Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Dina Aranovich pela purificação e rotulagem das proteínas. G.L. é grato ao Ministério da Ciência, Tecnologia e Espaço de Israel pela Bolsa de Doutorado Jabotinsky. A.B.G. agradece à Israel Science Foundation (processo 2101/20) e ao Ministério da Ciência e Tecnologia - Estado de Israel (grant 3-17491) pelo apoio financeiro.

1. Tratamento da superfície do vidro e passivação:
NOTA: Esta seção inclui três etapas principais (consulte a Figura 1): (i) limpeza e hidrofilização, (ii) silanização e (iii) passivação superficial.
<ol><li>Limpeza e hidrofilização<ol><li>Use solução de Piranha para limpeza de superfícies de vidro. OBS: Solução de piranha é uma mistura de 30% H 2 O 2 e 70% H2SO4 (Tabela de Materiais</str...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Aqui, uma abordagem in vitro é empregada para caracterizar a mecânica dos géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo do citoesqueleto celular e, mais geralmente, do citoplasma celular, que tem demonstrado se comportar como um material poroelástico 3,5. A reologia do citoesqueleto celular (citoplasma) tem sido caracterizada por uma constante de difusão poroelástica, que determina quanto tempo leva para o líquido citosólico intracelu...

As células vivas têm propriedades mecânicas únicas. Além da capacidade de reagir passivamente às forças aplicadas, elas também são capazes de gerar ativamente forças em resposta a estímulos externos1. Essas características, essenciais para uma variedade de processos celulares, notadamente durante a motilidade celular, são primariamente atribuídas às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, especialmente do citoesqueleto de actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores moleculares de miosina e proteínas acessórias. Essas redes de actomiosinas exibem propriedades intrínsecas de auto-organização e contração impulsionadas pelas proteínas motoras da miosina, que reticulam os filamentos de actina e geram ativamente tensões mecânicas na rede alimentada pela hidrólise de ATP2.
Inúmeros estudos experimentais e teóricos têm sido realizados para estudar as propriedades materiais do citoesqueleto3. A visão comumente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico4. Isso significa que, em escalas de tempo curtas, o citoesqueleto se comporta como um material elástico e, em longas escalas de tempo, comporta-se como um fluido viscoso devido às proteínas de reticulação e ao descolamento motor (e religação) da miosina, o que permite que a rede se transforme dinamicamente. Em muitas situações, entretanto, o modelo viscoelástico não consegue descrever os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto e, de modo mais geral, o citoplasma da célula sendo descrito como um material ativo poroelástico 5,6. Duas características principais caracterizam esses tipos de materiais. (i) A primeira característica principal é a geração de um fluxo do citosol penetrante (o "solvente") através dos poros do gel por gradientes de contratilidade impulsionados pelos motores da miosina, que está subjacente a processos como o blebbing celular7, a motilidade8 e as oscilações da forma celular9. O surgimento desses fluxos citosólicos pode ser local, por blebbing, ou global, como na motilidade celular. Neste último caso, as tensões contráteis aplicadas na parte traseira da célula direcionam o fluxo do fluido citosólico em direção à frente celular, o que repõe o pool proteico necessário para a montagem dos lamelípodes8. (ii) A segunda característica principal é que a relaxação das tensões é difusiva e é caracterizada por uma constante de difusão efetiva, que depende do módulo elástico do gel, da porosidade do gel e da viscosidade do solvente5. A constante de difusão poroelástica determina a rapidez com que o sistema responde a uma tensão aplicada. Constantes de maior difusão correspondem a uma redistribuição mais rápida das tensões. Isso, por sua vez, determina quanto tempo leva para que o líquido citosólico intracelular seja redistribuído dentro da célula após o estresse mecânico aplicado, seja ele externo ou interno, como os estresses contráteis ativos gerados pelos motores da miosina. Esses exemplos, portanto, demonstram que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados e não podem ser tratados separadamente3.
Como as células podem regular suas propriedades mecânicas de várias maneiras, a interação entre a mecânica da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos permanece pouco compreendida. Uma abordagem alternativa poderosa é a utilização de sistemas reconstituídos in vitro que permitam o controle total dos vários constituintes microscópicos e dos parâmetros do sistema, o que torna esses sistemas-modelo ótimos para análises físicas10,11. Esta abordagem tem sido empregada com sucesso para estudar o impacto da composição proteica e da geometria do sistema na motilidade baseada em actina 12,13,14,15,16,17,18, na padronização 2D de redes de actomiosinas 19,20,21,22, e a interação entre a contratilidade da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos de géis de actomiosina poroelásticos, que é o foco deste artigo23.
Neste manuscrito, a preparação de redes de actomiosina elástica contrátil de dimensões controláveis e propriedades do material é discutida com base no trabalho de Ideses et al.23. A dinâmica do gel de contração e do solvente drenado é analisada e quantificada, através da qual é demonstrado que estes géis de actomiosina podem ser descritos como um material ativo poroelástico. O estudo do efeito da viscosidade do solvente na difusividade de tensões confirma ainda mais a natureza poroelástica dessas redes. As várias relações de dimensionamento usadas para quantificação de dados são fornecidas. Finalmente, os desafios experimentais, as armadilhas comuns e a relevância dos resultados experimentais para o citoesqueleto celular também são discutidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

