Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

단백질 정제 및 라벨링에 대해 Dina Aranovich에게 감사드립니다. GL은 Jabotinsky 박사 학위 장학금에 대해 이스라엘 과학 기술 우주부에 감사드립니다. ABG는 재정 지원에 대해 이스라엘 과학 재단(보조금 2101/20)과 이스라엘 과학 기술부(보조금 3-17491)에 감사드립니다.

1. 유리 표면 처리 및 부동태화:
알림: 이 섹션에는 (i) 세척 및 친수화, (ii) 실란화 및 (iii) 표면 패시베이션의 세 가지 주요 단계가 포함됩니다( 그림 1 참조).
<ol><li>세척 및 친수성<ol><li>유리 표면 청소를 위해 피라냐 용액을 사용하십시오. 참고 : 피라냐 용액은 30 % H 2 O 2 와 70 % H2SO4 (재료 표)의 혼합물입니다.</...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

여기서, 시험관내 접근법은 세포 세포골격의 모델 시스템으로서, 그리고 보다 일반적으로는 다공탄성 물질로서 거동하는 것으로 밝혀진 세포 세포질의 다공탄성 악토미오신 겔의 역학을 특성화하기 위해 사용된다 3,5. 세포 세포 골격(세포질)의 유변학은 기계적 스트레스가 가해진 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시...

살아있는 세포는 독특한 기계적 성질을 가지고 있습니다. 적용된 힘에 수동적으로 반응하는 능력 외에도 외부 자극에 반응하여 능동적으로 힘을 생성할 수 있습니다1. 다양한 세포 과정, 특히 세포 운동성 동안 필수적인 이러한 특성은 주로 세포 세포 골격, 특히 극성 액틴 필라멘트, 미오신 분자 모터 및 부속 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격의 기계적 및 동적 특성에 기인합니다. 이러한 악토미오신 네트워크는 액틴 필라멘트를 가교결합하고 ATP 가수분해에 의해 연료가 공급되는 네트워크에서 기계적 응력을 능동적으로 생성하는 미오신 운동 단백질에 의해 구동되는 고유한 자기 조직화 및 수축 특성을 나타냅니다2.
세포골격3의 물질적 성질을 연구하기 위해 수많은 실험적, 이론적 연구가 수행되었다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 행동한다는 것이다4. 즉, 짧은 시간 척도에서 세포 골격은 탄성 물질로 작용하고 긴 시간 척도에서는 가교 단백질과 미오신 운동 분리 (및 재 부착)로 인해 점성 유체로 작용하여 네트워크가 동적으로 회전할 수 있습니다. 그러나, 많은 상황에서, 점탄성 모델은 실험 결과를 설명할 수 없으며, 이는 세포골격 및 보다 일반적으로는 다공탄성 활성 물질로서 기술되는 세포 세포질을 기술하는 그림과 더 일치한다 5,6. 이러한 유형의 재료를 특징 짓는 두 가지 주요 특징이 있습니다. (i) 첫 번째 주요 특징은 세포 블리빙(cell blebbing)7, 운동성(motility)8, 세포 모양 진동(cell shape oscillation)9과 같은 과정의 기초가 되는 미오신 모터(myosin motor)에 의해 구동되는 수축성 구배(contractability gradients)에 의해 겔 공극을 가로지르는 관통 세포질("용매")의 흐름의 생성이다. 이러한 세포질 흐름의 출현은 세포 운동성과 같이 국소적, 출혈 또는 전 세계적일 수 있습니다. 후자의 경우, 세포 후면에 수축 가해진 응력은 세포질 유체의 흐름을 세포 전면으로 유도하여 라멜리포디아 조립에 필요한 단백질 풀을 보충한다8. (ii) 두 번째 주요 특징은 응력의 완화가 확산되고 겔 탄성률, 겔 다공성 및 용매 점도에 따라 달라지는 유효 확산 상수를 특징으로 한다는 것입니다5. 다공탄성 확산 상수는 시스템이 적용된 응력에 얼마나 빨리 반응하는지를 결정합니다. 확산 상수가 높을수록 응력 재분포가 빨라집니다. 이것은 차례로 미오신 모터에 의해 생성된 활성 수축 응력과 같은 외부 또는 내부의 기계적 응력을 가한 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시간을 결정합니다. 따라서 이러한 예는 세포 골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있으며 별도로 치료할 수 없음을 보여줍니다3.
세포는 다양한 방식으로 기계적 특성을 조절할 수 있기 때문에 네트워크 역학과 유체 흐름 역학 간의 상호 작용은 잘 이해되지 않고 있습니다. 강력한 대안적 접근법은 다양한 미세 성분 및 시스템 파라미터를 완전히 제어할 수 있는 시험관 내 재구성 시스템을 사용하는 것이며, 이는 이러한 모델 시스템을 물리적 분석에 최적으로 만듭니다(10,11). 이 접근법은 액틴 기반 운동성 12,13,14,15,16,17,18, 악토미오신 네트워크의 2D 패터닝에 대한 단백질 구성 및 시스템 기하학의 영향을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다 19,20,21,22, 그리고 다공성 악토미오신 겔의 네트워크 수축성과 유체 흐름 역학 사이의 상호 작용, 이는 이 논문의 초점입니다23.
이 원고에서는 제어 가능한 치수 및 재료 특성의 수축성 탄성 악토미오신 네트워크의 준비는 Ideses et al.23의 연구를 기반으로 논의됩니다. 수축 겔과 배출 된 용매의 역학을 분석하고 정량화하여, 이러한 악토 미오신 겔이 다공성 활성 물질로 설명 될 수 있음을 입증합니다. 응력 확산도에 대한 용매 점도의 영향을 연구하면 이러한 네트워크의 다공성 탄성 특성을 추가로 확인할 수 있습니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 실험 과제, 일반적인 함정 및 실험 결과와 세포 골격의 관련성에 대해서도 논의합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

