Name: identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibeleri R01DK130498, R01DK120639 ve R01HL141402 tarafından desteklenmektedir.

Tüm deneyler, Massachusetts Chan Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan A-1586 ve 202200017 hayvan protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Burada iki protokol detaylandırılmıştır: birincisi, akış sitometrik analizi (bölüm 1), ardından akış sitometrik sıralama için protokol ayarlamaları (bölüm 2). Aşağıdaki protokol, 10 kanallı bir akış sitometresi/sıralayıcı kullanır. Örnek kurulum, ad?...

<ol>
	<li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies.">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development:+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing.">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).</li><li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro.">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. , (1974).</li><li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation.">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li><li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture.">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li><li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+State+of+differentiation.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li><li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture:+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron.">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li><li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system:+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture.">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li><li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li><li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development.">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).</li><li>Hidalgo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpoR+stimulates+rapid+cycling+and+larger+red+cells+during+mouse+and+human+erythropoiesis.">EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis.</a> Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).</li><li>Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+signaling+specifies+basal+versus+stress+erythropoietic+responses+through+distinct+binary+and+graded+dynamic+modalities.">Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities.</a> PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).</li><li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways.">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li><li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo.">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li><li>Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autoregulation+by+Fas+stabilizes+adult+erythropoiesis+and+accelerates+its+stress+response.">Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response.</a> PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Dolznig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+differentiation+of+immature+mouse+and+human+hematopoietic+progenitors.">Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors.</a> Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analyses+of+human+erythroid+progenitors:+BFU-E+and+CFU-E.">Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E.</a> Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+Functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+synergizes+with+glucocorticoids+to+promote+BFU-E+progenitor+self-renewal.">HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal.</a> Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).</li><li>Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+developmental+stages+of+adult+myelopoiesis.">Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis.</a> Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).</li><li>Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+fate+potential+assay+of+murine+hematopoietic+progenitors+in+vitro.">High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro.</a> Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).</li><li>Erslev, A. J., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+titers+in+response+to+anemia+or+hypoxia.">Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia.</a> Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+erythropoietin+action.">The molecular mechanism of erythropoietin action.</a> European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).</li></ol>

BFU-e ve CFU-e progenitörlerini doğrudan yüksek saflıkta taze dokudan prospektif olarak izole etme yeteneği daha önce araştırmacılardan kaçınmıştı. ScRNAseq ve hücre kaderi tahlilleri 1,27 kullanılarak doğrulanan yeni yaklaşımımız, şimdi bunu yapmak için araçlar sunuyor.
Hem sıralamayı hem de analitik protokolleri başarıyla yürütmek için bir dizi kilit nokta vardır. İlk olarak, düşük yoğunluklu hüc...

