Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

タンパク質の精製とラベリングを提供してくれたDina Aranovichに感謝します。G.L.は、ジャボチンスキー博士号奨学金を提供してくれたイスラエル科学技術宇宙省に感謝しています。A.B.G.は、イスラエル科学財団(助成金2101/20)と科学技術省-イスラエル国(助成金3-17491)の財政的支援に感謝しています。

1.ガラス表面処理と不動態化:
注:このセクションには、(i)洗浄と親水化、(ii)シラン化、および(iii)表面不動態化の3つの主要なステップが含まれています( 図1を参照)。
<ol><li>洗浄と親水化<ol><li>ガラス表面の洗浄にはピラニア溶液を使用してください。 注:ピラニア溶液は、30%H 2 O 2と70%H2SO4の混合物です(材料...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

ここでは、多孔弾性アクトミオシンゲルの力学を細胞骨格のモデル系として特徴付けるためにin vitroアプローチが採用されており、より一般的には、多孔弾性材料として振る舞うことが示されている細胞質のモデルシステムとして3,5。細胞骨格(細胞質)のレオロジーは、多孔弾性拡散定数によって特徴付けられており、これは、加えられた機?...

生細胞は独特の機械的性質を持っています。加えられた力に受動的に反応する能力に加えて、それらはまた、外部刺激に応答して能動的に力を生成することができる1。これらの特性は、特に細胞運動中のさまざまな細胞プロセスに不可欠であり、主に細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシン分子モーター、およびアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。これらのアクトミオシンネットワークは、アクチンフィラメントを架橋し、ATP加水分解によって燃料となるネットワークに機械的ストレスを積極的に生成するミオシンモータータンパク質によって駆動される固有の自己組織化および収縮特性を示します2。
細胞骨格の材料特性を研究するために、数多くの実験的および理論的研究が行われてきた3。一般に受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料4として振る舞うというものである。これは、短い時間スケールでは細胞骨格が弾性材料として振る舞い、長い時間スケールでは、架橋タンパク質とミオシンモーターの剥離(および再付着)により粘性流体として振る舞い、ネットワークが動的に回転することを可能にすることを意味します。しかし、多くの場合、粘弾性モデルは実験結果を記述できず、細胞骨格、より一般的には細胞質が多孔弾性活物質として記述されている図とより一致しています5,6。2つの主な特徴がこれらのタイプの材料を特徴付ける。(i)第1の主な特徴は、細胞ブレブ7、運動性8、細胞形状振動9などのプロセスの根底にあるミオシンモーターによって駆動される収縮性勾配によって、ゲル細孔を横切る浸透性細胞ゾル(「溶媒」)の流れの生成です。そのような細胞質流の出現は、ブレブのために局所的であり得るか、または細胞運動性のように局所的であり得る。後者の場合、細胞後部で加えられた収縮応力は、細胞前面に向かって細胞質液の流れを駆動し、それはラメリポディアアセンブリ8に必要なタンパク質プールを補充する。(ii)第2の主な特徴は、応力の緩和が拡散性であり、ゲル弾性率、ゲル多孔度、および溶媒粘度に依存する実効拡散定数によって特徴付けられることです5。多孔弾性拡散定数は、加えられた応力に対するシステムの応答速度を決定します。拡散定数が高いほど、応力の再分布が速くなります。これにより、ミオシンモーターによって生成される活発な収縮ストレスなど、外部または内部に適用された機械的ストレスの後に、細胞内細胞質液が細胞内に再分配されるのにかかる時間が決まります。したがって、これらの例は、細胞骨格と細胞質ゾルの機構が緊密に結合しており、別々に扱うことができないことを示しています3。
細胞はさまざまな方法で機械的特性を調節できるため、ネットワーク力学と流体力学の相互作用はよくわかっていません。強力な代替アプローチは、さまざまな微視的成分とシステムパラメータの完全な制御を可能にするin vitro再構成システムを使用することであり、これにより、これらのモデルシステムは物理分析に最適です10,11。このアプローチは、アクチンベースの運動性に対するタンパク質組成とシステム形状の影響を研究するために首尾よく採用されています12、13、14、15、16、17、18、アクトミオシンネットワークの2Dパターニング19、20、21、22、およびこの論文の焦点である多孔弾性アクトミオシンゲルのネットワーク収縮性と流体力学の間の相互作用23。
この原稿では、制御可能な寸法と材料特性の収縮弾性アクトミオシンネットワークの調製について、Ideses et al.23の研究に基づいて議論されています。収縮ゲルと排出溶媒のダイナミクスが分析および定量化され、これらのアクトミオシンゲルが多孔弾性活物質として記述できることが実証されます。応力拡散性に対する溶媒粘度の影響を研究することで、これらのネットワークの多孔弾性特性がさらに確認されます。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が提供されます。最後に、実験上の課題、一般的な落とし穴、および実験結果と細胞骨格との関連性についても説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

