Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

Vi takker Dina Aranovich for proteinrensing og merking. G.L. er takknemlig overfor Israels departement for vitenskap, teknologi og rom for Jabotinsky PhD-stipendet. ABG er takknemlig til Israel Science Foundation (stipend 2101/20) og til departementet for vitenskap og teknologi - staten Israel (grant 3-17491) for økonomisk støtte.

1. Glassoverflatebehandling og passivering:
MERK: Denne delen inneholder tre hovedtrinn (se figur 1): (i) rengjøring og hydrofilisering, (ii) silanisering og (iii) overflatepassivering.
<ol><li>Rengjøring og hydrofilisering<ol><li>Bruk Piranha-løsning for rengjøring av glassoverflate. MERK: Piranha-oppløsning er en blanding av 30%H2O2og 70%H2SO4(materialfortegnelse). Hovedmålet er å fjerne or...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Her brukes en in vitro-tilnærming for å karakterisere mekanikken til poroelastiske actomyosingeler som et modellsystem av cellecytoskelettet og mer generelt av cellecytoplasma, som har vist seg å oppføre seg som et poroelastisk materiale 3,5. Reologien til cellecytoskjelettet (cytoplasma) har vært preget av en poroelastisk diffusjonskonstant, som dikterer hvor lang tid det tar for det intracellulære cytosoliske væsken å omfordele seg i cellen ett...

Levende celler har unike mekaniske egenskaper. Foruten evnen til passivt å reagere på påførte krefter, er de også i stand til aktivt å generere krefter som svar på ytre stimuli1. Disse egenskapene, som er essensielle for en rekke cellulære prosesser, spesielt under cellemotilitet, tilskrives primært de mekaniske og dynamiske egenskapene til cellecytoskelettet, spesielt actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel av polare aktinfilamenter, myosinmolekylære motorer og tilbehørsproteiner. Disse actomyosinnettverkene utviser inneboende selvorganiserings- og sammentrekningsegenskaper drevet av myosinmotorproteinene, som kryssbinder aktinfilamentene og aktivt genererer mekaniske spenninger i nettverket drevet av ATP-hydrolyse2.
Tallrike eksperimentelle og teoretiske studier har blitt utført for å studere materialegenskapene til cytoskelettet3. Den allment aksepterte oppfatningen er at cytoskjelettet oppfører seg som et viskoelastisk materiale4. Dette betyr at cytoskelettet på korte tidsskalaer oppfører seg som et elastisk materiale, og på lange tidsskalaer oppfører det seg som et viskøst væske på grunn av tverrbindende proteiner og myosinmotorisk løsrivelse (og reattachment), noe som gjør at nettverket dynamisk kan snu. Den viskoelastiske modellen kan imidlertid i mange situasjoner ikke beskrive de eksperimentelle resultatene, som er mer konsistente med et bilde som beskriver cytoskjelettet og mer generelt cellecytoplasma som beskrives som et poroelastisk virkestoff 5,6. To hovedtrekk karakteriserer disse typer materialer. (i) Den første hovedfunksjonen er genereringen av en strøm av penetrerende cytosol ("løsningsmidlet") over gelporene ved kontraktilitetsgradienter drevet av myosinmotorene, som ligger til grunn for prosesser som celleblebbing7, motilitet8 og celleformsvingninger9. Fremveksten av slike cytosoliske strømmer kan være lokal, for blebbing eller global, som i cellemotilitet. I sistnevnte tilfelle driver de kontraktile påførte spenningene ved cellens bakside strømmen av cytosolisk væske mot cellefronten, noe som etterfyller proteinbassenget som trengs for lamellipodimontering8. (ii) Den andre hovedfunksjonen er at avslapningen av spenninger er diffusiv og er preget av en effektiv diffusjonskonstant, , som avhenger av gelelastisiteten, gelporøsiteten og løsningsmiddelviskositeten5. Den poroelastiske diffusjonskonstanten bestemmer hvor raskt systemet reagerer på en påført spenning. Høyere diffusjonskonstanter tilsvarer raskere stressomfordeling. Dette bestemmer i sin tur hvor lang tid det tar for det intracellulære cytosoliske væsken å bli omfordelt i cellen etter påført mekanisk stress, det være seg eksternt eller internt, slik som de aktive kontraktile spenningene generert av myosinmotorer. Disse eksemplene viser dermed at mekanikken til cytoskjelettet og cytosolen er tett koblet og ikke kan behandles separat3.
Siden celler kan regulere sine mekaniske egenskaper på en rekke måter, er samspillet mellom nettverksmekanikk og væskestrømningsdynamikk fortsatt dårlig forstått. En kraftig alternativ tilnærming er å bruke in vitro rekonstituerte systemer som muliggjør full kontroll over de forskjellige mikroskopiske bestanddelene og systemparametrene, noe som gjør disse modellsystemene optimale for fysisk analyse10,11. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å studere virkningen av proteinsammensetning og systemgeometri på aktinbasert motilitet 12,13,14,15,16,17,18, 2D-mønstre av aktomyosinnettverk 19,20,21,22, og samspillet mellom nettverkskontraktilitet og væskestrømningsdynamikk av poroelastiske actomyosingeler, som er fokus for denne artikkelen23.
I dette manuskriptet diskuteres fremstilling av kontraktile elastiske aktomyosinnettverk med kontrollerbare dimensjoner og materialegenskaper basert på arbeidet til Ideses et al.23. Dynamikken til kontraheringsgelen og det drenerte løsningsmidlet analyseres og kvantifiseres, hvorved det er demonstrert at disse actomyosingelene kan beskrives som et poroelastisk aktivt materiale. Å studere effekten av løsningsmiddelviskositet på stressdiffusivitet bekrefter ytterligere den poroelastiske naturen til disse nettverkene. De ulike skaleringsrelasjonene som brukes til datakvantifisering er gitt. Til slutt diskuteres også de eksperimentelle utfordringene, de vanlige fallgruvene og relevansen av eksperimentelle resultater for cellecytoskjelettet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