세포는 적극적으로 모양을 바꾸고 운동성을 가질 수 있으며, 이는 내부 구조를 능동적으로 재구성하는 능력에 달려 있습니다. 이 특징은 세포 세포 골격의 기계적 및 동적 특성, 특히 고유 수축 특성을 나타내는 극성 액틴 필라멘트, 미오신 모터 및 보조 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격에 기인합니다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 작용한다는 것입니다. 그러나 이 모델은 실험 결과를 항상 설명할 수 없으며, 이는 세포골격을 다공탄성 활성 물질(세포질에 내장된 탄성 네트워크)로 설명하는 그림과 더 일치합니다. 미오신 모터에 의해 생성된 수축성 구배는 겔 기공을 가로질러 세포질의 흐름을 유도하며, 이는 세포골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있음을 추론합니다. 다공탄성의 주요 특징 중 하나는 겔 탄성률, 다공성 및 세포질(용매) 점도에 따라 달라지는 효과적인 확산 상수를 특징으로 하는 네트워크의 응력 확산 완화입니다. 세포는 구조와 물질 특성을 조절할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 세포 골격 역학과 세포질 흐름 역학이 어떻게 결합되는지에 대한 우리의 현재 이해는 잘 알려져 있지 않습니다. 여기서, 시험관 내 재구성 접근법은 세포 세포 골격에 대한 모델 시스템으로서 다공성 악토미오신 겔의 물질 특성을 특성화하기 위해 사용됩니다. 겔 수축은 미오신 운동 수축력에 의해 구동되며, 이는 침투 용매의 흐름의 출현으로 이어진다. 이 논문은 이러한 젤을 준비하고 실험을 실행하는 방법을 설명합니다. 또한 용매 흐름과 겔 수축을 지역 및 글로벌 규모에서 측정하고 분석하는 방법에 대해서도 논의합니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 세포 세포 골격 역학과의 관련성을 포함하여 실험적 과제와 일반적인 함정에 대해 논의합니다.

실험당 두 개의 유리 커버슬립이 사용됩니다. 유리 커버슬립은 PEG 폴리머로 세척 및 부동태화됩니다. 패시베이션은 초기 실험 단계에서 가용화된 단백질이 유리 표면에 부착되는 것을 방지하고 수축 네트워크와 유리 벽의 상호 작용을 최소화하는 데 필수적입니다. 좋은 패시베이션을 달성하지 못하면 비효율적인 수축이 발생할 수 있으며 극단적인 경우 액틴 네트워크 형성을 억제할 수도 있습니...

