Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Dina Aranovich für die Proteinreinigung und -kennzeichnung. G.L. dankt dem israelischen Ministerium für Wissenschaft, Technologie und Raumfahrt für das Jabotinsky-Promotionsstipendium. A.B.G. dankt der Israel Science Foundation (Grant 2101/20) und dem Ministry of Science and Technology - State of Israel (Grant 3-17491) für die finanzielle Unterstützung.

1. Glasoberflächenbehandlung und Passivierung:
HINWEIS: Dieser Abschnitt umfasst drei Hauptschritte (siehe Abbildung 1): (i) Reinigung und Hydrophilierung, (ii) Silanisierung und (iii) Oberflächenpassivierung.
<ol><li>Reinigung und Hydrophilierung<ol><li>Verwenden Sie Piranha-Lösung für die Reinigung von Glasoberflächen. HINWEIS: Die Piranha-Lösung ist ein Gemisch aus 30 % H2 O2 und 70 %H2 SO4 (Materialtabelle</s...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. 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F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. 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A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Hier wird ein in vitro Ansatz verwendet, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zellzytoplasmas zu charakterisieren, das sich nachweislich als poroelastisches Material verhält 3,5. Die Rheologie des Zellzytoskeletts (Zytoplasma) wurde durch eine poroelastische Diffusionskonstante charakterisiert, die bestimmt, wie lange es dauert, bis sich die intrazelluläre zytosolische Flüssigkei...

Lebende Zellen haben einzigartige mechanische Eigenschaften. Neben der Fähigkeit, passiv auf einwirkende Kräfte zu reagieren, sind sie auch in der Lage, aktiv Kräfte als Reaktion auf äußere Reize zu erzeugen1. Diese Eigenschaften, die für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, insbesondere während der Zellmotilität, unerlässlich sind, werden in erster Linie auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosin-Molekularmotoren und akzessorischen Proteinen ist. Diese Aktomyosin-Netzwerke weisen intrinsische Selbstorganisations- und Kontraktionseigenschaften auf, die von den Myosin-Motorproteinen angetrieben werden, die die Aktinfilamente vernetzen und aktiv mechanische Spannungen in dem Netzwerk erzeugen, das durch ATP-Hydrolyse angetrieben wird2.
Zahlreiche experimentelle und theoretische Studien wurden durchgeführt, um die Materialeigenschaften des Zytoskeletts3 zu untersuchen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält4. Das bedeutet, dass sich das Zytoskelett auf kurzen Zeitskalen wie ein elastisches Material verhält und sich auf langen Zeitskalen aufgrund der Vernetzung von Proteinen und der Ablösung (und Wiederanheftung) des Myosinmotors wie eine viskose Flüssigkeit verhält, wodurch sich das Netzwerk dynamisch drehen kann. In vielen Situationen kann das viskoelastische Modell jedoch nicht die experimentellen Ergebnisse beschreiben, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett und allgemeiner das Zellzytoplasma als poroelastisches aktives Material beschreibt 5,6. Zwei Hauptmerkmale charakterisieren diese Art von Materialien. (i) Das erste Hauptmerkmal ist die Erzeugung eines Flusses des eindringenden Zytosols (des "Lösungsmittels") durch die Gelporen durch Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren angetrieben werden, was Prozessen wie Zellblasen7, Motilität8 und Zellformoszillationen9 zugrunde liegt. Die Entstehung solcher zytosolischen Flüsse kann lokal sein, zum Blebbing, oder global, wie bei der Zellmotilität. Im letzteren Fall treiben die kontraktil aufgebrachten Spannungen an der Zellrückseite den Fluss der zytosolischen Flüssigkeit in Richtung Zellfront an, wodurch der Proteinpool wieder aufgefüllt wird, der für die Lamellipodien-Assemblierung benötigtwird 8. (ii) Das zweite Hauptmerkmal besteht darin, dass die Relaxation von Spannungen diffusiv ist und durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität des Gels und der Viskosität des Lösungsmittelsabhängt 5. Die poroelastische Diffusionskonstante bestimmt, wie schnell das System auf eine aufgebrachte Spannung reagiert. Höhere Diffusionskonstanten entsprechen einer schnelleren Spannungsumverteilung. Dies wiederum bestimmt, wie lange es dauert, bis die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit nach mechanischer Belastung, sei es von außen oder von innen, wie z. B. den aktiven kontraktilen Belastungen, die von Myosinmotoren erzeugt werden, innerhalb der Zelle umverteilt wird. Diese Beispiele zeigen somit, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind und nicht getrennt voneinander behandelt werden können3.
Da Zellen ihre mechanischen Eigenschaften auf unterschiedliche Weise regulieren können, ist das Zusammenspiel zwischen Netzwerkmechanik und Strömungsdynamik noch wenig verstanden. Ein leistungsfähiger alternativer Ansatz ist die Verwendung von in vitro rekonstituierten Systemen, die eine vollständige Kontrolle über die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile und die Systemparameter ermöglichen, wodurch diese Modellsysteme optimal für die physikalische Analyse geeignet sind10,11. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um den Einfluss der Proteinzusammensetzung und der Systemgeometrie auf die Aktin-basierte Motilität 12,13,14,15,16,17,18 und die 2D-Musterung von Aktomyosin-Netzwerken 19,20,21,22 zu untersuchen und das Zusammenspiel zwischen Netzwerkkontraktilität und Fluidströmungsdynamik poroelastischer Aktomyosingele, das im Mittelpunkt dieser Arbeitsteht 23.
In diesem Manuskript wird die Herstellung von kontraktilen elastischen Aktomyosin-Netzwerken mit kontrollierbaren Dimensionen und Materialeigenschaften auf der Grundlage der Arbeiten von Ideses et al.23 diskutiert. Die Dynamik des kontrahierenden Gels und des drainierten Lösungsmittels wird analysiert und quantifiziert, wodurch gezeigt wird, dass diese Aktomyosingele als poroelastisches aktives Material beschrieben werden können. Die Untersuchung des Einflusses der Lösungsmittelviskosität auf die Spannungsdiffusionsfähigkeit bestätigt die poroelastische Natur dieser Netzwerke. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden bereitgestellt. Schließlich werden auch die experimentellen Herausforderungen, die häufigsten Fallstricke und die Relevanz der experimentellen Ergebnisse für das Zellzytoskelett diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

