Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

ברצוננו להודות לדינה ארנוביץ על טיהור ותיוג החלבון. ג.ל. מודה למשרד המדע, הטכנולוגיה והחלל על מלגת ז'בוטינסקי לדוקטורט. א.ב.ג. מודה לקרן הלאומית למדע (מענק 2101/20) ולמשרד המדע והטכנולוגיה - מדינת ישראל (מענק 3-17491) על התמיכה הכספית.

1. טיפול במשטח זכוכית ופסיבציה:
הערה: חלק זה כולל שלושה שלבים עיקריים (ראה איור 1): (i) ניקוי והידרופיליזציה, (ii) סילניזציה, ו-(iii) פסיבציה של פני השטח.
<ol><li>ניקוי והידרופיליזציה<ol><li>השתמש בפתרון Piranha לניקוי משטח זכוכית. הערה: תמיסת פיראנה היא תערובת של 30% H 2 O 2 ו<...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

כאן, גישה במבחנה משמשת כדי לאפיין את המכניקה של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל של שלד התא, ובאופן כללי יותר, של הציטופלסמה של התא, אשר הוכח להתנהג כחומר פורואלסטי 3,5. הריאולוגיה של שלד התא (ציטופלסמה) מאופיינת בקבוע דיפוזיה פורואלסטי, המכתיב כמה זמ?...

לתאים חיים יש תכונות מכניות ייחודיות. מלבד היכולת להגיב באופן פסיבי לכוחות יישומיים, הם מסוגלים גם לייצר כוחות באופן פעיל בתגובה לגירויים חיצוניים1. מאפיינים אלה, החיוניים למגוון תהליכים תאיים, בעיקר במהלך תנועתיות התא, מיוחסים בעיקר לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, במיוחד שלד התא, שהוא ג'ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועים מולקולריים מיוזין וחלבונים נלווים. רשתות אקטומיוזין אלה מציגות תכונות ארגון עצמי והתכווצות מהותיות המונעות על ידי חלבונים מוטוריים מיוזין, אשר מצליבים את חוטי האקטין ויוצרים באופן פעיל לחצים מכניים ברשת המונעת על ידי הידרוליזה ATP2.
מחקרים ניסיוניים ותיאורטיים רבים נערכו כדי לחקור את התכונות החומריות של שלדציטו-שלד 3. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי4. משמעות הדבר היא כי בטווחי זמן קצרים, שלד הציטו-שלד מתנהג כחומר אלסטי, ובטווחי זמן ארוכים, הוא מתנהג כנוזל צמיגי עקב החלבונים הצולבים והניתוק המוטורי של מיוזין (וחיבור מחדש), המאפשר לרשת להתחלף באופן דינמי. עם זאת, במצבים רבים, המודל הוויסקו-אלסטי אינו יכול לתאר את תוצאות הניסוי, אשר תואמות יותר לתמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי, ובאופן כללי יותר, הציטופלסמה של התא המתוארת כחומר פעיל פורואלסטי 5,6. שני מאפיינים עיקריים מאפיינים סוגים אלה של חומרים. (i) התכונה העיקרית הראשונה היא יצירת זרימה של הציטוזול החודר ("הממס") על פני נקבוביות הג'ל על ידי שיפועי התכווצות המונעים על ידי מנועי המיוזין, העומדים בבסיס תהליכים כגון בלימת תאים7, תנועתיות8 ותנודות בצורת תא9. הופעתם של זרמים ציטוסוליים כאלה יכולה להיות מקומית, עבור blebbing, או גלובלית, כמו בתנועתיות התא. במקרה האחרון, הלחצים המופעלים על ידי התכווצות בחלק האחורי של התא מניעים את זרימת הנוזל הציטוסולי לכיוון חזית התא, אשר מחדש את מאגר החלבונים הדרוש להרכבת למליפודיה8. (ii) התכונה העיקרית השנייה היא שהרפיית הלחצים היא דיפוזית ומאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל, , התלוי במודולוס האלסטי של הג'ל, נקבוביות הג'ל וצמיגות הממס5. קבוע הדיפוזיה הפורואלסטי קובע כמה מהר המערכת מגיבה ללחץ מופעל. קבועי דיפוזיה גבוהים יותר מתאימים לחלוקה מחדש מהירה יותר של מתח. זה, בתורו, קובע כמה זמן לוקח לנוזל הציטוסולי התוך-תאי להיות מופץ מחדש בתוך התא בעקבות לחץ מכני מופעל, בין אם הוא חיצוני או פנימי, כגון הלחצים התכווצות הפעילים הנוצרים על ידי מנועי מיוזין. דוגמאות אלה, אם כן, מראות כי המכניקה של השלד והציטוזול מצומדים זה לזה באופן הדוק ולא ניתן לטפל בהם בנפרד3.
מכיוון שתאים יכולים לווסת את התכונות המכניות שלהם במגוון דרכים, יחסי הגומלין בין מכניקת הרשת ודינמיקת זרימת הנוזלים עדיין אינם מובנים. גישה חלופית רבת עוצמה היא להשתמש במערכות משוחזרות במבחנה המאפשרות שליטה מלאה במרכיבים המיקרוסקופיים השונים ובפרמטרים של המערכת, מה שהופך את מערכות המודל הללו לאופטימליות לניתוח פיזיקלי10,11. גישה זו יושמה בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של הרכב חלבונים וגיאומטריה של המערכת על תנועתיות מבוססת אקטין 12,13,14,15,16,17,18, דפוס דו-ממדי של רשתות אקטומיוזין 19,20,21,22ויחסי הגומלין בין התכווצות הרשת לבין דינמיקת זרימת הנוזלים של ג'לים אקטומיוזינים פורואלסטיים, העומדים במוקד מאמר זה23.,
בכתב יד זה, הכנת רשתות אקטומיוזין אלסטיות מתכווצות של ממדים ניתנים לשליטה ותכונות חומריות נדונה בהתבסס על עבודתם של Ideses et al.23. הדינמיקה של הג'ל המתכווץ והממס המנוקז מנותחים ומכומתים, שבאמצעותם הוכח כי ניתן לתאר ג'לים אקטומיוזינים אלה כחומר פעיל פורואלסטי. חקר ההשפעה של צמיגות ממס על דיפוזיביות מתח מאשר עוד יותר את האופי הפורובלסטי של רשתות אלה. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים מסופקים. לבסוף, נדונים גם אתגרי הניסוי, המלכודות הנפוצות, והרלוונטיות של תוצאות הניסוי לשלד התא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