細胞は活発にその形状を変えて運動性になることができ、これはそれらの内部構造を活発に再編成する能力に依存する特性である。この特徴は、細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシンモーター、および固有の収縮特性を示すアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。通常受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料として振る舞うというものです。しかし、このモデルは、細胞骨格を多孔弾性活物質(細胞質ゾルが埋め込まれた弾性ネットワーク)として記述する図とより一致する実験結果を常に説明できるとは限らない。ミオシンモーターによって生成された収縮性勾配は、ゲル細孔を横切る細胞質ゾルの流れを駆動し、細胞骨格と細胞質ゾルの力学が密接に結合していることを推測します。多孔弾性の主な特徴の1つは、ゲル弾性率、多孔性、および細胞質ゾル(溶媒)粘度に依存する有効拡散定数によって特徴付けられる、ネットワーク内の応力の拡散緩和です。細胞はその構造と材料特性を調節する多くの方法を持っているため、細胞骨格力学と細胞質ゾルの流れのダイナミクスがどのように結合しているかについての現在の理解はよくわかっていません。ここでは、細胞細胞骨格のモデル系としての多孔弾性アクトミオシンゲルの材料特性を特徴付けるために、 in vitro 再構成アプローチが採用されています。ゲル収縮はミオシン運動収縮性によって駆動され、それは浸透溶媒の流れの出現をもたらす。この論文では、これらのゲルを調製し、実験を実行する方法について説明します。また、溶媒の流れとゲルの収縮をローカルスケールとグローバルスケールの両方で測定および分析する方法についても説明します。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が示されています。最後に、細胞骨格力学との関連性を含め、実験上の課題と一般的な落とし穴について説明します。

実験ごとに2枚のガラスカバースリップが使用されます。ガラスカバーガラスは、PEGポリマーで洗浄および不動態化されています。パッシベーションは、可溶化タンパク質が実験の初期段階でガラス表面に付着するのを防ぎ、収縮ネットワークとガラス壁との相互作用を最小限に抑えるために不可欠です。良好な不動態化を達成できないと、非効率的な収縮につながる可能性があり、極端な場...

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The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

この研究では、制御された条件下でのアクトミオシンゲルの多孔弾性を研究するために 、in vitro 再構成アプローチが採用されています。アクトミオシンゲルと包埋溶媒のダイナミクスが定量化され、それを通してネットワークの多孔弾性が実証されます。また、実験上の課題、一般的な落とし穴、および細胞骨格力学との関連性についても説明します。