Zellen können aktiv ihre Form verändern und beweglich werden, eine Eigenschaft, die von ihrer Fähigkeit abhängt, ihre innere Struktur aktiv neu zu organisieren. Diese Eigenschaft wird auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosinmotoren und akzessorischen Proteinen ist, die intrinsische Kontraktionseigenschaften aufweisen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält. Dieses Modell kann jedoch nicht immer die experimentellen Ergebnisse erklären, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett als poroelastisches aktives Material beschreibt - ein elastisches Netzwerk, das in Zytosol eingebettet ist. Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren erzeugt werden, treiben den Fluss des Zytosols durch die Gelporen an, was darauf schließen lässt, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind. Ein Hauptmerkmal der Poroelastizität ist die diffusive Relaxation von Spannungen im Netzwerk, die durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität und der Viskosität des Zytosols (Lösungsmittels) abhängt. Da Zellen viele Möglichkeiten haben, ihre Struktur und Materialeigenschaften zu regulieren, ist unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Mechanik des Zytoskeletts und die Dynamik des Zytosolflusses gekoppelt sind, noch wenig verstanden. Hier wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Materialeigenschaften von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem für das Zellzytoskelett zu charakterisieren. Die Gelkontraktion wird durch die motorische Kontraktilität des Myosins angetrieben, die zur Entstehung eines Flusses des eindringenden Lösungsmittels führt. Der Artikel beschreibt, wie diese Gele hergestellt und Experimente durchgeführt werden. Wir diskutieren auch, wie der Lösungsmittelfluss und die Gelkontraktion sowohl auf lokaler als auch auf globaler Ebene gemessen und analysiert werden können. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden angegeben. Abschließend werden die experimentellen Herausforderungen und häufigen Fallstricke diskutiert, einschließlich ihrer Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Pro Versuch werden zwei Glasdeckgläser verwendet. Die Glasdeckgläser werden mit PEG-Polymeren gereinigt und passiviert. Die Passivierung ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die gelösten Proteine bereits in frühen Versuchsstadien an den Glasoberflächen haften und um die Wechselwirkung des kontrahierenden Netzwerks mit den Glaswänden zu minimieren. Gelingt es nicht, eine gute Passivierung zu erreichen, kann dies zu einer ineffizienten Kontraktion führen und im Extremfall sogar die Bildung von Aktinnetzwerken h...

