Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dina Aranovich for proteinrensning og mærkning. G.L. er taknemmelig for Israels ministerium for videnskab, teknologi og rum for Jabotinsky ph.d.-stipendiet. A.B.G. er taknemmelig over for Israel Science Foundation (bevilling 2101/20) og til Ministeriet for Videnskab og Teknologi - Staten Israel (bevilling 3-17491) for økonomisk støtte.

1. Glasoverfladebehandling og passivering:
BEMÆRK: Dette afsnit omfatter tre hovedtrin (se figur 1): (i) rengøring og hydrofilisering, (ii) silanisering og (iii) overfladepassivering.
<ol><li>Rengøring og hydrofilisering<ol><li>Brug Piranha-opløsning til rengøring af glasoverflader. BEMÆRK: Piranha-opløsning er en blanding af 30% H2O2 og 70%H2SO4(Tabel over materialer). Dets primære mål er ...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Her anvendes en in vitro-tilgang til at karakterisere mekanikken i poroelastiske actomyosingeler som et modelsystem af cellecytoskelettet og mere generelt af cellecytoplasmaet, som har vist sig at opføre sig som et poroelastisk materiale 3,5. Reologien i cellecytoskelettet (cytoplasma) er blevet karakteriseret ved en poroelastisk diffusionskonstant, som dikterer, hvor lang tid det tager for den intracellulære cytosoliske væske at omfordele i cellen ef...

Levende celler har unikke mekaniske egenskaber. Udover evnen til passivt at reagere på anvendte kræfter er de også i stand til aktivt at generere kræfter som reaktion på eksterne stimuli1. Disse egenskaber, som er afgørende for en række cellulære processer, især under cellemotilitet, tilskrives primært de mekaniske og dynamiske egenskaber af cellecytoskelettet, især actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel af polære actinfilamenter, myosinmolekylære motorer og tilbehørsproteiner. Disse actomyosin-netværk udviser iboende selvorganiserings- og sammentrækningsegenskaber drevet af myosinmotorproteinerne, som tværbinder actinfilamenterne og aktivt genererer mekaniske belastninger i netværket, der drives af ATP-hydrolyse2.
Talrige eksperimentelle og teoretiske undersøgelser er blevet udført for at studere cytoskeletets materielle egenskaber3. Den almindeligt accepterede opfattelse er, at cytoskelettet opfører sig som et viskoelastisk materiale4. Dette betyder, at cytoskelettet på korte tidsskalaer opfører sig som et elastisk materiale, og på lange tidsskalaer opfører det sig som en viskøs væske på grund af tværbindingsproteinerne og myosinmotorisk løsrivelse (og genvedhæftning), hvilket gør det muligt for netværket dynamisk at turnover. I mange situationer kan den viskoelastiske model imidlertid ikke beskrive de eksperimentelle resultater, som er mere konsistente med et billede, der beskriver cytoskelettet og mere generelt cellecytoplasmaet, der beskrives som et poroelastisk aktivt materiale 5,6. To hovedtræk karakteriserer disse typer materialer. (i) Det første hovedtræk er dannelsen af en strøm af den gennemtrængende cytosol ("opløsningsmidlet") over gelporerne ved kontraktilitetsgradienter drevet af myosinmotorerne, som ligger til grund for processer som celleblegning7, motilitet8 og celleformoscillationer9. Fremkomsten af sådanne cytosoliske strømme kan være lokal, til blødning eller global, som i cellemotilitet. I sidstnævnte tilfælde driver de kontraktile-påførte spændinger ved cellens bageste strømmen af den cytosoliske væske mod cellefronten, hvilket supplerer den proteinpulje, der er nødvendig til lamellipodia-samling8. (ii) Det andet hovedtræk er, at afslapningen af spændinger er diffus og er karakteriseret ved en effektiv diffusionskonstant, , som afhænger af gelelastisk modul, gelporøsitet og opløsningsmiddelviskositet5. Den poroelastiske diffusionskonstant bestemmer, hvor hurtigt systemet reagerer på en påført spænding. Højere diffusionskonstanter svarer til hurtigere stressomfordeling. Dette bestemmer igen, hvor lang tid det tager for den intracellulære cytosoliske væske at blive omfordelt i cellen efter påført mekanisk belastning, det være sig ekstern eller intern, såsom de aktive kontraktile spændinger, der genereres af myosinmotorer. Disse eksempler viser således, at cytoskelettets og cytosolens mekanik er tæt koblet og ikke kan behandles separat3.
Da celler kan regulere deres mekaniske egenskaber på forskellige måder, er samspillet mellem netværksmekanik og væskestrømsdynamik stadig dårligt forstået. En stærk alternativ tilgang er at bruge in vitro rekonstituerede systemer, der giver mulighed for fuld kontrol over de forskellige mikroskopiske bestanddele og systemparametrene, hvilket gør disse modelsystemer optimale til fysisk analyse10,11. Denne tilgang er med succes blevet anvendt til at studere virkningen af proteinsammensætning og systemgeometri på aktinbaseret motilitet 12,13,14,15,16,17,18, 2D-mønsteret af actomyosinnetværk 19,20,21,22, og samspillet mellem netværkskontraktilitet og væskestrømningsdynamik af poroelastiske actomyosingeler, som er fokus for dette papir23.
I dette manuskript diskuteres fremstillingen af kontraktile elastiske actomyosinnetværk af kontrollerbare dimensioner og materialeegenskaber baseret på Ideses et al.23's arbejde. Dynamikken i den kontraherende gel og det drænede opløsningsmiddel analyseres og kvantificeres, hvorigennem det demonstreres, at disse actomyosingeler kan beskrives som et poroelastisk aktivt materiale. Undersøgelse af virkningen af opløsningsmiddelviskositet på stressdiffusivitet bekræfter yderligere disse netværks poroelastiske karakter. De forskellige skaleringsrelationer, der bruges til datakvantificering, leveres. Endelig diskuteres også de eksperimentelle udfordringer, de almindelige faldgruber og relevansen af de eksperimentelle resultater for cellecytoskelettet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

