Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

We willen Dina Aranovich bedanken voor de eiwitzuivering en etikettering. G.L. is het Israëlische ministerie van Wetenschap, Technologie en Ruimte dankbaar voor de Jabotinsky PhD Scholarship. A.B.G. is de Israel Science Foundation (subsidie 2101/20) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie - Staat Israël (subsidie 3-17491) dankbaar voor financiële steun.

1. Oppervlaktebehandeling en passivering van glas:
OPMERKING: Deze sectie bevat drie belangrijke stappen (zie figuur 1): (i) reiniging en hydrofielisatie, (ii) silanisatie en (iii) oppervlaktepassivering.
<ol><li>Reiniging en hydrofielisatie<ol><li>Gebruik Piranha-oplossing voor het reinigen van glasoppervlakken. OPMERKING: Piranha-oplossing is een mengsel van 30% H 2O 2 en 70% H2 SO4 (materiaaltabel</strong...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Hier wordt een in vitro benadering gebruikt om de mechanica van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem van het celcytoskelet en, meer in het algemeen, van het celcytoplasma, waarvan is aangetoond dat het zich gedraagt als een poro-elastisch materiaal 3,5. De reologie van het celcytoskelet (cytoplasma) is gekenmerkt door een poro-elastische diffusieconstante, die dicteert hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytoso...

Levende cellen hebben unieke mechanische eigenschappen. Naast het vermogen om passief te reageren op toegepaste krachten, zijn ze ook in staat om actief krachten te genereren als reactie op externe stimuli1. Deze kenmerken, die essentieel zijn voor een verscheidenheid aan cellulaire processen, met name tijdens celmotiliteit, worden voornamelijk toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemoleculaire motoren en accessoire-eiwitten. Deze actomyosinenetwerken vertonen intrinsieke zelforganisatie- en contractie-eigenschappen aangedreven door de myosinemotoreiwitten, die de actinefilamenten met elkaar verbinden en actief mechanische spanningen genereren in het netwerk dat wordt gevoed door ATP-hydrolyse2.
Talrijke experimentele en theoretische studies zijn uitgevoerd om de materiaaleigenschappen van het cytoskelet3 te bestuderen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal4. Dit betekent dat op korte tijdschalen het cytoskelet zich gedraagt als een elastisch materiaal en op lange tijdschalen gedraagt het zich als een viskeuze vloeistof vanwege de crosslinking-eiwitten en myosinemotorische loslating (en herbevestiging), waardoor het netwerk dynamisch kan omslaan. In veel situaties kan het visco-elastische model echter niet de experimentele resultaten beschrijven, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft en, meer in het algemeen, het celcytoplasma dat wordt beschreven als een poro-elastisch actief materiaal 5,6. Twee hoofdkenmerken kenmerken dit soort materialen. (i) Het eerste hoofdkenmerk is het genereren van een stroom van het doordringende cytosol (het "oplosmiddel") over de gelporiën door contractiliteitsgradiënten aangedreven door de myosinemotoren, die ten grondslag liggen aan processen zoals cel blebbing7, motiliteit8 en celvormoscillaties9. De opkomst van dergelijke cytosolische stromen kan lokaal zijn, voor blebbing, of globaal, zoals in celmotiliteit. In het laatste geval drijven de contractiel aangebrachte spanningen aan de achterkant van de cel de stroom van de cytosolische vloeistof naar de voorkant van de cel, die de eiwitpool aanvult die nodig is voor lamellipodia-assemblage8. (ii) Het tweede hoofdkenmerk is dat de ontspanning van spanningen diffuus is en wordt gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante, , die afhankelijk is van de gelelastische modulus, gelporositeit en oplosmiddelviscositeit5. De poro-elastische diffusieconstante bepaalt hoe snel het systeem reageert op een toegepaste spanning. Hogere diffusieconstanten komen overeen met een snellere herverdeling van de spanning. Dit bepaalt op zijn beurt hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytosolische vloeistof binnen de cel wordt herverdeeld na toegepaste mechanische stress, hetzij extern of intern, zoals de actieve contractiele spanningen die worden gegenereerd door myosinemotoren. Deze voorbeelden tonen dus aan dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn en niet afzonderlijk kunnen worden behandeld3.
Omdat cellen hun mechanische eigenschappen op verschillende manieren kunnen reguleren, blijft het samenspel tussen netwerkmechanica en vloeistofstroomdynamica slecht begrepen. Een krachtige alternatieve benadering is het gebruik van in vitro gereconstitueerde systemen die volledige controle over de verschillende microscopische bestanddelen en de systeemparameters mogelijk maken, waardoor deze modelsystemen optimaal zijn voor fysische analyse10,11. Deze aanpak is met succes gebruikt om de impact van eiwitsamenstelling en systeemgeometrie op actine-gebaseerde motiliteit 12,13,14,15,16,17,18 te bestuderen, de 2D-patronen van actomyosinenetwerken 19,20,21,22, en de wisselwerking tussen netwerkcontractiliteit en vloeistofstroomdynamica van poro-elastische actomyosinegels, waar dit artikel zich op richt23.
In dit manuscript wordt de voorbereiding van contractiele elastische actomyosinenetwerken van controleerbare dimensies en materiaaleigenschappen besproken op basis van het werk van Ideses et al.23. De dynamiek van de samentrekkende gel en het gedraineerde oplosmiddel worden geanalyseerd en gekwantificeerd, waardoor wordt aangetoond dat deze actomyosine-gels kunnen worden beschreven als een poro-elastisch actief materiaal. Het bestuderen van het effect van oplosmiddelviscositeit op spanningsdiffusiviteit bevestigt verder de poro-elastische aard van deze netwerken. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor de kwantificering van gegevens worden verstrekt. Tot slot worden ook de experimentele uitdagingen, de veelvoorkomende valkuilen en de relevantie van de experimentele resultaten voor het celcytoskelet besproken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

