Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

نود أن نشكر دينا أرانوفيتش على تنقية البروتين ووضع العلامات. G.L. ممتن لوزارة العلوم والتكنولوجيا والفضاء الإسرائيلية لمنحة جابوتنسكي للدكتوراه. تعرب A.B.G. عن امتنانها لمؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 2101/20) ولوزارة العلوم والتكنولوجيا - دولة إسرائيل (منحة 3-17491) للدعم المالي.

1. معالجة سطح الزجاج والتخميل:
ملاحظة: يتضمن هذا القسم ثلاث خطوات رئيسية (انظر الشكل 1): (i) التنظيف والتجفيف المائي ، (ii) silanization ، و (iii) التخميل السطحي.
<ol><li>التنظيف والتجفيد المائي<ol><li>استخدم محلول سمكة البيرانا لتنظيف الأسطح الزجاجية. ملاحظة: محلول سمكة البي?...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

هنا ، يتم استخدام نهج في المختبر لتوصيف ميكانيكا المواد الهلامية actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي ، وبشكل أعم ، من السيتوبلازم الخلوي ، الذي ثبت أنه يتصرف كمادة مساميةمرنة 3,5. تتميز ريولوجيا الهيكل الخلوي الخلوي (السيتوبلازم) بثابت انتشا?...

الخلايا الحية لها خصائص ميكانيكية فريدة. إلى جانب القدرة على الاستجابة السلبية للقوى المطبقة ، فهي أيضا قادرة على توليد القوى بنشاط استجابة للمنبهات الخارجية1. تعزى هذه الخصائص ، الضرورية لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، لا سيما أثناء حركة الخلية ، في المقام الأول إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي للخلية ، وخاصة الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، والمحركات الجزيئية للميوسين ، والبروتينات الملحقة. تظهر شبكات الأكتوميوسين هذه خصائص ذاتية التنظيم والانكماش الجوهرية مدفوعة ببروتينات الميوسين الحركية ، والتي تربط خيوط الأكتين وتولد بنشاط ضغوطا ميكانيكية في الشبكة التي يغذيها التحلل المائي ATP2.
أجريت العديد من الدراسات التجريبية والنظرية لدراسة الخصائص المادية للهيكل الخلوي3. الرأي المقبول عموما هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجةمرنة 4. هذا يعني أنه على نطاقات زمنية قصيرة ، يتصرف الهيكل الخلوي كمادة مرنة ، وعلى فترات زمنية طويلة ، يتصرف كسائل لزج بسبب البروتينات المتشابكة وانفصال محرك الميوسين (وإعادة الارتباط) ، مما يسمح للشبكة بالدوران ديناميكيا. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، لا يمكن للنموذج اللزج المرن وصف النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع الصورة التي تصف الهيكل الخلوي ، وبشكل عام ، سيتوبلازم الخلية الذي يوصف بأنه مادة فعالة مساميةمرنة 5,6. ميزتان رئيسيتان تميزان هذه الأنواع من المواد. (ط) السمة الرئيسية الأولى هي توليد تدفق السيتوسول المخترق ("المذيب") عبر مسام الهلام عن طريق تدرجات انقباضية مدفوعة بمحركات الميوسين ، والتي تكمن وراء عمليات مثل تفجير الخلية7 ، والحركة8 ، وتذبذبات شكل الخلية9. يمكن أن يكون ظهور مثل هذه التدفقات الخلوية محليا ، أو للنفخ ، أو عالميا ، كما هو الحال في حركة الخلية. في الحالة الأخيرة ، تدفع الضغوط المطبقة بالانقباض في مؤخرة الخلية تدفق السائل الخلوي نحو مقدمة الخلية ، والتي تغذي تجمع البروتين اللازم لتجميع الصفيحة8. (ii) الميزة الرئيسية الثانية هي أن استرخاء الإجهادات منتشر ويتميز بثابت انتشار فعال ، والذي يعتمد على معامل مرونة الهلام ، ومسامية الهلام ، ولزوجة المذيب5. يحدد ثابت الانتشار المسامي المرن مدى سرعة استجابة النظام للإجهاد المطبق. تتوافق ثوابت الانتشار الأعلى مع إعادة توزيع الإجهاد بشكل أسرع. وهذا بدوره يحدد المدة التي يستغرقها السائل الخلوي داخل الخلايا لإعادة توزيعه داخل الخلية بعد الضغط الميكانيكي المطبق، سواء كان خارجيا أو داخليا، مثل الضغوط الانقباضية النشطة الناتجة عن محركات الميوسين. وبالتالي ، توضح هذه الأمثلة أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مقترنة بإحكام ولا يمكن معالجتها بشكل منفصل3.
نظرا لأن الخلايا يمكنها تنظيم خواصها الميكانيكية بعدة طرق ، فإن التفاعل بين ميكانيكا الشبكة وديناميكيات تدفق السوائل لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. يتمثل النهج البديل القوي في استخدام الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تسمح بالتحكم الكامل في المكونات المجهرية المختلفة ومعلمات النظام ، مما يجعل هذه الأنظمة النموذجية مثالية للتحليل المادي10,11. تم استخدام هذا النهج بنجاح لدراسة تأثير تركيب البروتين وهندسة النظام على الحركة القائمة على الأكتين 12،13،14،15،16،17،18 ، والنمط ثنائي الأبعاد لشبكات الأكتوميوسين 19،20،21،22، والتفاعل بين انقباض الشبكة وديناميات تدفق السوائل لجل الأكتوميوسين المرن ، وهو محور هذه الورقة23.
في هذه المخطوطة ، تمت مناقشة إعداد شبكات الأكتوميوسين المرنة المقلصة ذات الأبعاد التي يمكن التحكم فيها وخصائص المواد بناء على عمل Ideses et al.23. يتم تحليل ديناميكيات الجل المتعاقد والمذيب المصفى وقياسها ، والتي من خلالها يتم إثبات أن هذه المواد الهلامية actomyosin يمكن وصفها بأنها مادة فعالة poroelastic. تؤكد دراسة تأثير لزوجة المذيبات على انتشار الإجهاد الطبيعة المسامية لهذه الشبكات. يتم توفير علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهمية النتائج التجريبية للهيكل الخلوي الخلوي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