Celler kan aktivt ændre deres former og blive bevægelige, en egenskab, der afhænger af deres evne til aktivt at omorganisere deres interne struktur. Denne funktion tilskrives de mekaniske og dynamiske egenskaber ved cellecytoskelettet, især actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel af polære actinfilamenter, myosinmotorer og tilbehørsproteiner, der udviser iboende sammentrækningsegenskaber. Den normalt accepterede opfattelse er, at cytoskelettet opfører sig som et viskoelastisk materiale. Denne model kan dog ikke altid forklare de eksperimentelle resultater, som er mere konsistente med et billede, der beskriver cytoskelettet som et poroelastisk aktivt materiale - et elastisk netværk indlejret med cytosol. Kontraktilitetsgradienter genereret af myosinmotorerne driver cytosolens strømning over gelporerne, hvilket udleder, at cytoskeletets og cytosolens mekanik er tæt koblet. Et hovedtræk ved poroelasticitet er den diffusive afslapning af spændinger i netværket, kendetegnet ved en effektiv diffusionskonstant, der afhænger af gelelastisk modul, porøsitet og cytosol (opløsningsmiddel) viskositet. Da celler har mange måder at regulere deres struktur og materialeegenskaber på, er vores nuværende forståelse af, hvordan cytoskeletmekanik og cytosolstrømningsdynamik er koblet, stadig dårligt forstået. Her anvendes en in vitro rekonstitutionsmetode til at karakterisere materialeegenskaberne af poroelastiske actomyosingeler som et modelsystem for cellecytoskelettet. Gelkontraktion drives af myosinmotorkontraktilitet, hvilket fører til fremkomsten af en strøm af det gennemtrængende opløsningsmiddel. Papiret beskriver, hvordan man forbereder disse geler og kører eksperimenter. Vi diskuterer også, hvordan man måler og analyserer opløsningsmiddelflowet og gelkontraktionen både på lokal og global skala. De forskellige skaleringsrelationer, der anvendes til datakvantificering, er angivet. Endelig diskuteres de eksperimentelle udfordringer og almindelige faldgruber, herunder deres relevans for cellecytoskeletmekanik.

Der anvendes to glasdæksler pr. eksperiment. Glasdækslerne rengøres og passiveres med PEG-polymerer. Passivering er afgørende for at forhindre de opløselige proteiner i at klæbe til glasoverfladerne i de tidlige eksperimentelle stadier og for at minimere interaktionen mellem det kontraherende netværk og glasvæggene. Manglende opnåelse af god passivering kan føre til ineffektiv sammentrækning og kan i ekstreme tilfælde endda hæmme dannelsen af actinnetværk.
Fi...

Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

I dette arbejde anvendes en in vitro rekonstitutionsmetode til at studere poroelasticiteten af actomyosingeler under kontrollerede forhold. Dynamikken i actomyosingelen og det indlejrede opløsningsmiddel kvantificeres, hvorigennem netværksporoelasticiteten demonstreres. Vi diskuterer også de eksperimentelle udfordringer, almindelige faldgruber og relevans for cellecytoskeletmekanik.

Mekanikken i (poro-) elastiske kontraktile actomyosinnetværk som et modelsystem af cellecytoskelettet

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Vi har udviklet en in vitro tilgang til at karakterisere mekanikken i poroelastiske actomyosingeler som et modelsystem af cellecytoskelettet og mere generelt cytoplasmaet, som har vist sig at opføre sig som et poroelastisk aktivt materiale. Denne metode giver indsigt i, hvordan myosinkontraktilitet bidrager til fremkomsten af en væskestrøm, og hvordan netværks- og cytosolhastigheder er korreleret i tid og rum. Denne enkle tilgang giver os mulighed for at udtrække de mekaniske egenskaber ved dynamisk udviklende systemer uden at bruge sofistikeret udstyr eller teknikker, hvor konventionelle værktøjer som AFIM ikke kan anvendes.Denne metode kan give indsigt i reologien af poroelastiske aktive materialer uanset specificiteten af den aktive gel og den indlejrede væske. Til at begynde med skal du placere 10 til 12 nummer 1,5 glasdæksler i en hjemmelavet polytetrafluorethylenholder og forberede Piranha-opløsning i et 400 ml bægerglas. Forbered opløsningen på is i en kemisk hætte.Overfør holderen til det Piranha-fyldte bægerglas. Efter tre timer overføres holderen til et rent bægerglas fyldt med frisk dobbeltdestilleret vand for at vaske overskydende Piranha fra dæksedlerne og overføre bægerglasset til et sonikeringsbad ved 80 hertz og fuld effekt i 10 minutter ved 25 grader Celsius. Gentag dette trin to gange mere med frisk dobbeltdestilleret vand.Til saltopløsning overføres holderen til et rent bægerglas fyldt med 300 ml ren methanol og derefter i et sonikeringsbad i 30 minutter. Overfør derefter holderen til en silanopløsning. Bægerglasset forsegles med parafilm og opbevares i køleskabet ved fire grader Celsius natten over.Den næste dag overføres holderen til et rent bægerglas fyldt med 300 ml ren methanol i 15 sekunder. Tør bunden af holderen for at fjerne overskydende methanol og overføre det til et rent bægerglas. Overfør derefter bægerglasset til ovnen for at tørre glasdækslerne i fem minutter ved 120 grader Celsius.For at opnå overfladepassivering skal du tage to dæksedler til hvert eksperiment og placere dem i en petriskål belagt med et parafilmlag, der oprindeligt rengøres med ethanol. Hvert dæksel inkuberes med en milliliter methoxypolyethylenglycolmaleimid i 1X PBS i en time ved 22 grader Celsius. Ved afslutningen af inkubationsprocessen vippes petriskålen for at fjerne og fastgøre.Skyl hvert dæksel med fem ml dobbeltdestilleret vand og tør med en strøm af nitrogengas. Da dæksedlerne skal holdes våde efter passivering, skal du straks sætte en milliliter 10 millimolær Tris på de pegylerede overflader og bruge dæksedlerne med to timer. For at danne store myosinaggregater fortyndes myosinstamopløsningen med 10 millimolære Tris for at nå en endelig koncentration på 25 millimolært kaliumchlorid.Opbevar den fortyndede myosinopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur og overfør den derefter til is indtil brug. Motorerne er fuldt aktive i op til to timer. For at spore opløsningsmiddelstrømmen over gelporerne skal du forberede passiverede fluorescerende perler og reducere interaktionen mellem perlerne og actomyosinnetværket ved at inkubere en mikroliter perler med fem mikromolære G-actin i 20 minutter.Fjern overskydende G-actin ved centrifugering. Gentag dette trin med 10 milligram pr. Milliliter bovint serumalbumin for at blokere den resterende ubelagte overflade og brug perlerne ved en endelig fortynding på en til 10.000 i forsøgene. For at forberede actomyosinopløsningen optø proteinalikvoterne, der opbevares ved minus 80 grader Celsius, og læg dem på is.Forbered derefter opløsningen for at nå en endelig koncentration på 10 millimolær Tris, fem mikromolær G-actin, 280 nanomolær