Cellen kunnen actief hun vorm veranderen en beweeglijk worden, een eigenschap die afhangt van hun vermogen om hun interne structuur actief te reorganiseren. Dit kenmerk wordt toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemotoren en accessoire eiwitten die intrinsieke contractie-eigenschappen vertonen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal. Dit model kan echter niet altijd de experimentele resultaten verklaren, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft als een poro-elastisch actief materiaal - een elastisch netwerk ingebed met cytosol. Contractiliteitsgradiënten gegenereerd door de myosinemotoren drijven de stroom van het cytosol door de gelporiën, wat afleidt dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn. Een belangrijk kenmerk van poro-elasticiteit is de diffusieve ontspanning van spanningen in het netwerk, gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante die afhankelijk is van de gelelastische modulus, porositeit en cytosol (oplosmiddel) viscositeit. Omdat cellen veel manieren hebben om hun structuur en materiaaleigenschappen te reguleren, blijft ons huidige begrip van hoe cytoskeletmechanica en cytosolstroomdynamiek zijn gekoppeld, slecht begrepen. Hier wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de materiaaleigenschappen van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem voor het celcytoskelet. Gelcontractie wordt aangedreven door myosine motorische contractiliteit, wat leidt tot het ontstaan van een stroom van het penetrerende oplosmiddel. Het artikel beschrijft hoe deze gels te bereiden en experimenten uit te voeren. We bespreken ook hoe de oplosmiddelstroom en gelcontractie kunnen worden gemeten en geanalyseerd, zowel op lokale als op wereldwijde schaal. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor gegevenskwantificering worden gegeven. Ten slotte worden de experimentele uitdagingen en veelvoorkomende valkuilen besproken, inclusief hun relevantie voor de cytoskeletmechanica van cellen.

Per experiment worden twee glazen dekplaten gebruikt. De glazen afdekplaten worden gereinigd en gepassiveerd met PEG-polymeren. Passivering is essentieel om te voorkomen dat de opgeloste eiwitten zich in de vroege experimentele stadia aan de glasoppervlakken hechten en om de interactie van het samentrekkende netwerk met de glazen wanden te minimaliseren. Het niet bereiken van een goede passivering kan leiden tot inefficiënte contractie en kan in extreme gevallen zelfs de vorming van het actinenetwerk remmen.
<p clas...

Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

In dit werk wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de poro-elasticiteit van actomyosinegels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. De dynamiek van de actomyosinegel en het ingebedde oplosmiddel worden gekwantificeerd, waardoor de netwerkporo-elasticiteit wordt aangetoond. We bespreken ook de experimentele uitdagingen, veelvoorkomende valkuilen en relevantie voor celcytoskeletmechanica.

De mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

We hebben een in vitro benadering ontwikkeld om de mechanica van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem van het celcytoskelet, en meer in het algemeen het cytoplasma, waarvan is aangetoond dat het zich gedraagt als een poro-elastisch actief materiaal. Deze methode geeft inzicht in hoe myosinecontractiliteit bijdraagt aan het ontstaan van een vloeistofstroom en hoe netwerk- en cytosolsnelheden gecorreleerd zijn in tijd en ruimte. Deze eenvoudige aanpak stelt ons in staat om de mechanische eigenschappen van dynamisch evoluerende systemen te extraheren zonder gebruik te maken van geavanceerde apparatuur of technieken waar conventionele gereedschappen zoals AFIM niet kunnen worden gebruikt.Deze methode kan inzicht geven in de reologie van poro-elastische actieve materialen, ongeacht de specificiteit van de actieve gel en de ingebedde vloeistof. Plaats om te beginnen 10 tot 12 nummer 1,5 glazen afdekplaten in een zelfgemaakte polytetrafluorethyleenhouder en bereid piranha oplossing voor in een bekerglas van 400 milliliter. Bereid de oplossing op ijs in een chemische kap.Breng de houder over in het met Piranha gevulde bekerglas. Breng na drie uur de houder over in een schoon bekerglas gevuld met vers dubbel gedestilleerd water om de overtollige Piranha van de dekzeilen te wassen en breng het bekerglas over in een ultrasoonapparaatbad op 80 hertz en volledig vermogen gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius. Herhaal deze stap nog twee keer met vers dubbel gedestilleerd water.Breng voor verzilting de houder over in een schoon bekerglas gevuld met 300 milliliter pure methanol en vervolgens gedurende 30 minuten in een ultrasoonapparaatbad. Breng de houder vervolgens over in een silaanoplossing. Sluit het bekerglas af met parafilm en bewaar het een nacht in de koelkast op vier graden Celsius.Breng de houder de volgende dag gedurende 15 seconden over in een schoon bekerglas gevuld met 300 milliliter pure methanol. Droog de bodem van de houder om de overtollige methanol te verwijderen en breng deze over in een schoon bekerglas. Breng vervolgens het bekerglas over in de oven om de glazen afdekplaten vijf minuten te drogen op 120 graden Celsius.Om oppervlaktepassivering te bereiken, neemt u voor elk experiment twee afdekstroken en plaatst u deze in een petrischaal bedekt met een parafilmlaag die aanvankelijk is gereinigd met ethanol. Incubeer elke coverslip met één milliliter methoxypolyethyleenglycolmaleimide in 1X PBS gedurende één uur bij 22 graden Celsius. Aan het einde van het incubatieproces kantelt u de petrischaal om te verwijderen en vast te maken.Spoel elke deklaag af met vijf milliliter dubbel gedestilleerd water en droog af met een stroom stikstofgas. Aangezien de coverslips na passivering nat moeten worden gehouden, plaatst u onmiddellijk een milliliter 10 millimolar Tris op de gepegyleerde oppervlakken en gebruikt u de coverslips met twee uur. Om grote myosineaggregaten te vormen, verdunt u de myosine-stamoplossing met 10 millimolaire Tris om een eindconcentratie van 25 millimolair kaliumchloride te bereiken.Bewaar de verdunde myosine-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en breng deze vervolgens over op ijs tot gebruik. De motoren zijn tot twee uur volledig actief. om de oplosmiddelstroom door de gelporiën te volgen, gepassiveerde fluorescerende kralen te bereiden en de interactie tussen de kralen en het actomyosinenetwerk te verminderen door gedurende 20 minuten één microliter kralen te incuberen met vijf micromolaire G-actine.Verwijder het teveel aan G-actine door centrifugeren. Herhaal deze stap met 10 milligram per milliliter runderserumalbumine om het resterende ongecoate