Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

Nous tenons à remercier Dina Aranovich pour la purification et l’étiquetage des protéines. G.L. est reconnaissant au ministère israélien de la Science, de la Technologie et de l’Espace pour la bourse de doctorat Jabotinsky. A.B.G. remercie la Fondation israélienne pour la science (subvention 2101/20) et le ministère de la Science et de la Technologie de l’État d’Israël (subvention 3-17491) pour leur soutien financier.

1. Traitement de surface et passivation du verre :
REMARQUE : Cette section comprend trois étapes principales (voir la figure 1) : (i) nettoyage et hydrophilisation, (ii) silanisation et (iii) passivation de surface.
<ol><li>Nettoyage et hydrophilisation<ol><li>Utilisez la solution Piranha pour le nettoyage des surfaces vitrées. NOTE: La solution de piranha est un mélange de 30% H 2 O 2 et 70% H2 SO4 (table des mat?...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Ici, une approche in vitro est utilisée pour caractériser la mécanique des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire et, plus généralement, du cytoplasme cellulaire, dont il a été démontré qu’il se comporte comme un matériau poroélastique 3,5. La rhéologie du cytosquelette cellulaire (cytoplasme) a été caractérisée par une constante de diffusion poroélastique, qui dicte combien de temp...

Les cellules vivantes ont des propriétés mécaniques uniques. Outre la capacité de réagir passivement aux forces appliquées, ils sont également capables de générer activement des forces en réponse à des stimuli externes1. Ces caractéristiques, essentielles pour une variété de processus cellulaires, notamment lors de la motilité cellulaire, sont principalement attribuées aux propriétés mécaniques et dynamiques du cytosquelette cellulaire, en particulier le cytosquelette d’actomyosine, qui est un gel actif de filaments d’actine polaire, de moteurs moléculaires de myosine et de protéines accessoires. Ces réseaux d’actomyosine présentent des propriétés intrinsèques d’auto-organisation et de contraction entraînées par les protéines motrices de la myosine, qui réticulent les filaments d’actine et génèrent activement des contraintes mécaniques dans le réseau alimentées par l’hydrolyse de l’ATP2.
De nombreuses études expérimentales et théoriques ont été menées pour étudier les propriétés matérielles du cytosquelette3. L’opinion communément acceptée est que le cytosquelette se comporte comme un matériau viscoélastique4. Cela signifie que sur de courtes échelles de temps, le cytosquelette se comporte comme un matériau élastique, et sur de longues échelles de temps, il se comporte comme un fluide visqueux en raison des protéines de réticulation et du détachement moteur de la myosine (et du rattachement), ce qui permet au réseau de se renouveler dynamiquement. Dans de nombreuses situations, cependant, le modèle viscoélastique ne peut pas décrire les résultats expérimentaux, qui sont plus cohérents avec une image décrivant le cytosquelette et, plus généralement, le cytoplasme cellulaire décrit comme une matière active poroélastique 5,6. Deux caractéristiques principales caractérisent ces types de matériaux. (i) La première caractéristique principale est la génération d’un flux du cytosol pénétrant (le « solvant ») à travers les pores du gel par des gradients de contractilité entraînés par les moteurs de myosine, qui sous-tend des processus tels que le blebbingcellulaire 7, la motilité8 et les oscillations de forme cellulaire9. L’émergence de tels flux cytosoliques peut être locale, pour le blebbing, ou globale, comme dans la motilité cellulaire. Dans ce dernier cas, les contraintes contractiles appliquées à l’arrière de la cellule entraînent le flux du liquide cytosolique vers le front cellulaire, ce qui reconstitue le pool protéique nécessaire à l’assemblage des lamellipodes8. (ii) La deuxième caractéristique principale est que la relaxation des contraintes est diffusive et se caractérise par une constante de diffusion effective, qui dépend du module d’élasticité du gel, de la porosité du gel et de la viscositédu solvant 5. La constante de diffusion poroélastique détermine la vitesse à laquelle le système répond à une contrainte appliquée. Des constantes de diffusion plus élevées correspondent à une redistribution des contraintes plus rapide. Ceci, à son tour, détermine combien de temps il faut pour que le liquide cytosolique intracellulaire soit redistribué dans la cellule après une contrainte mécanique appliquée, qu’elle soit externe ou interne, comme les contraintes contractiles actives générées par les moteurs de myosine. Ces exemples démontrent ainsi que la mécanique du cytosquelette et du cytosol sont étroitement couplées et ne peuvent être traitées séparément3.
Comme les cellules peuvent réguler leurs propriétés mécaniques de diverses manières, l’interaction entre la mécanique des réseaux et la dynamique de l’écoulement des fluides reste mal comprise. Une approche alternative puissante consiste à utiliser des systèmes reconstitués in vitro qui permettent un contrôle total des divers constituants microscopiques et des paramètres du système, ce qui rend ces systèmes modèles optimaux pour l’analyse physique10,11. Cette approche a été utilisée avec succès pour étudier l’impact de la composition des protéines et de la géométrie du système sur la motilité à base d’actine 12,13,14,15,16,17,18, la structuration 2D des réseaux d’actomyosine 19,20,21,22, et l’interaction entre la contractilité du réseau et la dynamique de l’écoulement des fluides des gels d’actomyosine poroélastiques, qui fait l’objet de cet article23.
Dans ce manuscrit, la préparation de réseaux d’actomyosine élastique contractile de dimensions contrôlables et de propriétés matérielles est discutée sur la base des travaux d’Ideses et al.23. La dynamique du gel contractant et du solvant drainé est analysée et quantifiée, à travers laquelle il est démontré que ces gels d’actomyosine peuvent être décrits comme un matériau actif poroélastique. L’étude de l’effet de la viscosité des solvants sur la diffusivité des contraintes confirme encore le caractère poroélastique de ces réseaux. Les différentes relations de mise à l’échelle utilisées pour la quantification des données sont fournies. Enfin, les défis expérimentaux, les pièges courants et la pertinence des résultats expérimentaux pour le cytosquelette cellulaire sont également abordés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

