e; Population 2 (P2 eller BFU-e, Kit + CD55 + CD49f med / låg CD105 med / hög CD71låg CD150hög) innehåller alla BFU-e-förfäder; Population P3 (P3, Kit + CD55 + CD49f med / hög CD105 med / låg CD150 låg CD41 låg) är berikad för basofil/ mastcellsförfäder; Population 4 (P4, Kit + CD55 + CD49f med / hög CD105med / låg CD150hög CD41 +) är berikad för megakaryocytiska förfäder; och Population 5 (P5, Kit + CD55 + CD49f med / hög CD105 med / låg CD150hög CD41-) innehåller förfädermed erytroid, basofil / mastcell och megakaryocytisk potential (EBMP) och erytroid / megakaryocytisk/ basofil-biased multipotential stamfäder (MPP). Detta nya tillvägagångssätt möjliggör större precision vid analys av erytroid och andra hematopoetiska förfäder och möjliggör också hänvisning till transkriptominformation för varje flöde cytometriskt definierad population.

Protokollet beskriver ett flödescytometriskt tillvägagångssätt för att identifiera BFU-er och CFU-er i nyskördade benmärgs- och mjälteceller. Det börjar med att skörda färsk BM och mjälte från möss och omedelbart placera vävnaden på is. Alla procedurer utförs i kylan för att bevara cellviabiliteten. Celler är märkta med en "härstamning" antikroppscocktail som möjliggör uteslutning av alla celler som uttrycker markörer för differentierade blodlinjer (FITC-Lin-cocktail, tabell 3, v...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Här beskriver vi en ny flödescytometrisk metod för prospektiv isolering av tidiga burstbildande enheter erytroid (BFU-e) och kolonibildande enhet erytroid (CFU-e) föregångare direkt från färsk musbenmärg och mjälte. Detta protokoll, utvecklat baserat på encells transkriptomiska data, är det första som isolerar alla vävnadens erytroida förfäder med hög renhet.

Identifiering och isolering av sprängbildande enhet och kolonibildande enhet erytroidförfäder från musvävnad genom flödescytometri