يمكن للخلايا تغيير أشكالها بنشاط وتصبح متحركة ، وهي خاصية تعتمد على قدرتها على إعادة تنظيم بنيتها الداخلية بنشاط. تعزى هذه الميزة إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي الخلوي ، ولا سيما الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، ومحركات الميوسين ، والبروتينات الملحقة التي تظهر خصائص الانكماش الجوهري. الرأي المقبول عادة هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجة مرنة. ومع ذلك ، لا يمكن لهذا النموذج دائما تفسير النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع صورة تصف الهيكل الخلوي بأنه مادة نشطة مرنة مسامية - شبكة مرنة مدمجة مع العصارة الخلوية. تدفع تدرجات الانقباض الناتجة عن محركات الميوسين تدفق السيتوسول عبر مسام الجل ، مما يشير إلى أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مرتبطة بإحكام. تتمثل إحدى السمات الرئيسية لمرونة المسام في الاسترخاء المنتشر للضغوط في الشبكة ، والتي تتميز بثابت انتشار فعال يعتمد على معامل مرونة الهلام ، والمسامية ، ولزوجة السيتوسول (المذيبات). نظرا لأن الخلايا لديها العديد من الطرق لتنظيم بنيتها وخواص المواد ، فإن فهمنا الحالي لكيفية اقتران ميكانيكا الهيكل الخلوي وديناميكيات تدفق السيتوسول لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. هنا ، يتم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لتوصيف الخصائص المادية لجل actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي. الانكماش الهلامي مدفوع بانقباض محرك الميوسين ، مما يؤدي إلى ظهور تدفق المذيب المخترق. تصف الورقة كيفية تحضير هذه المواد الهلامية وإجراء التجارب. نناقش أيضا كيفية قياس وتحليل تدفق المذيبات وتقلص الهلام على المستويين المحلي والعالمي. يتم إعطاء علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة ، بما في ذلك صلتها بميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

يتم استخدام اثنين من أغطية الزجاج لكل تجربة. يتم تنظيف أغطية الزجاج وتخميلها باستخدام بوليمرات PEG. التخميل ضروري لمنع البروتينات القابلة للذوبان من الالتصاق بالأسطح الزجاجية في المراحل التجريبية المبكرة ولتقليل تفاعل شبكة التعاقد مع الجدران الزجاجية. يمكن أن يؤدي الفشل في تحقيق التخميل ...

Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

في هذا العمل ، تم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لدراسة المرونة المسامية لجل الأكتوميوسين في ظل ظروف خاضعة للرقابة. يتم تحديد ديناميكيات هلام actomyosin والمذيب المضمن ، والتي من خلالها يتم إثبات مرونة الشبكة المسامية. نناقش أيضا التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهميتها لميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

ميكانيكا شبكات الأكتوميوسين المرنة (البورية) الانقباضية كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

لقد طورنا نهجا في المختبر لتوصيف ميكانيكا المواد الهلامية actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي للخلية ، وبشكل أعم ، السيتوبلازم ، والتي ثبت أنها تتصرف كمادة فعالة poroelastic. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول كيفية مساهمة انقباض الميوسين في ظهور تدفق السوائل وكيف ترتبط سرعات الشبكة والسيتوسول في الزمان والمكان. يسمح لنا هذا النهج البسيط باستخراج الخصائص الميكانيكية للأنظمة المتطورة ديناميكيا دون استخدام أي معدات أو تقنيات متطورة حيث لا يمكن استخدام الأدوات التقليدية مثل AFIM.يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على ريولوجيا المواد الفعالة المسامية المرنة بغض النظر عن خصوصية الجل النشط والسائل المضمن. للبدء ، ضع 10 إلى 12 غطاء زجاجي رقم 1.5 في حامل بولي تترافلوروإيثيلين محلي الصنع وقم بإعداد محلول سمكة البيرانا في دورق سعة 400 ملليلتر. تحضير الحل على الجليد في غطاء كيميائي.انقل الحامل إلى دورق مملوء بسمكة البيرانا. بعد ثلاث ساعات ، انقل الحامل إلى دورق نظيف مملوء بالماء المقطر المزدوج الطازج لغسل سمكة البيرانا الزائدة من أغطية الغطاء ونقل الدورق إلى حمام صوتنة عند 80 هرتز والطاقة الكاملة لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين بالماء المقطر المزدوج النقي.للتملح ، انقل الحامل إلى دورق نظيف مملوء ب 300 مل من الميثانول النقي ، ثم إلى حمام صوتنة لمدة 30 دقيقة. ثم انقل الحامل إلى محلول silane. أغلق الدورق بالبارافيلم واحتفظ به في الثلاجة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.في اليوم التالي، انقل الحامل إلى كأس زجاجية نظيفة مملوءة ب 300 ملليلتر من الميثانول النقي لمدة 15 ثانية. جفف الجزء السفلي من الحامل لإزالة الميثانول الزائد ونقله إلى دورق نظيف. ثم انقل الدورق إلى الفرن لتجفيف الأغطية الزجاجية لمدة خمس دقائق عند 120 درجة مئوية.لتحقيق التخميل السطحي ، خذ اثنين من أغطية الغطاء لكل تجربة ووضعها في طبق بتري مغطى بطبقة بارافيلم تم تنظيفها في البداية بالإيثانول. احتضن كل غطاء مع ملليلتر واحد من ميثوكسي بولي إيثيلين جلايكول ماليميد في 1X PBS لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية. في نهاية عملية الحضانة ، قم بإمالة طبق بتري لإزالته وربطه.شطف كل غطاء مع خمسة ملليلتر من الماء المقطر المزدوج وجفف مع تدفق غاز النيتروجين. نظرا لأنه يجب أن تبقى أغطية الغطاء مبللة بعد التخميل ، ضع على الفور ملليلتر واحد من 10 مليمولار تريس على الأسطح pegylated واستخدم أغطية الغطاء لمدة ساعتين. لتكوين مجاميع الميوسين الكبيرة، خفف محلول مخزون الميوسين باستخدام 10 ملليمولار تريس للوصول إلى تركيز نهائي قدره 25 مليمول كلوريد البوتاسيوم.احتفظ بمحلول الميوسين المخفف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم انقله إلى الثلج حتى الاستخدام. المحركات نشطة بالكامل لمدة تصل إلى ساعتين. لتتبع تدفق المذيبات عبر مسام الجل ، قم بإعداد حبات الفلورسنت المخملة وتقليل التفاعل بين الخرز وشبكة actomyosin عن طريق احتضان ميكرولتر واحد من الخرز بخمسة ميكرومولار G-actin لمدة 20 دقيقة.