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The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

이 연구에서는 통제된 조건에서 악토미오신 겔의 다공성 탄성을 연구하기 위해 시험관 내 재구성 접근법을 사용합니다. 악토미오신 겔과 포매된 용매의 역학을 정량화하여 네트워크 다공탄성을 입증합니다. 또한 실험적 과제, 일반적인 함정 및 세포 골격 역학과의 관련성에 대해서도 논의합니다.

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

우리는 세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 다공탄성 악토미오신 겔의 역학을 특성화하기 위한 시험관 내 접근법을 개발했으며, 보다 일반적으로 다공탄성 활성 물질로 거동하는 것으로 밝혀진 세포질. 이 방법은 미오신 수축성이 유체 흐름의 출현에 어떻게 기여하는지, 그리고 네트워크와 세포질 속도가 시간과 공간에서 어떻게 상관되는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 간단한 접근 방식을 통해 AFIM과 같은 기존 도구를 사용할 수 없는 정교한 장비나 기술을 사용하지 않고도 동적으로 진화하는 시스템의 기계적 특성을 추출할 수 있습니다.이 방법은 활성 겔과 포매된 유체의 특이성에 관계없이 다공성 활성 물질의 유변학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 수제 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 홀더에 10-12 개의 1.5 번 유리 커버 슬립을 넣고 400 밀리리터 비커에 피라냐 용액을 준비하십시오. 화학 후드의 얼음 위에 용액을 준비하십시오.홀더를 피라냐가 채워진 비커에 옮깁니다. 3 시간 후, 홀더를 신선한 이중 증류수로 채워진 깨끗한 비커로 옮겨 커버 슬립에서 과도한 피라냐를 씻어 내고 비커를 80 헤르츠의 초음파 처리 욕조로 옮기고 섭씨 25도에서 10 분 동안 최대 전력으로 옮깁니다. 신선한 이중 증류수로 이 단계를 두 번 더 반복합니다.염분화를 위해 홀더를 300 밀리리터의 순수한 메탄올로 채워진 깨끗한 비커로 옮긴 다음 30 분 동안 초음파 처리 욕조에 넣습니다. 그런 다음 홀더를 실란 용액으로 옮깁니다. 비커를 파라필름으로 밀봉하고 섭씨 4도의 냉장고에 밤새 보관합니다.다음날 홀더를 300ml의 순수 메탄올로 채워진 깨끗한 비커에 15초 동안 옮깁니다. 홀더 바닥을 건조시켜 과도한 메탄올을 제거하고 깨끗한 비커에 옮깁니다. 그런 다음 비커를 오븐으로 옮겨 섭씨 120도에서 5분 동안 유리 커버슬립을 건조시킵니다.표면 패시베이션을 달성하려면 각 실험에 대해 두 개의 커버 슬립을 가져 와서 처음에 에탄올로 세척 한 파라 필름 층으로 코팅 된 페트리 접시에 넣습니다. 섭씨 22도에서 1시간 동안 1X PBS에 1밀리리터의 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드와 함께 각 커버슬립을 배양합니다. 배양 과정이 끝나면 페트리 접시를 기울여 제거하고 못을 박습니다.각 커버 슬립을 5 밀리리터의 이중 증류수로 헹구고 질소 가스의 흐름으로 건조시킵니다. 커버 슬립은 패시베이션 후 젖은 상태로 유지해야하므로 즉시 10 밀리 몰의 트리스 1 밀리리터를 페 길화 된 표면에 놓고 커버 슬립을 2 시간 동안 사용하십시오. 큰 미오신 응집체를 형성하려면 미오신 원액을 10 밀리몰 트리스로 희석하여 25 밀리몰 염화칼륨의 최종 농도에 도달합니다.희석 된 미오신 용액을 실온에서 10 분 동안 보관 한 다음 사용할 때까지 얼음으로 옮깁니다. 모터는 최대 2시간 동안 완전히 작동합니다. 겔 공극을 가로지르는 용매 흐름을 추적하기 위해 부동태화된 형광 비드를 준비하고 1마이크로리터의 비드를 5마이크로몰 G-액틴과 20분 동안 배양하여 비드와 악토미오신 네트워크 사이의 상호 작용을 줄입니다.