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Detta protokoll möjliggör identifiering och isolering av BFU-E- och CFU-E-erytroidförfäder direkt från nyskördad musvävnad som benmärg och mjälte. Med hjälp av denna teknik kan vi isolera rena populationer av erytroida förfäder, vilket inte var möjligt med de tidigare flödesprotokollen. Denna metod förbättrar kraftigt vår förmåga att studera musmodeller för erytroidsjukdomar genom att tillåta stamfaderisolering för många nedströmsexperiment.För att börja, placera de nyligen dissekerade lårbenen och skenbenet direkt i kallfärgningsbuffert eller SB-5 och håll rören på is tills de är redo att extrahera benmärgen. Placera en ren steriliserad murbruk på is i en hink och överför benen till murbruk. Använd dissektionssaxen och klipp av cirka 1 millimeter ändar av varje ben.Använd en 3-milliliters spruta utrustad med en 26 gauge nål som innehåller SB-5 för att spola märgen ur benen och samla den i morteln och upprepa processen 3 till 5 gånger med färsk buffert varje gång tills benen verkar färglösa. Filtrera den spolade märgen genom ett 100-mikrometernät och samla cellerna i ett 50-ml centrifugrör placerat på is. Använd sedan morteln och stöten för att krossa de spolade benen i 5 till 10 ml SB-5.Filtrera blandningen av krossade ben och buffra genom 100-mikrometercellsilen för att poola med de tidigare uppsamlade cellerna. Sätt upp ett 100 mikrometer nätfilter på ett tomt 50-ml centrifugrör placerat på is. Placera en enda mjälte på nätfiltret och tillsätt 0,5 till 1 ml SB-5 till mjälten för att säkerställa att den inte torkar.Använd gummisidan av en 3 eller 5-milliliters sprutkolv, mosa mjälten genom nätet. Tillsätt mer SB-5, 5 ml åt gången och fortsätt att mosa tills alla celler har samlats i röret. Förbered en encellssuspension genom att pipettera upp och ner i de uppsamlade cellerna med 2 ml SB-5 med en stor öppningsspets.Fläcka fluorescensen minus en eller FMO-kontroller genom att tillsätta alla antikroppar utom FMO: s namne-antikropp till cellsuspensionen i FACS-röret. För att fläcka enfärgskontrollerna, lägg till en enda antikropp mot cellsuspensionen i FACS-röret. Vortex varje kontrollrör i 2 till 3 sekunder vid 3000 rpm och inkubera sedan vid 4 grader Celsius gunga i 2,5 timmar i mörkret.Efter inkubationen, tvätta cellerna med SB-5 och fyll volymen av cellsuspensionen till 4 ml med SB-5. Snurra ner cellerna vid 900 g i 10 minuter vid 4 grader Celsius och aspirera supernatanten. Stäng av de ofärgade och alla enfärgade kontrollerna i 300 mikroliter SB-5 och filtrera genom ett 40-mikrometers filternät till nya FACS-rör.Gör en DAPI SB-5-lösning genom att späda DAPI-aktien i förhållandet 1 till 10 000 i SB-5. Återupphäng FMOS i 1,8 ml DAPI SB-5 och DAPI enfärgskontroll i 300 mikroliter DAPI SB-5 och filtrera dem sedan genom ett 40-mikrometers filternät till nya FACS-rör. Efter tillsats av antikroppsmasterblandningen till varje prov, virvla rören i 2 till 3 sekunder vid 3000 rpm följt av inkubation vid 4 grader Celsius i mörkret i 2,5 timmar i gungningstillstånd.Efter att ha tvättat cellerna som visats tidigare, suspendera proverna igen i 1,8 ml DAPI SB-5 och filtrera genom ett 40-mikrometers filternät till ett nytt FACS-rör och analysera proverna med hjälp av en cystometer. Använd den framåtriktade punkten för att ta bort skräpet baserat på storlek och använd sedan histogrammet för spridningshöjden framåt jämfört med det framåtriktade spridningsområdet för att utesluta cellaggregat och markera enskilda celler. Upprepa uteslutningen med histogrammet sidospridningshöjd jämfört med sidospridningsområdet.Uteslut de döda cellerna genom att stänga av de positiva cellerna för DAPI. Välj härstamning negativ TUR en 19 negativa kit positiva celler. Och från dessa väljer du en delpopulation som uttrycker CD 55.Dela upp härstamningsnegativa TUR en 19, negativ kit, positiva, CD 55 positiva celler i 2 princippopulationer, P sex och P sju baserat på uttrycket av CD 49 F och CD 1 0 5. Nu baserat på uttrycket av CD 150 och CD 41, dela upp P 6 ytterligare i P 3, P 4 och P 5. På samma sätt, baserat på uttrycket av CD 150 och CD 71, dela upp P 7 ytterligare i BFUE, tidig CFUE och sen CFUE.I den aktuella studien identifierades burst- och kolonibildande enheter från de nyskördade benmärgs- och mjältecellerna. Efter 72 timmars erytropoietin, eller vehikelinjektion hos mössen, visade erytropoietinstimulering expansion av de tidiga och sena kolonibildande enhetspopulationerna P 1 låg och P 1 hög i de skördade benmärgs- och mjältecellerna. Benmärgs- och mjälteförfädernas svar på erytropoietin in vivo visade också ett högre antal celler i de tidiga och sena kolonibildande enhetspopulationerna P 1 låg och P 1 hög, jämfört med fordonskontroll.Det är viktigast att generera en enda cellsuspension innan cellerna märks med antikroppar. Detta kan uppnås genom att pipettera upp och ner upprepade gånger och genom att inkludera EDTA i bufferten. De renade förfäderna kan användas för alla nedströms cellulära och molekylära analyser.Till exempel encells transkriptomik, atesque, kolonianalyser och biokemi. Denna teknik hjälpte oss att testa förutsägelserna från encells RNA-seq-experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymic Settling stamfäder i Mouse Embryo Använda<em&gt; In Vivo</em&gt; Och<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Steg-specifik Sortering av mus spermatider med flödescytometri

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolera och analysera celler i bukspottkörteln mesenkym med flödescytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansion och adipogenesinduktion av adipocytprogenitorer från perivaskulär adiposvävnad isolerad genom magnetiskt aktiverad cellsortering

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardiserad tillvägagångssätt för multispecies Rening av mammaliska manliga cellceller genom mekanisk vävnadsdissociation och flödescytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolering, kultur och differentiering av benmärgens stromaceller och Osteoclast stamfäder från möss

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolering och karakterisering av hjärt mesenkymala stromaceller från endomyokardiella Bioptic prover av Högerkammarfunktion kardiomyopati patienter

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkt härstamning omprogrammering av vuxen mus Fibroblast till erytroid stamfäder

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Realtid Live-cell flödescytometri att undersöka kalcium tillströmning, Pore bildandet och fagocytos av P2X7-receptorer i vuxen neurala stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...