Les cellules peuvent changer activement leurs formes et devenir mobiles, une propriété qui dépend de leur capacité à réorganiser activement leur structure interne. Cette caractéristique est attribuée aux propriétés mécaniques et dynamiques du cytosquelette cellulaire, notamment le cytosquelette d’actomyosine, qui est un gel actif de filaments d’actine polaire, de moteurs de myosine et de protéines accessoires qui présentent des propriétés de contraction intrinsèques. L’opinion généralement acceptée est que le cytosquelette se comporte comme un matériau viscoélastique. Cependant, ce modèle ne peut pas toujours expliquer les résultats expérimentaux, qui sont plus cohérents avec une image décrivant le cytosquelette comme une matière active poroélastique - un réseau élastique incorporé avec le cytosol. Les gradients de contractilité générés par les moteurs de myosine entraînent le flux du cytosol à travers les pores du gel, ce qui implique que la mécanique du cytosquelette et du cytosol est étroitement couplée. L’une des principales caractéristiques de la poroélasticité est la relaxation diffusive des contraintes dans le réseau, caractérisée par une constante de diffusion efficace qui dépend du module d’élasticité du gel, de la porosité et de la viscosité du cytosol (solvant). Comme les cellules ont de nombreuses façons de réguler leur structure et leurs propriétés matérielles, notre compréhension actuelle de la façon dont la mécanique du cytosquelette et la dynamique de l’écoulement du cytosol sont couplées reste mal comprise. Ici, une approche de reconstitution in vitro est utilisée pour caractériser les propriétés matérielles des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle pour le cytosquelette cellulaire. La contraction du gel est entraînée par la contractilité motrice de la myosine, ce qui conduit à l’émergence d’un écoulement du solvant pénétrant. L’article décrit comment préparer ces gels et mener des expériences. Nous discutons également de la façon de mesurer et d’analyser le flux de solvant et la contraction du gel à l’échelle locale et mondiale. Les différentes relations d’échelle utilisées pour la quantification des données sont données. Enfin, les défis expérimentaux et les pièges courants sont discutés, y compris leur pertinence pour la mécanique du cytosquelette cellulaire.