قم بإزالة G-actin الزائد عن طريق الطرد المركزي. كرر هذه الخطوة مع 10 ملليغرام لكل ملليلتر من ألبومين مصل الأبقار لمنع السطح غير المطلي المتبقي واستخدام الخرزات بتخفيف نهائي من واحد إلى 10،000 في التجارب. لتحضير محلول الأكتوميوسين ، قم بإذابة حصص البروتين المخزنة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وضعها على الجليد.ثم قم بإعداد المحلول للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 مللي مولار تريس ، وخمسة ميكرومولار G-actin ، و 280 نانومولار GST Fascin ، و 1.67 نانومولار ميوسين II.خذ أحد أغطية البولي إيثيلين جلايكول المخملة. ضع فاصل بارافورم مدهون فوقه وضعه في حامل العينة. أضف 1.1 ميكرولتر من محلول الأكتوميوسين إلى غطاء الغطاء المثبت على الحامل وضع غطاء الغطاء الثاني في الأعلى.المسمار حامل لختم العينة. ضع حامل العينة على المجهر وابدأ عملية الاستحواذ. تحضير المجهر مقدما لتقليل وقت الاستحواذ الأولي.لتصوير العينات باستخدام مجهر فلوري مقلوب ، تصور منطقة الهلام بأكملها باستخدام تكبير منخفض لهدف 2.5X واتبع تقلصه العياني مع مرور الوقت. استخدم هدف 10X لتوصيف مسامية الشبكة وهيكلها ومتابعة التنظيم الذاتي للشبكة وتقلصها مع مرور الوقت. للتصوير المتزامن بلونين، قم بإثارة الأكتين عند 488 نانومتر ومحركات الميوسين II عند 561 نانومتر وسجل الصور في وقت واحد على كاميرا EMCCD باستخدام جهاز انبعاث مزدوج.استخدم نفس نظام التصوير لتصوير هلام الأكتين ومحركات الميوسين II الفلورية في وقت واحد. للتصوير المتزامن بلونين ، قم بإثارة الأكتين عند 488 نانومتر و 2،300 حبة نانومتر عند 561 نانومتر. وسجل الصور في وقت واحد على كاميرا EMCCD باستخدام جهاز انبعاث مزدوج.استخدم نفس نظام التصوير لتصوير جل الأكتين وخرز الفلورسنت في وقت واحد. يتضمن اليوم الأول إثبات أن شبكة الأكتوميوسين تتصرف كمادة مرنة. يصور هنا تمثيل تخطيطي لشبكة أكتوميوسين.تظهر صور الفحص المجهري الفلوري أن خيوط الأكتين تنوي تلقائيا وتتبلمر في شبكة مترابطة الخواص تخفف مع مرور الوقت وتتقلص في النهاية مجهريا. يبدأ جذب الشبكة في محيط الهلام وينتشر إلى الداخل في الجزء الأكبر من الهلام. يتم تمييز مركز الهلام ب C.تظل حزم خيوط الأكتين مستقيمة أثناء تقلص الشبكة.يوضح هنا توزيع النسبة بين طول الكفاف والمسافة من طرف إلى طرف عند T316 ثانية و T327 ثانية. يتضمن الهدف الثاني إثبات أن سريان المذيب الخارجي يتولد عن انقباض الميوسين. تظهر هنا صورة الجل عند التكبير المنخفض في المراحل المتوسطة من الانكماش.تشير هذه الدوائر إلى مواضع أربع خرزات. تشير الأسهم إلى الاتجاه العام لحركة الخرزة. يتم تصوير مسارات الخرزات التسعة المختارة هنا.يتم هنا توضيح حل مسامية الشبكة وحركة المذيب عبر مسام الهلام في المراحل المتقدمة من الانكماش. الهدف الثالث ينطوي على إثبات أن استرخاء الإجهاد يتميز بثابت انتشار مرن فعال. تظهر هنا صور مضان للمنظر العلوي لهلام أكتوميوسين متقلص عند التكبير المنخفض من وقت الخلط حتى الحالة المستقرة.تتصرف شبكات actomyosin كمادة فعالة poroelastic. أثناء محاولة هذا الإجراء ، اعمل بسرعة ودقة وتذكر أهمية الحفاظ على السطح.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

المغناطيسي منهجية Elastography الرنين لتقييم الأنسجة المهندسة النمو كونستركت

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

رصد ميكانيكا الحائط أثناء النشر ستينت في وعاء

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

محاكاة ميكانيكا عدسة السكن عن طريق عدسة يدوية نقالة

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

المؤتلف الكولاجين أنا ميكروكاريرس الببتيد لتوسيع الخلية وإمكانية استخدامها كنظام إيصال خلية في مفاعل حيوي نموذج

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

تشكيل عفوية وإعادة ترتيب شبكات أنابيب نانوية اصطناعية الدهن كنموذج التصاعدي هيولى

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...