細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

私たちは、多孔弾性活性物質として振る舞うことが示されている細胞骨格、より一般的には細胞質のモデル系として、多孔弾性アクトミオシンゲルのメカニズムを特徴付けるためのin vitroアプローチを開発しました。この方法は、ミオシンの収縮性が流体の流れの出現にどのように寄与するか、およびネットワークと細胞質ゾル速度が時間と空間でどのように相関しているかについての洞察を提供します。このシンプルなアプローチにより、AFIMのような従来のツールでは使用できない高度な機器や技術を使用せずに、動的に進化するシステムの機械的特性を抽出することができます。この方法は、活性ゲルと包埋流体の特異性に関係なく、多孔弾性活物質のレオロジーに関する洞察を提供することができます。まず、自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダーに10〜12個の1.5番のガラスカバーガラスを置き、400ミリリットルのビーカーにピラニア溶液を準備します。化学フードで氷の上で溶液を準備します。ホルダーをピラニア充填ビーカーに移します。3時間後、カバーガラスから余分なピラニアを洗い流すために新鮮な二重蒸留水で満たされたきれいなビーカーにホルダーを移し、ビーカーを80ヘルツの超音波処理浴に移し、摂氏25度で10分間フルパワーします。新鮮な二重蒸留水でこの手順をさらに2回繰り返します。塩類化のために、ホルダーを300ミリリットルの純粋なメタノールで満たされたきれいなビーカーに移し、次いで30分間超音波処理浴に移す。次に、ホルダーをシラン溶液に移します。ビーカーをパラフィルムで密封し、摂氏4度の冷蔵庫に一晩保管します。翌日、ホルダーを300ミリリットルの純粋なメタノールで満たされたきれいなビーカーに15秒間移します。ホルダーの底を乾かして余分なメタノールを取り除き、きれいなビーカーに移します。次に、ビーカーをオーブンに移して、ガラスのカバーガラスを摂氏120度で5分間乾燥させます。表面不動態化を実現するには、実験ごとに2つのカバースリップを取り、最初にエタノールで洗浄したパラフィルム層でコーティングされたペトリ皿に入れます。各カバーガラスを1ミリリットルのメトキシポリエチレングリコールマレイミドと1X PBSで摂氏22度で1時間インキュベートします。インキュベーションプロセスの最後に、ペトリ皿を傾けて取り外し、ペグします。各カバーガラスを5ミリリットルの二重蒸留水ですすぎ、窒素ガスの流れで乾かします。カバーガラスは不動態化後も濡れたままにしておく必要があるため、すぐに1ミリリットルの10ミリモルのトリスをペグ化面に置き、カバーガラスを2時間使用します。大きなミオシン凝集体を形成するには、ミオシンストック溶液を10ミリモルのトリスで希釈して、最終濃度の25ミリモルの塩化カリウムにします。希釈したミオシン溶液を室温で10分間保持してから、使用するまで氷に移します。モーターは最大2時間完全にアクティブです。ゲル細孔を横切る溶媒の流れを追跡するには、不動態化蛍光ビーズを調製し、1マイクロリットルのビーズを5マイクロモルのG-アクチンと20分間インキュベートすることにより、ビーズとアクトミオシンネットワーク間の相互作用を低減します。遠心分離により余分なG-アクチンを除去します。残りのコーティングされていない表面をブロックするために、1ミリリットル当たり10ミリグラムのウシ血清アルブミンでこのステップを繰り返し、実験において1〜10, 000の最終希釈でビーズを使用する。アクトミオシン溶液を調製するには、マイナス80°Cで保存されたタンパク質アリコートを解凍し、氷の上に置きます。次に、10ミリモルのトリス、5マイクロモルのGアクチン、280ナノモルのGSTファシン、および1.67ナノモルのミオシンIIの最終濃度に達するように溶液を調製します。グリースを塗ったパラフォームスペーサーをその上に置き、サンプルホルダーに入れます。ホルダーに取り付けられたカバーガラスに1.1マイクロリットルのアクトミオシン溶液を追加し、2番目のカバーガラスを上に置きます。ホルダーをねじ込んでサンプルを密封します。サンプルホルダーを顕微鏡に置き、取得を開始します。初期取得時間を短縮するために、事前に顕微鏡を準備してください。倒立蛍光顕微鏡でサンプルを画像化するには、2.5倍の低倍率対物レンズを使用してゲル領域全体を視覚化し、その巨視的な収縮を経時的に追跡します。10倍対物レンズを使用して、ネットワークの多孔性と構造を特徴付け、ネットワークの自己組織化と収縮を時間とともに追跡します。2色同時イメージングでは、アクチンを488ナノメートル、ミオシンIIモーターを561ナノメートルで励起し、デュアル発光装置を使用してEMCCDカメラに同時に画像を記録します。同じイメージングシステムを使用して、アクチンゲルと蛍光ミオシンIIモーターを同時にイメージングします。同時2色イメージングのために、アクチンを488ナノメートルで、そして2, 300ナノメートルビーズを561ナノメートルで励起する。そして、デュアルエミッション装置を使用してEMCCDカメラで同時に画像を記録します。同じイメージングシステムを使用して、アクチンゲルと蛍光ビーズを同時にイメージングします。初日は、アクトミオシンネットワークが弾性材料として振る舞うことを実証することを含みます。アクトミオシンネットワークの概略図をここに描く。蛍光顕微鏡画像は、アクチンフィラメントが自発的に核形成して等方性の相互連結ネットワークに重合し、時間とともに粗大化し、最終的には巨視的に収縮することを示しています。ネットワーク誘引はゲル周辺で始まり、ゲルバルク内に内向きに伝播します。ゲルの中心はC.アクチンフィラメントバンドルでマークされています ネットワーク収縮中もまっすぐなままです。T316秒とT327秒における輪郭長と端から端までの距離の比率の分布をここに示します。第2の目的は、ミオシンの収縮性によって外向きの溶媒流が生成されることを実証することです。収縮の中間段階での低倍率でのゲルの画像がここにあります。これらの円は4つのビーズの位置を示します。矢印はビードモーションのグローバル方向を示します。選択された9つのビーズの軌跡がここに描かれています。ネットワークの多孔性と、収縮の進行段階でのゲル細孔を横切る溶媒の移動を分解することがここに描かれています。第3の目的は、応力緩和が有効な多孔弾性拡散定数によって特徴付けられることを実証することである。混合時間から定常状態までの低倍率での収縮アクトミオシンゲルの蛍光画像を上面図に示します。アクトミオシンネットワークは多孔弾性活物質として振る舞う。この手順を試みるときは、迅速かつ正確に作業し、表面保存の重要性を念頭に置いてください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

ティッシュエンジニアーコンストラクトの成長評価のための磁気共鳴エラストグラフィの方法論

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

容器内ステントの展開中の壁の力学を監視する

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

マニュアル レンズ担架による焦点調節機構のシミュレーション

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

組換えコラーゲン ペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...