תאים יכולים לשנות באופן פעיל את צורתם ולהפוך לתנועתיים, תכונה התלויה ביכולתם לארגן מחדש באופן פעיל את המבנה הפנימי שלהם. תכונה זו מיוחסת לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, בעיקר שלד האקטומיוזין (actomyosin cytoskeleton), שהוא ג'ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועי מיוזין וחלבוני עזר בעלי תכונות כיווץ פנימיות. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי. עם זאת, מודל זה אינו יכול תמיד להסביר את תוצאות הניסוי, אשר עקביות יותר עם תמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי כחומר פעיל פורואלסטי - רשת אלסטית המשובצת בציטוזול. שיפועי התכווצות הנוצרים על ידי מנועי המיוזין מניעים את זרימת הציטוזול על פני נקבוביות הג'ל, מה שמסיק שהמכניקה של שלד הציטו-שלד והציטוזול צמודים זה לזה. אחד המאפיינים העיקריים של פורואלסטיות הוא הרפיה דיפוזית של לחצים ברשת, המאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל התלוי במודולוס האלסטי של הג'ל, בנקבוביות ובצמיגות הציטוזול (ממס). מכיוון שלתאים יש דרכים רבות לווסת את המבנה שלהם ואת תכונות החומר שלהם, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי האופן שבו מכניקת השלד הציטו-שלד ודינמיקת זרימת הציטוזול מצומדים עדיין אינה מובנת. כאן, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת כדי לאפיין את התכונות החומריות של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל עבור שלד התא. התכווצות הג'ל מונעת על ידי התכווצות מנוע מיוזין, מה שמוביל להופעת זרימה של הממס החודר. המאמר מתאר כיצד להכין את הג'לים האלה ולערוך ניסויים. כמו כן, אנו דנים כיצד למדוד ולנתח את זרימת הממס והתכווצות הג'ל הן ברמה המקומית והן ברמה העולמית. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים ניתנים. לבסוף, נדונים אתגרי הניסוי והמלכודות הנפוצות, כולל הרלוונטיות שלהם למכניקת השלד התא.