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The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

In dieser Arbeit wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Poroelastizität von Aktomyosingelen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Die Dynamik des Aktomyosingels und des eingebetteten Lösungsmittels wird quantifiziert, wodurch die Netzwerkporoelastizität nachgewiesen wird. Wir diskutieren auch die experimentellen Herausforderungen, häufige Fallstricke und die Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Die Mechanik (poro-)elastischer kontraktiler Actomyosin-Netzwerke als Modellsystem des Zellzytoskeletts

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Wir haben einen in vitro Ansatz entwickelt, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zytoplasmas zu charakterisieren, von denen gezeigt wurde, dass sie sich als poroelastisches aktives Material verhalten. Diese Methode gibt Aufschluss darüber, wie die Kontraktilität von Myosin zur Entstehung eines Flüssigkeitsflusses beiträgt und wie Netzwerk- und Zytosolgeschwindigkeiten zeitlich und räumlich korrelieren. Dieser einfache Ansatz ermöglicht es uns, die mechanischen Eigenschaften von sich dynamisch entwickelnden Systemen zu extrahieren, ohne ausgeklügelte Geräte oder Techniken zu verwenden, bei denen herkömmliche Werkzeuge wie AFIM nicht eingesetzt werden können.Diese Methode kann Einblicke in die Rheologie poroelastischer Aktivmaterialien liefern, unabhängig von der Spezifität des aktiven Gels und der eingebetteten Flüssigkeit. Legen Sie zunächst 10 bis 12 Glasdeckgläser der Nummer 1,5 in einen selbstgemachten Polytetrafluorethylenhalter und bereiten Sie die Piranha-Lösung in einem 400-Milliliter-Becherglas vor. Bereiten Sie die Lösung auf Eis in einer chemischen Haube vor.Den Halter in den Piranha-gefüllten Becher füllen. Nach drei Stunden füllen Sie den Halter in ein sauberes, mit frischem, doppelt destilliertem Wasser gefülltes Becherglas, um den überschüssigen Piranha von den Deckgläsern zu waschen, und überführen Sie den Becher in ein Beschallungsbad bei 80 Hertz und voller Leistung für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal mit frischem, doppelt destilliertem Wasser.Zur Versalzung wird der Halter in ein sauberes, mit 300 Millilitern reinem Methanol gefülltes Becherglas und dann für 30 Minuten in ein Beschallungsbad gegeben. Übertragen Sie dann den Halter in eine Silanlösung. Verschließen Sie das Becherglas mit Parafilm und bewahren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius im Kühlschrank auf.Am nächsten Tag den Halter für 15 Sekunden in ein sauberes Becherglas füllen, das mit 300 Millilitern reinem Methanol gefüllt ist. Trocknen Sie den Boden des Halters, um das überschüssige Methanol zu entfernen, und füllen Sie es in ein sauberes Becherglas. Anschließend das Becherglas in den Ofen schieben, um die Glasdeckgläser fünf Minuten lang bei 120 Grad Celsius zu trocknen.Um eine Oberflächenpassivierung zu erreichen, nehmen Sie für jedes Experiment zwei Deckgläser und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit einer zunächst mit Ethanol gereinigten Parafilmschicht beschichtet ist. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit einem Milliliter Methoxyethylenglykolmaleimid in 1X PBS für eine Stunde bei 22 Grad Celsius. Kippen Sie am Ende des Inkubationsvorgangs die Petrischale, um sie zu entfernen und zu befestigen.Spülen Sie jedes Deckglas mit fünf Millilitern doppelt destilliertem Wasser aus und trocknen Sie es mit Stickstoffgas. Da die Deckgläser nach der Passivierung feucht gehalten werden müssen, geben Sie sofort einen Milliliter 10 Millimolar Tris auf die pegylierten Oberflächen und verwenden Sie die Deckgläser innerhalb von zwei Stunden. Um große Myosin-Aggregate zu bilden, wird die Myosin-Stammlösung mit 10 millimolaren Tris verdünnt, um eine Endkonzentration von 25 millimolaren Kaliumchlorid zu erreichen.Bewahren Sie die verdünnte Myosinlösung 10 Minuten bei Raumtemperatur auf und übertragen Sie sie dann bis zur Verwendung auf Eis. Die Motoren sind bis zu zwei Stunden lang voll aktiv. Um den Lösungsmittelfluss durch die Gelporen zu verfolgen, stellen Sie passivierte fluoreszierende Beads her und reduzieren Sie die Wechselwirkung zwischen den Beads und dem Aktomyosin-Netzwerk, indem Sie einen Mikroliter Beads mit fünf mikromolaren G-Aktinen für 20 Minuten inkubieren.Entfernen Sie das überschüssige G-Aktin durch Zentrifugation. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 10 Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin, um die verbleibende unbeschichtete Oberfläche zu verstopfen, und verwenden Sie die Kügelchen in einer Endverdünnung von eins bis 10.000 in den Experimenten. Zur Herstellung der Aktomyosinlösung werden die bei minus 80 Grad Celsius gelagerten Proteinaliquote aufgetaut und auf Eis gelegt.Bereiten Sie dann die Lösung so vor, dass eine Endkonzentration von 10 millimolaren Tris, fünf mikromolaren G-Aktinen, 280 nanomolaren GST-Fascin und 1,67 nanomolaren Myosin II erreicht wird.Nehmen Sie eines der Polyethylenglykol-passivierten Deckgläser. Legen Sie einen gefetteten Paraform-Abstandshalter darauf und legen Sie ihn in den Probenhalter. Geben Sie 1,1 Mikroliter der Aktomyosinlösung auf das am Halter montierte Deckglas und legen Sie das zweite Deckglas darauf.Schrauben Sie den Halter fest, um die Probe zu versiegeln. Setzen Sie den Probenhalter auf das Mikroskop und starten Sie die Erfassung. Bereiten Sie das Mikroskop im Voraus vor, um die anfängliche Erfassungszeit zu verkürzen.Um die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop abzubilden, visualisieren Sie den gesamten Gelbereich mit einer niedrigen Vergrößerung des 2,5-fachen Objektivs und verfolgen Sie seine makroskopische Kontraktion mit der Zeit. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv, um die Porosität und Struktur des Netzwerks zu charakterisieren und die Selbstorganisation und Kontraktion des Netzwerks mit der Zeit zu verfolgen. Für die simultane zweifarbige Bildgebung wird das Aktin bei 488 Nanometern und die Myosin-II-Motoren bei 561 Nanometern angeregt und die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera mit einer Dual-Emissions-Apparatur aufgenommen.Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktin-Gel und die fluoreszierenden Myosin-II-Motoren abzubilden. Für die simultane zweifarbige Bildgebung wird das Aktin bei 488 Nanometern und 2.300 Nanometer Perlen bei 561 Nanometern angeregt. Und zeichnen Sie die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera mit einem Dual-Emission-Gerät auf.Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktin-Gel und die fluoreszierenden Kügelchen abzubilden. Am ersten Tag wird gezeigt, dass sich das Aktomyosin-Netzwerk wie ein elastisches Material verhält. Eine schematische Darstellung eines Aktomyosin-Netzwerks ist hier dargestellt.Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Aktinfilamente spontan nukleieren und zu einem isotropen, miteinander verbundenen Netzwerk polymerisieren, das sich mit der Zeit vergröbert und schließlich makroskopisch zusammenzieht. Die Netzwerkanziehung beginnt an der Gelperipherie und breitet sich nach innen in das Gelvolumen aus. Das Gelzentrum ist mit einem C markiert.Die Aktinfilamentbündel bleiben während der Netzwerkkontraktion gerade.Hier ist die Verteilung des Verhältnisses zwischen der Konturlänge und dem Ende-zu-Ende-Abstand bei T316 Sekunden und T327 Sekunden dargestellt. Das zweite Ziel besteht darin, zu zeigen, dass durch die Kontraktilität von Myosin ein nach außen gerichteter Lösungsmittelfluss erzeugt wird. Das Bild des Gels bei geringer Vergrößerung in Zwischenstadien der Kontraktion ist hier zu sehen.Diese Kreise markieren die Positionen von vier Perlen. Die Pfeile markieren die globale Richtung der Wulstbewegung. Hier sind die Flugbahnen der neun ausgewählten Perlen dargestellt.Die Auflösung der Netzwerkporosität und die Bewegung des Lösungsmittels durch die Gelporen in fortgeschrittenen Stadien der Kontraktion sind hier dargestellt. Das dritte Ziel besteht darin, zu zeigen, dass die Spannungsrelaxation durch eine effektive poroelastische Diffusionskonstante gekennzeichnet ist. Draufsicht-Fluoreszenzbilder eines kontrahierenden Aktomyosin-Gels bei geringer Vergrößerung von der Mischzeit bis zum stationären Zustand sind hier zu sehen.Die Aktomyosin-Netzwerke verhalten sich wie ein poroelastisch aktives Material. Arbeiten Sie bei diesem Verfahren schnell und genau und denken Sie an die Bedeutung der Oberflächenkonservierung.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Die Überwachung der Wand Mechanik Während der Entfaltung des Stents in einem Gefäß

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Die Mechanik der Linse Unterkunft über einen manuellen Objektiv Stretcher simulieren

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...