GST Fascin og 1,67 nanomolær myosin II.Tag en af polyethylenglycol passiverede dækselsedler. Placer et smurt paraformafstandsstykke oven på det, og læg det i prøveholderen. Tilsæt 1,1 mikroliter actomyosin-opløsningen til holderens monterede dæksel, og læg den anden dæksel ovenpå.Skru holderen for at forsegle prøven. Placer prøveholderen på mikroskopet og start erhvervelsen. Forbered mikroskopet på forhånd for at reducere den oprindelige erhvervelsestid.For at afbilde prøverne med et omvendt fluorescerende mikroskop skal du visualisere hele gelområdet ved hjælp af lave forstørrelser på 2,5X objektiv og følge dets makroskopiske sammentrækning med tiden. Brug et 10X mål til at karakterisere netværkets porøsitet og struktur og til at følge netværkets selvorganisering og sammentrækning med tiden. Til samtidig tofarvet billeddannelse exciteres actinet ved 488 nanometer og myosin II-motorer ved 561 nanometer og optager billederne samtidigt på et EMCCD-kamera ved hjælp af et dobbeltemissionsapparat.Brug det samme billeddannelsessystem til samtidig at afbilde actinglen og de fluorescerende myosin II-motorer. Til samtidig tofarvet billeddannelse exciteres actinet ved 488 nanometer og 2.300 nanometer perler ved 561 nanometer. Og optag billederne samtidigt på et EMCCD-kamera ved hjælp af et dobbeltemissionsapparat.Brug det samme billeddannelsessystem til samtidig at afbilde actinglen og de fluorescerende perler. Den første dag indebærer at demonstrere, at actomyosin-netværket opfører sig som et elastisk materiale. En skematisk repræsentation af et actomyosin-netværk er afbildet her.Fluorescensmikroskopibilleder viser, at actinfilamenterne spontant nukleerer og polymeriserer til et isotropt sammenkoblet netværk, der grover med tiden og til sidst trækker sig makroskopisk sammen. Netværkstiltrækning starter i gelperiferien og forplanter sig indad i gelmassen. Gelcentret er markeret med en C.Actinfilamentbundterne forbliver lige under netværkskontraktion.Fordelingen af forholdet mellem konturlængden og ende-til-ende-afstanden ved T316 sekunder og T327 sekunder er vist her. Det andet mål indebærer at demonstrere, at en udadgående opløsningsmiddelstrøm genereres af myosinkontraktilitet. Billedet af gelen ved lav forstørrelse i mellemliggende stadier af sammentrækning er vist her.Disse cirkler markerer positionerne af fire perler. Pilene markerer den globale retning af perlebevægelsen. Banerne for de ni udvalgte perler er afbildet her.Opløsning af netværksporøsiteten og opløsningsmidlets bevægelse over gelporerne i fremskredne stadier af sammentrækning er afbildet her. Det tredje mål indebærer at demonstrere, at stressafslapning er kendetegnet ved en effektiv poroelastisk diffusionskonstant. Topbillede af fluorescensbilleder af en kontraherende actomyosingel ved lav forstørrelse fra blandingstiden op til steady state vises her.Actomyosin-netværkene opfører sig som et poroelastisk aktivt materiale. Mens du forsøger denne procedure, skal du arbejde hurtigt og præcist og huske vigtigheden af overfladebevarelse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human trofoblasten celler som en model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografi metode til evaluering af manipuleret væv Construct Vækst

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvågning af Wall Mekanik Under Stent Deployment i en beholder

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret metode til forberedelse af en menneskelig celle-baseret, Contact Model af blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Produktion af Cancer Cell Sfæroider med en vandig tofasesystem for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikation af ekstracellulære matrix-afledte Skum og Mikrobærere som Tissue-specifikke cellekultur og Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Simulering af mekanikken i linse overnatning via en manuel linse båre

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celle ekspansion og deres potentielle anvendelse som celle levering System i en bioreaktor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

Spontane dannelse og omlægning af kunstige Lipid nanorør netværk som en Bottom-Up-Model for endoplasmatiske Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...