Deux lamelles de verre sont utilisées par expérience. Les lamelles de couverture en verre sont nettoyées et passivées avec des polymères PEG. La passivation est essentielle pour empêcher les protéines solubilisées d’adhérer aux surfaces vitrées aux premiers stades expérimentaux et pour minimiser l’interaction du réseau de contraction avec les parois vitreuses. L’échec d’une bonne passivation peut entraîner une contraction inefficace et, dans des cas extrêmes, peut même inhiber la formation du rés...

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The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Dans ce travail, une approche de reconstitution in vitro est utilisée pour étudier la poroélasticité des gels d’actomyosine dans des conditions contrôlées. La dynamique du gel d’actomyosine et du solvant incorporé est quantifiée, grâce à laquelle la poroélasticité du réseau est démontrée. Nous discutons également des défis expérimentaux, des pièges courants et de la pertinence pour la mécanique du cytosquelette cellulaire.

La mécanique des réseaux d’actomyosine contractile (poro-)élastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Nous avons développé une approche in vitro pour caractériser la mécanique des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire, et plus généralement, du cytoplasme, dont il a été démontré qu’ils se comportent comme un matériau actif poroélastique. Cette méthode permet de mieux comprendre comment la contractilité de la myosine contribue à l’émergence d’un écoulement de fluide et comment les vitesses du réseau et du cytosol sont corrélées dans le temps et l’espace. Cette approche simple nous permet d’extraire les propriétés mécaniques de systèmes évolutifs dynamiquement sans utiliser d’équipement ou de techniques sophistiquées où des outils conventionnels comme AFIM ne peuvent pas être utilisés.Cette méthode peut fournir des informations sur la rhéologie des matériaux actifs poroélastiques, quelle que soit la spécificité du gel actif et du fluide incorporé. Pour commencer, placez 10 à 12 lamelles de verre numéro 1.5 dans un support en polytétrafluoroéthylène fait maison et préparez la solution de Piranha dans un bécher de 400 millilitres. Préparer la solution sur de la glace dans une hotte chimique.Transférer le support dans le bécher rempli de piranha. Après trois heures, transférer le support dans un bécher propre rempli d’eau distillée double fraîche pour laver l’excès de Piranha des lamelles de couverture et transférer le bécher dans un bain de sonication à 80 hertz et à pleine puissance pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Répétez cette étape deux fois de plus avec de l’eau fraîche bidistillée.Pour la salinisation, transférer le support dans un bécher propre rempli de 300 millilitres de méthanol pur, puis dans un bain de sonication pendant 30 minutes. Transférer ensuite le support dans une solution de silane. Scellez le bécher avec du parafilm et conservez-le au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, transférez le support dans un bécher propre rempli de 300 millilitres de méthanol pur pendant 15 secondes. Sécher le fond du support pour enlever l’excès de méthanol et le transférer dans un bécher propre. Ensuite, transférez le bécher au four pour sécher les lamelles de verre pendant cinq minutes à 120 degrés Celsius.Pour obtenir une passivation de surface, prenez deux lamelles de couverture pour chaque expérience et placez-les dans une boîte de Petri recouverte d’une couche de parafilm initialement nettoyée à l’éthanol. Incuber chaque lamelle de couverture avec un millilitre de maléimide de méthoxypolyéthylèneglycol dans 1X PBS pendant une heure à 22 degrés Celsius. À la fin du processus d’incubation, inclinez la boîte de Petri pour la retirer et l’attacher.Rincer chaque couvercle avec cinq millilitres d’eau bidistillée et sécher avec un flux d’azote gazeux. Étant donné que les lamelles de couverture doivent être maintenues humides après la passivation, mettez immédiatement un millilitre de Tris 10 millimolaires sur les surfaces pégylées et utilisez les lamelles de couverture pendant deux heures. Pour former de gros agrégats de myosine, diluer la solution mère de myosine avec 10 millimolaires de Tris pour atteindre une concentration finale de 25 millimolaires de chlorure de potassium.Conservez la solution de myosine diluée pendant 10 minutes à température ambiante, puis transférez-la sur de la glace jusqu’à utilisation. Les moteurs sont pleinement actifs jusqu’à deux heures. pour suivre l’écoulement du solvant à travers les pores du gel, préparer des billes fluorescentes passivées et réduire l’interaction entre les billes et le réseau d’actomyosine en incubant un microlitre de billes avec cinq G-actine micromolaire pendant 20 minutes.