Celler kan aktivt forandre sine former og bli bevegelige, en egenskap som avhenger av deres evne til aktivt å omorganisere sin indre struktur. Denne funksjonen tilskrives de mekaniske og dynamiske egenskapene til cellecytoskjelettet, spesielt actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel av polare aktinfilamenter, myosinmotorer og tilbehørsproteiner som utviser inneboende sammentrekningsegenskaper. Den vanligvis aksepterte oppfatningen er at cytoskjelettet oppfører seg som et viskoelastisk materiale. Denne modellen kan imidlertid ikke alltid forklare de eksperimentelle resultatene, som er mer konsistente med et bilde som beskriver cytoskjelettet som et poroelastisk aktivt materiale - et elastisk nettverk innebygd med cytosol. Kontraktilitetsgradienter generert av myosinmotorene driver strømmen av cytosol over gelporene, noe som antyder at mekanikken til cytoskjelettet og cytosolen er tett koblet. Et hovedtrekk ved poroelastisitet er diffusiv avslapning av spenninger i nettverket, karakterisert ved en effektiv diffusjonskonstant som avhenger av gelelastisk modul, porøsitet og cytosol (løsningsmiddel) viskositet. Siden celler har mange måter å regulere strukturen og materialegenskapene på, er vår nåværende forståelse av hvordan cytoskjelettmekanikk og cytosolstrømningsdynamikk er koblet sammen, fortsatt dårlig forstått. Her brukes en in vitro rekonstitueringstilnærming for å karakterisere materialegenskapene til poroelastiske actomyosingeler som et modellsystem for cellecytoskjelettet. Gelkontraksjon drives av myosinmotorisk kontraktilitet, noe som fører til fremveksten av en strøm av det penetrerende løsningsmidlet. Papiret beskriver hvordan du skal forberede disse gelene og kjøre eksperimenter. Vi diskuterer også hvordan man måler og analyserer løsemiddelstrømmen og gelkontraksjonen både på lokal og global skala. De ulike skaleringsrelasjonene som brukes til datakvantifisering er gitt. Til slutt diskuteres eksperimentelle utfordringer og vanlige fallgruver, inkludert deres relevans for cellecytoskjelettmekanikk.

To glassdeksel brukes per eksperiment. Glassdekslene rengjøres og passiveres med PEG-polymerer. Passivering er avgjørende for å forhindre at de solubiliserte proteinene fester seg til glassflatene i de tidlige eksperimentelle stadiene og for å minimere samspillet mellom det kontraherende nettverket og glassveggene. Unnlatelse av å oppnå god passivering kan føre til ineffektiv sammentrekning, og i ekstreme tilfeller kan det til og med hemme aktinnettverksdannelse.
Fi...

Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

I dette arbeidet brukes en in vitro rekonstitueringstilnærming for å studere poroelastisiteten til actomyoingeler under kontrollerte forhold. Dynamikken til actomyosingelen og det innebygde løsningsmidlet kvantifiseres, hvorved nettverksporoelastisiteten demonstreres. Vi diskuterer også eksperimentelle utfordringer, vanlige fallgruver og relevans for cellecytoskjelettmekanikk.

Mekanikken til (poro-)elastiske kontraktile aktomyosinnettverk som et modellsystem av cellecytoskjelettet

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Vi har utviklet en in vitro-tilnærming for å karakterisere mekanikken til poroelastiske actomyosingeler som et modellsystem av cellecytoskelettet, og mer generelt cytoplasma, som har vist seg å oppføre seg som et poroelastisk aktivt materiale. Denne metoden gir innsikt i hvordan myosinkontraktilitet bidrar til fremveksten av en væskestrøm og hvordan nettverks- og cytosolhastigheter korreleres i tid og rom. Denne enkle tilnærmingen tillater oss å trekke ut de mekaniske egenskapene til dynamisk utviklende systemer uten å bruke sofistikert utstyr eller teknikker der konvensjonelle verktøy som AFIM ikke kan brukes.Denne metoden kan gi innsikt i reologien til poroelastiske aktive materialer uavhengig av spesifisiteten til den aktive gelen og den innebygde væsken. For å begynne, plasser 10 til 12 nummer 1,5 glassdeksler i en hjemmelaget polytetrafluoretylenholder og lag Piranha-oppløsning i et 400 milliliter beger. Forbered løsningen på is i en kjemisk hette.Overfør holderen til det Piranha-fylte begeret. Etter tre timer, overfør holderen til et rent beger fylt med ferskt dobbeltdestillert vann for å vaske overflødig Piranha fra dekslene og overfør begeret til et sonikeringsbad ved 80 hertz og full effekt i 10 minutter ved 25 grader Celsius. Gjenta dette trinnet to ganger til med ferskt dobbeltdestillert vann.For salinisering, overfør holderen til et rent beger fylt med 300 ml ren metanol, deretter til et sonikeringsbad i 30 minutter. Overfør deretter holderen til en silanløsning. Forsegl begeret med parafilm og oppbevar det i kjøleskapet ved fire grader Celsius over natten.Neste dag overfører du holderen til et rent beger fylt med 300 ml ren metanol i 15 sekunder. Tørk bunnen av holderen for å fjerne overflødig metanol og overfør den til et rent beger. Overfør deretter begeret til ovnen for å tørke glassdekslene i fem minutter ved 120 grader Celsius.For å oppnå overflatepassivering, ta to deksel for hvert eksperiment og legg dem i en petriskål belagt med et parafilmlag som først ble rengjort med etanol. Inkuber hver dekkslipp med en milliliter metoksypolyetylenglykolmaleimid i 1X PBS i en time ved 22 grader Celsius. På slutten av inkubasjonsprosessen, vipp petriskålen for å fjerne og plugge.Skyll hver dekkslipp med fem milliliter dobbeltdestillert vann og tørk med en strøm av nitrogengass. Siden dekslene må holdes våte etter passivering, legg straks en milliliter 10 millimolar Tris på de pegylerte overflatene og bruk dekselene med to timer. For å danne store myosinaggregater, fortynn myosinoppløsningen med 10 millimolar Tris for å nå en endelig konsentrasjon på 25 millimolar kaliumklorid.Oppbevar den fortynnede myosinoppløsningen i 10 minutter ved romtemperatur og overfør den deretter til is til bruk. Motorene er fullt aktive i opptil to timer. å spore løsningsmiddelstrømmen over gelporene, forberede passiverte fluorescerende perler og redusere samspillet mellom perlene og actomyosinnettverket ved å inkubere en mikroliter perler med fem mikromolære G-aktin i 20 minutter.Fjern overflødig G-aktin ved sentrifugering. Gjenta dette trinnet med 10 milligram per milliliter bovint serumalbumin for å blokkere den gjenværende ubelagte overflaten og bruk perlene ved en endelig fortynning på en til 10.000 i forsøkene. For å forberede actomyosinoppløsningen, tine proteinalikotene lagret ved minus 80 grader Celsius og legg dem på is.Forbered deretter løsningen for å nå en endelig konsentrasjon på 