Eritropoez iki ana faza ayrılabilir: erken eritropoez ve eritroid terminal farklılaşması (Şekil 1)1,2,3. Erken eritropoezde, hematopoetik kök hücreler eritroid soyuna bağlanır ve ilk olarak 1970'lerde yarı katı ortamda koloni oluşturma potansiyellerine dayanarak tanımlanan erken eritroid progenitörlere yol açar 4,5,6,7,8,9 . Genel olarak, eritroid progenitörler iki kategoriye ayrılır: her biri "patlama oluşturan birim eritroid" veya BFU-e 4,5,6 olarak adlandırılan bir "patlamaya" (daha küçük eritroid hücre kümelerinin büyük bir toplamı) yol açan önceki progenitörler; ve her biri "koloni oluşturan birim eritroid" veya CFU-e 7,8,9 olarak adlandırılan tek, küçük bir eritroid hücre kümesi veya kolonisi oluşturan soyları. BFU-e ve CFU-e henüz terminal eritroid genleri eksprese etmemektedir ve morfolojik olarak tanınabilir değildir. Bir dizi kendini yenileme veya genişleme hücresi bölünmesinden sonra, CFU-e, globinler gibi eritroid genlerin indüklendiği ve böylece eritroid terminal farklılaşmasına (ETD) geçiş yaptığı bir transkripsiyonel anahtara uğrar. ETD sırasında, eritroblastlar, kırmızı hücrelere olgunlaşan retikülositler oluşturmak için enükleasyona uğramadan önce üç ila beş olgun hücre bölünmesine uğrar.
Terminal farklılaşma sırasındaki eritroblastlar başlangıçta proeritroblastlar, bazofilik, polikromatik ve ortokromatik morfolojilerine göre sınıflandırılmıştır. Akış sitometrisinin ortaya çıkışı, hücre büyüklüğüne (ileri saçılma, FSC ile ölçülür) ve iki hücre yüzey belirtecine, CD71 ve Ter119 11,12,13'e (Şekil 1) dayalı olarak prospektif sıralama ve izolasyonlarına izin verdi. Bu ve benzeri akım sitometrik yaklaşımları 14, ETD'nin moleküler ve hücresel yönlerinin araştırılmasında devrim yaratarak, in vivo ve in vitro 10,15,16,17,18,19,20 eritroblastların gelişim aşamasına özgü analizine izin vermiştir. CD71/Ter119 yaklaşımı artık eritroid öncüllerin analizinde rutin olarak kullanılmaktadır.
Yakın zamana kadar, CFU-e ve BFU-e'nin fare dokusundan doğrudan, yüksek saflıkta prospektif izolasyonu için benzer, erişilebilir bir akış sitometrik yaklaşımı, araştırmacılardan kaçınmıştır. Bunun yerine, araştırmacılar bu progenitörlerin sadece bir kısmını izole eden akış sitometrik stratejilerini, genellikle aynı akış sitometrik alt kümeleri21 içinde birlikte saflaştıran eritroid olmayan hücrelerin varlığında kullanmışlardır. Sonuç olarak, BFU-e ve CFU-e'nin araştırılması, BFU-e ve CFU-e'yi daha önceki kemik iliği progenitörlerinden türeten ve çoğaltan in vitro farklılaşma sistemleriyle sınırlıydı. Daha sonra bu eritroid progenitörle zenginleştirilmiş kültürlerde CFU-e'yi BFU-e'den ayıran akış sitometrik stratejileri uygulamak mümkündür22,23. Alternatif bir yaklaşım, gebeliğin ortasında fare fetal karaciğerinin Ter119-negatif fraksiyonunda oldukça zenginleştirilmiş olan fetal CFU-e ve BFU-e'yi kullanır 10,24,25. Bununla birlikte, bu yaklaşımların hiçbiri, yetişkin BFU-e ve CFU-e'nin fizyolojik durumlarında in vivo olarak araştırılmasına izin vermez. Mücadelenin büyüklüğü, koloni oluşum analizlerine dayanarak, bu hücrelerin yetişkin kemik iliğinde sırasıyla% 0.025 ve% 0.3 frekansında bulunduğunu hatırlatırken takdiredilebilir.
Burada açıklanan protokol, yeni hasat edilmiş Kit + fare kemik iliği hücrelerinin tek hücreli transkriptomik analizine dayanan yeni bir akış sitometrik yaklaşımıdır (Kit, kemik iliğinin tüm erken progenitör popülasyonları tarafından ifade edilir)1. Yaklaşımımız, Pronk ve ark.21,26 tarafından halihazırda kullanılmakta olan bazı hücre yüzey belirteçlerini içermektedir. Eritroid ve diğer erken hematopoetik progenitörleri tanımlayan hücre yüzey belirteçlerinin kombinasyonlarını belirlemek için tek hücreli transkriptomlar kullanıldı (Şekil 2). Spesifik olarak, soy-negatif (Lin-) Kit + hücrelerinin CD55 + fraksiyonu, üçü eritroid yörüngenin bitişik segmentlerini veren beş popülasyona bölünebilir (Şekil 2). Bu popülasyonların her birinin transkriptomik kimlikleri sıralama ile doğrulandı, ardından scRNAseq ve sıralanmış tek hücreli transkriptomların orijinal transkriptomik haritaya geri yansıtılması (beş popülasyonun her birindeki gen ekspresyonu ve tüm kemik iliği veri kümesi https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html'de araştırılabilir)1 . Popülasyonların her birinin hücre kaderi potansiyeli, geleneksel koloni oluşum testleri (Şekil 2) ve ayrıca yeni bir yüksek verimli tek hücreli kader testi 1,27 kullanılarak doğrulanmıştır. Bu analizler, yeni akım sitometrik yaklaşımının, taze yetişkin kemik iliği ve dalağının tüm BFU-e ve CFU-e progenitörlerinin yüksek saflıkta izolasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Spesifik olarak, popülasyon 1 (P1) sadece CFU-e içerir ve başka hematopoetik progenitörler içermez ve popülasyon 2 (P2) kemik iliğinin tüm BFU-e progenitörlerini ve az sayıda CFU-e'yi içerir, ancak başka progenitörleriiçermez 1. Aşağıdaki ayrıntılı protokol, salin veya eritropoez uyarıcı hormon eritropoietin (Epo) ile enjekte edilen farelerde yapılan örnek bir deneyle daha da gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L large orifice tips</td>
			<td>USA sceintific</td>
			<td>1011-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>131806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557395</td>
			<td>M1/70 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553784</td>
			<td>1D3 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553045</td>
			<td>RM4-5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB553029</td>
			<td>53-6.7 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123106</td>
			<td>BM8 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553125</td>
			<td>RB6-8C5 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-TER-119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553672</td>
			<td>TER-119 (clone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma aldritch</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital DIVA hardware and software for LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD11b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software&#160;</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>version 10</td>
			<td>Flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NewlineNY Stainless Steel Hand Masher &#38; Bowl, Mortar and Pestle Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD105 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>120408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>113812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 10x Solution</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480016</td>
			<td>Magnetic beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of burst-forming unit and colony-forming unit erythroid progenitors from mouse tissue by flow cytometry