원심분리에 의해 과량의 G-액틴을 제거한다. 소 혈청 알부민 밀리리터당 10 밀리그램으로 이 단계를 반복하여 코팅되지 않은 나머지 표면을 차단하고 실험에서 1 내지 10, 000의 최종 희석액으로 비드를 사용한다. 악토미오신 용액을 준비하기 위해, 섭씨 영하 80도에서 저장된 단백질 분취액을 해동하고 얼음 위에 놓는다.그런 다음 10 밀리몰 트리스, 5 마이크로 몰 G- 액틴, 280 나노 몰 GST 파시안 및 1.67 나노 몰 미오신 II.의 최종 농도에 도달하도록 용액을 준비합니다. 그 위에 기름칠한 파라폼 스페이서를 놓고 샘플 홀더에 넣습니다. 1.1마이크로리터의 액토미오신 용액을 홀더에 장착된 커버슬립에 추가하고 두 번째 커버슬립을 맨 위에 놓습니다.홀더를 조여 샘플을 밀봉합니다. 샘플 홀더를 현미경에 놓고 수집을 시작합니다. 초기 획득 시간을 줄이기 위해 현미경을 미리 준비하십시오.도립 형광 현미경으로 시료를 이미지화하려면 2.5X 대물렌즈의 낮은 배율을 사용하여 전체 겔 영역을 시각화하고 시간에 따른 거시적 수축을 추적합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 네트워크 다공성 및 구조를 특성화하고 시간에 따른 네트워크 자체 구성 및 수축을 추적합니다. 동시 2색 이미징의 경우 488나노미터에서 액틴을 여기시키고 561나노미터에서 미오신 II 모터를 여기시키고 이중 방출 장치를 사용하여 EMCCD 카메라에 이미지를 동시에 기록합니다.동일한 이미징 시스템을 사용하여 액틴 겔과 형광 미오신 II 모터를 동시에 이미징할 수 있습니다. 동시 2 색 이미징의 경우 488 나노 미터에서 액틴을, 561 나노 미터에서 2, 300 나노 미터 비드를 여기시킵니다. 그리고 이중 방출 장치를 사용하여 EMCCD 카메라에 이미지를 동시에 기록할 수 있습니다.동일한 이미징 시스템을 사용하여 액틴 겔과 형광 비드를 동시에 이미징합니다. 첫날은 악토미오신 네트워크가 탄성 물질로 작용한다는 것을 입증하는 것입니다. 악토미오신 네트워크의 개략도가 여기에 묘사되어 있습니다.형광 현미경 이미지는 액틴 필라멘트가 자발적으로 핵을 형성하고 등방성 상호 연결된 네트워크로 중합되어 시간이 지남에 따라 거칠어지고 결국 거시적으로 수축한다는 것을 보여줍니다. 네트워크 인력은 겔 주변에서 시작하여 겔 벌크 내부로 전파됩니다. 젤 중심은 C.Actin 필라멘트 다발로 네트워크 수축 도중 똑바른 남아 있습니다로 표시됩니다.T316초와 T327초에서 등고선 길이와 종단 간 거리 간의 비율 분포가 여기에 표시됩니다. 두 번째 목표는 미오신 수축성에 의해 외부 용매 흐름이 생성된다는 것을 입증하는 것입니다. 수축의 중간 단계에서 낮은 배율의 겔 이미지가 여기에 표시됩니다.이 원은 4개의 구슬 위치를 표시합니다. 화살표는 비드 동작의 전역 방향을 표시합니다. 선택된 9 개의 구슬의 궤적이 여기에 묘사되어 있습니다.네트워크 다공성을 해결하고 수축의 진행 단계에서 겔 기공을 가로지르는 용매의 이동이 여기에 묘사되어 있습니다. 세 번째 목표는 응력 완화가 효과적인 다공탄성 확산 상수를 특징으로 한다는 것을 입증하는 것입니다. 혼합 시간부터 정상 상태까지 낮은 배율에서 수축하는 악토미오신 겔의 평면도 형광 이미지가 여기에 표시됩니다.악토미오신 네트워크는 다공탄성 활성 물질로 거동합니다. 이 절차를 시도하는 동안 빠르고 정확하게 작업하고 표면 보존의 중요성을 명심하십시오.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

연구

생체공학

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

선박의 스텐 트를 배포하는 동안 벽 역학 모니터링

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

수동 렌즈 들을 통해 렌즈 숙박의 역학을 시뮬레이션

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...