בכל ניסוי נעשה שימוש בשני כיסויי זכוכית. כיסויי הזכוכית מנוקים ועוברים פסיבציה עם פולימרי PEG. פסיבציה חיונית למניעת היצמדות החלבונים המסיסים למשטחי הזכוכית בשלבי הניסוי המוקדמים ולמזעור האינטראקציה של הרשת המתכווצת עם דפנות הזכוכית. כישלון להשיג פסיבציה טובה יכול להוביל להתכווצות לא יע...

Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

פיתחנו גישה חוץ-גופית כדי לאפיין את המכניקה של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל של שלד התא, ובאופן כללי יותר, הציטופלסמה, אשר הוכחו כמתנהגים כחומר פעיל פורואלסטי. שיטה זו מספקת תובנות כיצד התכווצות מיוזין תורמת להופעת זרימת נוזל וכיצד מהירויות רשת וציטוזול מתואמות בזמן ובמרחב. גישה פשוטה זו מאפשרת לנו לחלץ את התכונות המכניות של מערכות המתפתחות באופן דינמי מבלי להשתמש בציוד או טכניקות מתוחכמות שבהן לא ניתן להשתמש בכלים קונבנציונליים כמו AFIM.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הריאולוגיה של חומרים פעילים פורואלסטיים ללא קשר לספציפיות של הג'ל הפעיל והנוזל המשובץ. כדי להתחיל, מניחים 10 עד 12 מספר 1.5 זכוכית מכסה במחזיק פוליטטרפלואוראתילן תוצרת בית ולהכין פתרון פיראנה בכוס 400 מיליליטר. הכינו את התמיסה על קרח במכסה מנוע כימי.מעבירים את המחזיק לכד מלא פיראנה. לאחר שלוש שעות, מעבירים את המחזיק לכוס נקייה מלאה במים מזוקקים כפולים טריים כדי לשטוף את עודפי הפיראנה מהכיסויים ומעבירים את הכד לאמבט סוניקציה ב 80 הרץ ובעוצמה מלאה למשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעמיים נוספות עם מים מזוקקים כפולים טריים.להמלחה, מעבירים את המחזיק לכוס נקייה מלאה ב -300 מיליליטר מתנול טהור, ואז לאמבט סוניקציה למשך 30 דקות. לאחר מכן להעביר את המחזיק לתוך פתרון סילאן. אטמו את הכד בפרפילם ושמרו אותו במקרר בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך הלילה.למחרת, להעביר את המחזיק לתוך נקייה מלא 300 מיליליטר של מתנול טהור במשך 15 שניות. יבשו את תחתית המחזיק כדי להסיר את עודפי המתנול והעבירו אותו לכוס נקייה. לאחר מכן מעבירים את הכד לתנור לייבוש מכסי הזכוכית למשך חמש דקות בחום של 120 מעלות.כדי להשיג פסיבציה של פני השטח, קחו שתי כיסויים לכל ניסוי והניחו אותן בצלוחית פטרי המצופה בשכבת פרפילם שנוקתה בתחילה באתנול. יש לדגור על כל כיסוי עם מיליליטר אחד של מתוקסיפוליאתילן גליקול מלימיד ב-1X PBS למשך שעה אחת בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. בסוף תהליך הדגירה, מטים את צלחת הפטרי כדי להסיר ולהצמיד.יש לשטוף כל כיסוי בחמישה מיליליטר מים מזוקקים כפול ולייבש בזרימה של גז חנקן. מכיוון שיש לשמור על הכיסויים רטובים לאחר פסיבציה, הניחו מיד מיליליטר אחד של 10 מילימולר טריס על המשטחים הפגילטיים והשתמשו בכיסויים תוך שעתיים. כדי ליצור אגרגטים מיוזין גדולים, לדלל את תמיסת מלאי מיוזין עם 10 מילימולר Tris כדי להגיע לריכוז סופי של 25 מילימולר אשלגן כלורי.שמור את תמיסת המיוזין המדוללת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העבר אותה לקרח עד לשימוש. המנועים פעילים באופן מלא עד שעתיים. כדי לעקוב אחר זרימת הממס על פני נקבוביות הג'ל, הכינו חרוזים פלואורסצנטיים פסיביים והפחיתו את האינטראקציה בין החרוזים לרשת האקטומיוזין על ידי דגירה של מיקרוליטר אחד של חרוזים עם חמישה מיקרומולרים G-actin למשך 20 דקות.