Erken eritroid progenitörler başlangıçta in vitro koloni oluşturma potansiyelleri ile tanımlandı ve BFU-e ve CFU-e olarak bilinen patlama oluşturan ve koloni oluşturan "birimler" olarak sınıflandırıldı. Yakın zamana kadar, saf BFU-e ve CFU-e progenitörlerinin taze izole edilmiş yetişkin fare kemik iliğinden doğrudan prospektif ve tam izolasyonu için yöntemler mevcut değildi. Bu boşluğu gidermek için, hücre yüzey belirteçlerini kodlayan genlerin ekspresyonu için fare kemik iliğinin tek hücreli bir RNA-seq (scRNAseq) veri kümesi analiz edildi. Bu analiz, fare kemik iliği veya dalağında BFU-e ve CFU-e progenitörlerinin tam ve saf alt kümelerinin izolasyonunu tanımlayan ve izin veren yeni bir akış sitometrik yaklaşımının geliştirilmesine izin veren hücre kaderi tahlilleri ile birleştirildi. Bu yaklaşım aynı zamanda bazofil / mast hücresi ve megakaryositik potansiyeller için zenginleştirilmiş alt kümeler de dahil olmak üzere diğer progenitör alt kümelerini de tanımlar. Yöntem, taze kemik iliği veya dalak hücrelerinin Kit ve CD55'e yönlendirilmiş antikorlarla etiketlenmesinden oluşur. Her iki belirteci de ifade eden öncüller daha sonra beş ana popülasyona ayrılır. Popülasyon 1 (P1 veya CFU-e, Kit + CD55 + CD49f med / düşük CD105 med / yüksek CD71 med / yüksek) tüm CFU-e progenitörlerini içerir ve sırasıyla erken ve geç CFU-e'ye karşılık gelen P1-low (CD71med CD150yüksek) ve P1-hi (CD71 yüksek CD150düşük) olarak alt bölümlere ayrılabilir; Popülasyon 2 (P2 veya BFU-e, Kit + CD55+ CD49f med/düşük CD105med/yüksek CD71düşük CD150yüksek) tüm BFU-e progenitörlerini içerir; Popülasyon P3 (P3, Kit + CD55+ CD49f med /yüksek CD105 med / düşük CD150 düşük CD41düşük) bazofil / mast hücre progenitörleri için zenginleştirilmiştir; Popülasyon 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/yüksek CD105med/düşük CD150yüksek CD41+) megakaryositik progenitörler için zenginleştirilmiştir; ve Popülasyon 5 (P5, Kit + CD55 + CD49f med / yüksek CD105med / düşük CD150yüksek CD41-) eritroid, bazofil / mast hücresi ve megakaryositik potansiyele (EBMP) sahip progenitörler ve eritroid/ megakaryositik / bazofil önyargılı çok potansiyelli progenitörler (MPP'ler) içerir. Bu yeni yaklaşım, eritroid ve diğer hematopoetik progenitörleri analiz ederken daha fazla hassasiyet sağlar ve ayrıca sitometrik olarak tanımlanmış her akış popülasyonu için transkriptom bilgisine atıfta bulunulmasına izin verir.