oppervlak te blokkeren en gebruik de kralen bij een uiteindelijke verdunning van één tot 10.000 in de experimenten. Om de actomyosine-oplossing te bereiden, ontdooit u de eiwitaliquots die zijn opgeslagen bij min 80 graden Celsius en plaatst u ze op ijs.Bereid vervolgens de oplossing voor om een eindconcentratie van 10 millimolaire Tris, vijf micromolaire G-actine, 280 nanomolaire GST Fascin en 1,67 nanomolaire myosine II te bereiken.Neem een van de polyethyleenglycol gepassiveerde coverslips. Plaats er een ingevette paraform spacer op en plaats deze in de monsterhouder. Voeg 1,1 microliter van de actomyosine-oplossing toe aan de op de houder gemonteerde coverslip en plaats de tweede coverslip bovenop.Schroef de houder vast om het monster af te dichten. Plaats de monsterhouder op de microscoop en begin met de acquisitie. Bereid de microscoop van tevoren voor om de initiële acquisitietijd te verkorten.Om de monsters met een omgekeerde fluorescerende microscoop in beeld te brengen, visualiseert u het hele gelgebied met behulp van lage vergrotingen van 2,5x objectief en volgt u de macroscopische samentrekking met de tijd. Gebruik een 10X-doelstelling om de porositeit en structuur van het netwerk te karakteriseren en om de zelforganisatie en samentrekking van het netwerk met de tijd te volgen. Voor de gelijktijdige tweekleurenbeeldvorming prikkelt u de actine op 488 nanometer en myosine II-motoren op 561 nanometer en neemt u de beelden tegelijkertijd op een EMCCD-camera op met behulp van een apparaat met dubbele emissie.Gebruik hetzelfde beeldvormingssysteem om tegelijkertijd de actinegel en de fluorescerende myosine II-motoren in beeld te brengen. Voor gelijktijdige tweekleurenbeeldvorming, exciteer de actine op 488 nanometer en 2, 300 nanometer kralen op 561 nanometer. En neem de beelden tegelijkertijd op een EMCCD-camera op met behulp van een dubbel emissieapparaat.Gebruik hetzelfde beeldvormingssysteem om tegelijkertijd de actinegel en de fluorescerende kralen in beeld te brengen. De eerste dag omvat het aantonen dat het actomyosine-netwerk zich gedraagt als een elastisch materiaal. Een schematische weergave van een actomyosinenetwerk wordt hier weergegeven.Fluorescentiemicroscopiebeelden tonen aan dat de actinefilamenten spontaan nucleeren en polymeriseren tot een isotroop onderling verbonden netwerk dat met de tijd verruwt en uiteindelijk macroscopisch samentrekt. Netwerkaantrekking begint aan de periferie van het netwerk en verspreidt zich naar binnen in de gelbulk. Het gelcentrum is gemarkeerd met een C.De actinefilamentbundels blijven recht tijdens netwerkcontractie.De verdeling van de verhouding tussen de contourlengte en de end-to-end afstand op T316 seconden en T327 seconden wordt hier weergegeven. Het tweede doel is het aantonen dat een uitwendige oplosmiddelstroom wordt gegenereerd door myosinecontractiliteit. Het beeld van de gel bij lage vergroting in tussenliggende stadia van contractie wordt hier getoond.Deze cirkels markeren de posities van vier kralen. De pijlen markeren de globale richting van de kraalbeweging. De trajecten van de negen geselecteerde kralen zijn hier afgebeeld.Het oplossen van de netwerkporositeit en de beweging van het oplosmiddel door de gelporiën in vergevorderde stadia van contractie worden hier weergegeven. Het derde doel is om aan te tonen dat stressontspanning wordt gekenmerkt door een effectieve poro-elastische diffusieconstante. Tl-beelden van bovenaanzicht van een samentrekkende actomyosine-gel bij lage vergroting vanaf de mengtijd tot de steady state worden hier getoond.De actomyosinenetwerken gedragen zich als een poro-elastisch actief materiaal. Werk tijdens het proberen van deze procedure snel en nauwkeurig en houd rekening met het belang van oppervlaktebehoud.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografie methodologie voor de evaluatie van Tissue Engineered Construct groei

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Monitoring van de Muur Mechanics Tijdens stent in een bloedvat

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Simuleren van de mechanica van Lens accommodatie via een handmatige Lens brancard

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...