הסר את עודף G- actin על ידי צנטריפוגה. חזור על שלב זה עם 10 מיליגרם למיליליטר של אלבומין בסרום בקר כדי לחסום את פני השטח הלא מצופים הנותרים ולהשתמש בחרוזים בדילול סופי של אחד עד 10, 000 בניסויים. כדי להכין את תמיסת האקטומיוזין, הפשירו את החלבון אליציטוטים המאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס והניחו אותם על קרח.לאחר מכן הכינו את התמיסה כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מילימולרית Tris, חמישה מיקרומולרים G-actin, 280 nanomolar GST Fascin, ו 1.67 nanomolar myosin II.Take אחד הפוליאתילן גליקול פסיבי coverslips. מניחים עליו ספייסר פרפורם משומן ומניחים אותו במחזיק הדגימה. הוסף 1.1 מיקרוליטר של תמיסת האקטומיוזין לתלוש הכיסוי המותקן במחזיק והנח את הכיסוי השני למעלה.הברג את המחזיק כדי לאטום את הדגימה. הניחו את מחזיק הדגימה על המיקרוסקופ והתחילו את הרכישה. הכינו את המיקרוסקופ מראש כדי לקצר את זמן הרכישה הראשוני.כדי לצלם את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, דמיינו את כל אזור הג'ל באמצעות הגדלות נמוכות של פי 2.5 ועקבו אחר ההתכווצות המקרוסקופית שלו עם הזמן. השתמש במטרה 10X כדי לאפיין את נקבוביות הרשת ומבנהה, ולעקוב אחר הארגון העצמי של הרשת והתכווצות עם הזמן. להדמיה סימולטנית של שני צבעים, הרגש את מנועי האקטין ב-488 ננומטר ואת מנועי מיוזין II ב-561 ננומטר והקלט את התמונות בו-זמנית במצלמת EMCCD באמצעות מנגנון פליטה כפול.השתמש באותה מערכת הדמיה כדי לצלם בו זמנית את ג'ל האקטין ואת מנועי המיוזין II הפלואורסצנטיים. להדמיה סימולטנית של שני צבעים, לעורר את האקטין ב 488 ננומטר ו 2, 300 ננומטר חרוזים ב 561 ננומטר. והקלט את התמונות בו-זמנית במצלמת EMCCD באמצעות מנגנון פליטה כפול.השתמש באותה מערכת הדמיה כדי לצלם בו זמנית את ג'ל האקטין ואת החרוזים הפלואורסצנטיים. היום הראשון כולל הדגמה כי רשת האקטומיוזין מתנהגת כחומר אלסטי. ייצוג סכמטי של רשת אקטומיוזין מתואר כאן.תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראות כי חוטי האקטין מתגרגרים ומתפלמרים באופן ספונטני לרשת איזוטרופית מקושרת המתגבשת עם הזמן ובסופו של דבר מתכווצת באופן מקרוסקופי. משיכת הרשת מתחילה בפריפריית הג'ל ומתפשטת פנימה לתוך תפזורת הג'ל. מרכז הג'ל מסומן באות C.צרורות חוטי האקטין נשארים ישרים במהלך התכווצות הרשת.ההתפלגות של היחס בין אורך קווי המתאר למרחק מקצה לקצה ב- T316 שניות ו- T327 שניות מוצגת כאן. המטרה השנייה כוללת הדגמה שזרימת ממס כלפי חוץ נוצרת על ידי התכווצות מיוזין. התמונה של הג'ל בהגדלה נמוכה בשלבי ביניים של התכווצות מוצגת כאן.עיגולים אלה מסמנים את מיקומם של ארבעה חרוזים. החצים מסמנים את הכיוון הגלובלי של תנועת החרוזים. מסלוליהם של תשעת החרוזים שנבחרו מתוארים כאן.פתרון נקבוביות הרשת ותנועת הממס על פני נקבוביות הג'ל בשלבים מתקדמים של התכווצות מתוארים כאן. המטרה השלישית כוללת הדגמה כי הרפיית מתח מאופיינת בקבוע דיפוזיה פורואלסטי יעיל. תמונות פלואורסצנטיות בתצוגה עליונה של ג'ל אקטומיוזין מתכווץ בהגדלה נמוכה מזמן הערבוב ועד למצב היציב מוצגות כאן.רשתות האקטומיוזין מתנהגות כחומר פעיל פורואלסטי. בעת ניסיון הליך זה, לעבוד מהר ומדויק ולזכור את החשיבות של שימור פני השטח.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

מעקב אחר מכניקה קיר במהלך פריסה סטנט בכלי

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

כדי לדמות את המכניקה של העדשה לינה דרך אלונקה מדריך עדשה

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...