Éliminer l’excès de G-actine par centrifugation. Répétez cette étape avec 10 milligrammes par millilitre d’albumine sérique bovine pour bloquer la surface non enduite restante et utilisez les billes à une dilution finale de un à 10 000 dans les expériences. Pour préparer la solution d’actomyosine, décongelez les aliquotes protéiques stockées à moins 80 degrés Celsius et placez-les sur de la glace.Ensuite, préparez la solution pour atteindre une concentration finale de 10 millimolaires Tris, cinq micromolaires G-actine, 280 nanomolaires GST Fascin, et 1,67 nanomolaire myosine II.Prenez l’un des couvercles passivés en polyéthylèneglycol. Placez une entretoise paraforme graissée sur le dessus et placez-la dans le porte-échantillon. Ajouter 1,1 microlitre de la solution d’actomyosine au couvercle monté sur support et placer le deuxième couvercle sur le dessus.Vissez le support pour sceller l’échantillon. Placez le porte-échantillon sur le microscope et commencez l’acquisition. Préparez le microscope à l’avance pour réduire le temps d’acquisition initial.Pour imager les échantillons avec un microscope fluorescent inversé, visualisez toute la zone de gel en utilisant de faibles grossissements de 2,5X objectif et suivez sa contraction macroscopique avec le temps. Utilisez un objectif 10X pour caractériser la porosité et la structure du réseau et pour suivre l’auto-organisation et la contraction du réseau avec le temps. Pour l’imagerie bicolore simultanée, excitez l’actine à 488 nanomètres et les moteurs de myosine II à 561 nanomètres et enregistrez les images simultanément sur une caméra EMCCD à l’aide d’un appareil à double émission.Utilisez le même système d’imagerie pour imager simultanément le gel d’actine et les moteurs fluorescents de myosine II. Pour une imagerie bicolore simultanée, excitez l’actine à 488 nanomètres et 2 perles de 300 nanomètres à 561 nanomètres. Et enregistrez les images simultanément sur une caméra EMCCD à l’aide d’un appareil à double émission.Utilisez le même système d’imagerie pour imager simultanément le gel d’actine et les billes fluorescentes. Le premier jour consiste à démontrer que le réseau d’actomyosine se comporte comme un matériau élastique. Une représentation schématique d’un réseau d’actomyosine est représentée ici.Les images de microscopie à fluorescence démontrent que les filaments d’actine nucléent spontanément et polymérisent en un réseau isotrope interconnecté qui grossit avec le temps et finit par se contracter macroscopiquement. L’attraction du réseau commence à la périphérie du gel et se propage vers l’intérieur dans la masse de gel. Le centre du gel est marqué d’un C.Les faisceaux de filaments d’actine restent droits pendant la contraction du réseau.La distribution du rapport entre la longueur du contour et la distance de bout en bout à T316 secondes et T327 secondes est illustrée ici. Le deuxième objectif consiste à démontrer qu’un flux de solvant sortant est généré par la contractilité de la myosine. L’image du gel à faible grossissement aux stades intermédiaires de contraction est montrée ici.Ces cercles marquent les positions de quatre perles. Les flèches marquent la direction globale du mouvement de la perle. Les trajectoires des neuf perles sélectionnées sont représentées ici.La résolution de la porosité du réseau et le mouvement du solvant à travers les pores du gel à des stades avancés de contraction sont décrits ici. Le troisième objectif consiste à démontrer que la relaxation des contraintes est caractérisée par une constante de diffusion poroélastique efficace. Les images de fluorescence d’un gel d’actomyosine contractant à faible grossissement du temps de mélange jusqu’à l’état d’équilibre sont montrées ici.Les réseaux d’actomyosine se comportent comme un matériau actif poroélastique. Lorsque vous tentez cette procédure, travaillez rapidement et avec précision et gardez à l’esprit l’importance de la préservation de la surface.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

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The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Recherche

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