10 millimolar Tris, fem mikromolar G-aktin, 280 nanomolar GST Fascin og 1,67 nanomolar myosin II.Ta en av polyetylenglykol passiverte deksel. Plasser et smurt paraformavstandsstykke på toppen av det og legg det i prøveholderen. Tilsett 1,1 mikroliter av actomyosinoppløsningen til den holdermonterte dekselslipen og legg den andre dekselet på toppen.Skru holderen for å forsegle prøven. Plasser prøveholderen på mikroskopet og start innsamlingen. Forbered mikroskopet på forhånd for å redusere den første oppkjøpstiden.For å avbilde prøvene med et invertert fluorescerende mikroskop, visualiser hele gelområdet ved å bruke lave forstørrelser på 2,5X objektiv og følg makroskopisk sammentrekning med tiden. Bruk et 10X-mål for å karakterisere nettverkets porøsitet og struktur og å følge nettverkets selvorganisering og sammentrekning med tiden. For samtidig tofargeavbildning, opphiss aktin ved 488 nanometer og myosin II-motorer ved 561 nanometer og ta bildene samtidig på et EMCCD-kamera ved hjelp av et dobbeltutslippsapparat.Bruk det samme bildesystemet til å avbilde aktingelen og de fluorescerende myosin II-motorene samtidig. For samtidig tofargeavbildning, opphiss aktinet ved 488 nanometer og 2.300 nanometerperler ved 561 nanometer. Og ta opp bildene samtidig på et EMCCD-kamera ved hjelp av et dobbeltutslippsapparat.Bruk det samme bildesystemet til samtidig å avbilde aktingelen og fluorescerende perler. Den første dagen innebærer å demonstrere at actomyosinnettverket oppfører seg som et elastisk materiale. En skjematisk fremstilling av et actomyosin-nettverk er avbildet her.Fluorescensmikroskopibilder viser at aktinfilamentene spontant kjerner og polymeriserer til et isotropisk sammenkoblet nettverk som grover med tiden og til slutt trekker seg makroskopisk sammen. Nettverksattraksjon starter ved gelperiferien og forplanter seg innover i gelbulken. Gelsenteret er merket med en C.Aktinfilamentbuntene forblir rette under nettverkskontraksjon.Fordelingen av forholdet mellom konturlengden og ende-til-ende-avstanden ved T316 sekunder og T327 sekunder er vist her. Det andre målet innebærer å demonstrere at en utadgående løsningsmiddelstrøm genereres av myosinkontraktilitet. Bildet av gelen ved lav forstørrelse ved mellomstadier av sammentrekning er vist her.Disse sirklene markerer posisjonene til fire perler. Pilene markerer den globale retningen for perlebevegelsen. Banene til de ni utvalgte perlene er avbildet her.Oppløsning av nettverksporøsiteten og bevegelsen av løsningsmidlet over gelporene ved avanserte stadier av sammentrekning er avbildet her. Det tredje målet innebærer å demonstrere at stressavslapping er preget av en effektiv poroelastisk diffusjonskonstant. Toppvisning fluorescensbilder av en kontraherende actomyosin gel ved lav forstørrelse fra blandingstiden opp til steady state er vist her.Actomyosin-nettverkene oppfører seg som et poroelastisk aktivt materiale. Mens du prøver denne prosedyren, arbeid raskt og nøyaktig, og husk viktigheten av overflatebehandling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance Elastography Metodikk for vurdering av Tissue Engineered Construct Vekst

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvåking veggen Mechanics Under Stent Deployment i en Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Produksjon av Cancer Cell Spheroids med en vandig To-fase system for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikasjon av ekstracellulære matrise-avledet Skum og Mikrocarriers som Tissue-spesifikke cellekultur og Delivery plattformer

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Simuleringen mekanikken i linsen overnatting via manuell linse båre

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celleutvidelse og deres mulige bruk som cellen levering System i en Bioreactor modellen

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

Spontan formasjonen og omorganisering av kunstige Lipid Nanotube nettverk som opp-modell for endoplasmatiske retikulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...