Protokol, taze hasat edilmiş kemik iliği ve dalak hücrelerinde BFU-es ve CFU-es'yi tanımlamak için akış sitometrik bir yaklaşımı açıklar. Taze BM ve dalağın farelerden toplanması ve dokunun hemen buzun üzerine yerleştirilmesiyle başlar. Tüm prosedürler hücre canlılığını korumak için soğukta gerçekleştirilir. Hücreler, farklılaşmış kan soylarının belirteçlerini ifade eden tüm hücrelerin dışlanmasına izin veren bir "soy" antikor kokteyli ile etiketlenir (FITC-Lin kokteyli, Tablo <...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry at JoVE.com

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Bu protokol, BFU-E ve CFU-E eritroid progenitörlerinin doğrudan kemik iliği ve dalak gibi yeni hasat edilmiş fare dokusundan tanımlanmasına ve izole edilmesine izin verir. Bu tekniği kullanarak, önceki akış protokolleriyle mümkün olmayan saf eritroid progenitörleri popülasyonlarını izole edebiliriz. Bu yöntem, birçok aşağı akış deneyi için progenitör izolasyonuna izin vererek eritroid hastalığı fare modellerini inceleme yeteneğimizi büyük ölçüde geliştirir.Başlamak için, yeni disseke edilmiş femurları ve tibiayı doğrudan soğuk boyama tamponuna veya SB-5'e yerleştirin ve tüpleri kemik iliğini çıkarmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Bir kovada buz üzerine temiz sterilize edilmiş bir harç yerleştirin ve kemikleri harçlara aktarın. Diseksiyon makasını kullanarak, her kemiğin yaklaşık 1 milimetrelik uçlarını kesin.İliği kemiklerden temizlemek ve harç içine toplamak için SB-5 içeren 26 gauge iğne ile donatılmış 3 mililitrelik bir şırınga kullanın ve kemikler renksiz görünene kadar her seferinde taze tampon kullanarak işlemi 3 ila 5 kez tekrarlayın. Yıkanmış iliği 100 mikrometrelik bir ağdan filtreleyin ve hücreleri buz üzerine yerleştirilmiş 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra, yıkanmış kemikleri 5 ila 10 mililitre SB-5'te ezmek için harcı ve havaneyi kullanın.Ezilmiş kemiklerin ve tampon karışımını, daha önce toplanan hücrelerle havuzlamak için 100 mikrometrelik hücre süzgecinden süzün. Buz üzerine yerleştirilmiş 50 mililitrelik boş bir santrifüj tüpü üzerine 100 mikrometrelik bir ağ filtresi yerleştirin. Ağ filtresine tek bir dalak yerleştirin ve kurumadığından emin olmak için dalağa 0,5 ila 1 mililitre SB-5 ekleyin.3 veya 5 mililitrelik bir şırınga pistonunun kauçuk tarafını kullanarak, dalağı ağdan ezin. Bir seferde daha fazla SB-5, 5 mililitre ekleyin ve tüm hücreler tüpte toplanana kadar püre haline getirmeye devam edin. Büyük bir delik ucu kullanarak toplanan hücreleri 2 mililitre SB-5 ile yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.Floresan eksi bir veya FMO kontrollerini, FMO'nun adaşı antikoru dışındaki tüm antikorları FACS tüpündeki hücre süspansiyonuna ekleyerek sabitleyin. Tek renkli kontrolleri boyamak için, FACS tüpündeki hücre süspansiyonuna tek bir antikor ekleyin. Her kontrol tüpünü 3000 RPM'de 2 ila 3 saniye boyunca vorteks yapın ve daha sonra karanlıkta 2,5 saat sallanarak 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, hücreleri SB-5 ile yıkayın ve hücre süspansiyonunun hacmini SB-5 ile 4 mililitreye kadar yapın. Hücreleri 900 g'da 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede döndürün ve süpernatanı aspire edin. 300 mikrolitre SB-5'teki lekesiz ve tüm tek renkli kontrolleri yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtre ağından yeni FACS tüplerine filtreleyin.SB-5'te DAPI stokunu 1 ila 10.000 oranında seyrelterek bir DAPI SB-5 çözümü oluşturun. FMOS'u 1,8 mililitre DAPI SB-5 ve DAPI tek renkli kontrolde 300 mikrolitre DAPI SB-5'te yeniden askıya alın, ardından 40 mikrometrelik bir filtre ağından yeni FACS tüplerine filtreleyin. Antikor ana karışımını her numuneye ekledikten sonra, tüpleri 3000 rpm'de 2 ila 3 saniye boyunca vorteksin ve ardından sallanma durumunda 2,5 saat boyunca karanlıkta 4 santigrat derecede inkübasyon yapın.Hücreleri daha önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, numuneleri 1.8 mililitre DAPI SB-5'te tekrar askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtre ağından yeni bir FACS tüpüne süzün ve numuneleri bir sistometre kullanarak analiz edin. Kalıntıları boyuta göre kaldırmak için ileri saçılımı kullanın, ardından hücre toplamlarını hariç tutmak ve tek hücreleri seçmek için ileri dağılım yüksekliği ile ileri dağılım alanı histogramını kullanın. Dışlamayı yan dağılım yüksekliği ve yan dağılım alanı histogramı ile tekrarlayın.DAPI için pozitif hücreleri kapatarak ölü hücreleri hariç tutun. Soy negatif TUR bir 19 negatif kit pozitif hücrelerini seçin. Ve bunlardan CD 55'i ifade eden bir alt popülasyon seçin.Soy negatif TUR bir 19, negatif kit, pozitif, CD 55 pozitif hücreleri CD 49 F ve CD 1 0 5 ekspresyonuna dayanarak P altı ve P yedi olmak üzere 2 ana popülasyona bölün. Şimdi CD 150 ve CD 41'in ifadesine dayanarak, P 6'yı daha da P 3, P 4 ve P 5'e bölün. Benzer şekilde, CD 150 ve CD 71'in ifadesine dayanarak, P 7'yi BFUE, erken CFUE ve geç CFUE'ye daha da alt bölümlere ayırın.Bu çalışmada, yeni hasat edilen kemik iliği ve dalak hücrelerinden patlama ve koloni oluşturan birimler tespit edilmiştir. 72 saatlik eritropoietin veya farelerde araç enjeksiyonundan sonra, eritropoietin stimülasyonu, hasat edilen kemik iliği ve dalak hücrelerinde erken ve geç koloni oluşturan birim popülasyonların P 1 düşük ve P 1 yüksek genişlemesini gösterdi. Kemik iliği ve dalak progenitörlerinin in vivo eritropoietine yanıtı, erken ve geç koloni oluşturan birim popülasyonlarda P 1 düşük ve P 1 yüksek araç kontrolüne kıyasla daha fazla sayıda hücre gösterdi.Hücreleri antikorlarla etiketlemeden önce tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak en önemlisidir. Bu, tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme yaparak ve EDTA'yı tampona dahil ederek elde edilebilir. Saflaştırılmış progenitörler, herhangi bir aşağı akış hücresel ve moleküler analiz için kullanılabilir.Örneğin, tek hücreli transkriptomik, atesque, koloni tahlilleri ve biyokimya. Bu teknik, tek hücreli RNA-seq deneylerinden elde edilen tahminleri test etmemize yardımcı oldu.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Gelişim Biyolojisi

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Yalıtım ve Endomyocardial Bioptic örnekleri Aritmojenik kardiyomiyopati hasta kardiyak Mezenkimal Stromal hücrelerden karakterizasyonu

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...