As células podem mudar ativamente suas formas e se tornar móveis, uma propriedade que depende de sua capacidade de reorganizar ativamente sua estrutura interna. Essa característica é atribuída às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, notadamente o citoesqueleto da actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores de miosina e proteínas acessórias que exibem propriedades de contração intrínsecas. A visão usualmente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico. No entanto, esse modelo nem sempre pode explicar os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto como um material ativo poroelástico - uma rede elástica embebida com citosol. Gradientes de contratilidade gerados pelos motores da miosina conduzem o fluxo do citosol através dos poros do gel, o que infere que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados. Uma das principais características da poroelasticidade é a relaxação difusiva das tensões na rede, caracterizada por uma constante de difusão efetiva que depende do módulo elástico do gel, porosidade e viscosidade do citosol (solvente). Como as células têm muitas maneiras de regular sua estrutura e propriedades materiais, nossa compreensão atual de como a mecânica do citoesqueleto e a dinâmica do fluxo citosol são acopladas permanece pouco compreendida. Aqui, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para caracterizar as propriedades materiais de géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo para o citoesqueleto celular. A contração do gel é impulsionada pela contratilidade motora da miosina, que leva ao surgimento de um fluxo do solvente penetrante. O artigo descreve como preparar esses géis e executar experimentos. Também discutimos como medir e analisar o fluxo de solvente e a contração do gel em escala local e global. As várias relações de escala usadas para quantificação de dados são dadas. Finalmente, os desafios experimentais e as armadilhas comuns são discutidos, incluindo sua relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.

Duas lamínulas de vidro são usadas por experimento. As lamínulas de vidro são limpas e passivadas com polímeros PEG. A passivação é essencial para impedir que as proteínas solubilizadas aderam às superfícies de vidro nos estágios experimentais iniciais e para minimizar a interação da rede de contração com as paredes de vidro. A falha em alcançar uma boa passivação pode levar a uma contração ineficiente e, em casos extremos, pode até inibir a formação da rede de actina.
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The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Neste trabalho, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para estudar a poroelasticidade de géis de actomiosina sob condições controladas. A dinâmica do gel de actomiosina e do solvente incorporado é quantificada, através da qual a poroelasticidade da rede é demonstrada. Também discutimos os desafios experimentais, armadilhas comuns e relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.

A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Desenvolvemos uma abordagem in vitro para caracterizar a mecânica dos géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo do citoesqueleto celular e, mais geralmente, do citoplasma, que tem demonstrado se comportar como um material ativo poroelástico. Este método fornece informações sobre como a contratilidade da miosina contribui para o surgimento de um fluxo de fluido e como as velocidades da rede e do citosol estão correlacionadas no tempo e no espaço. Esta abordagem simples nos permite extrair as propriedades mecânicas de sistemas em evolução dinâmica sem usar nenhum equipamento ou técnica sofisticada onde ferramentas convencionais como AFIM não podem ser empregadas.Este método pode fornecer informações sobre a reologia de materiais ativos poroelásticos, independentemente da especificidade do gel ativo e do fluido incorporado. Para começar, coloque de 10 a 12 tampas de vidro número 1.5 em um suporte caseiro de politetrafluoretileno e prepare a solução de Piranha em um copo de 400 mililitros. Prepare a solução no gelo em uma capa química.Transfira o suporte para o copo recheado de Piranha. Após três horas, transfira o suporte para um copo limpo cheio de água fresca bidestilada para lavar o excesso de piranha das tampas e transfira o copo para um banho de sonicação a 80 hertz e potência total por 10 minutos a 25 graus Celsius. Repita este passo mais duas vezes com água fresca bidestilada.Para a salinização, transfira o suporte para um copo limpo preenchido com 300 mililitros de metanol puro e, em seguida, para um banho de sonicação por 30 minutos. Em seguida, transfira o suporte para uma solução de silano. Sele o copo com parafilme e mantenha-o na geladeira a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, transfira o suporte para um copo limpo cheio de 300 mililitros de metanol puro por 15 segundos. Seque o fundo do suporte para remover o excesso de metanol e transfira-o para um copo limpo. Em seguida, transfira o copo para o forno para secar as tampas de vidro por cinco minutos a 120 graus Celsius.Para obter passivação superficial, pegue duas lamínulas para cada experimento e coloque-as em uma placa de Petri revestida com uma camada de parafilme inicialmente limpa com etanol. Incubar cada lamínula com um mililitro de maleimida de metoxipolietilenoglicol em 1X PBS por uma hora a 22 graus Celsius. No final do processo de incubação, incline a placa de Petri para remover e fixar.Enxágue cada lamínula com cinco mililitros de água bidestilada e seque com um fluxo de gás nitrogênio. Como as lamínulas devem ser mantidas molhadas após a passivação, coloque imediatamente um mililitro de Tris 10 milimolares nas superfícies peguiladas e use as lamínulas com duas horas. Para formar grandes agregados de miosina, diluir a solução estoque de miosina com Tris 10 milimolares para atingir uma concentração final de cloreto de potássio de 25 milimolares.Manter a solução de miosina diluída durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, transferi-la para o gelo até à utilização. Os motores ficam totalmente ativos por até duas horas. para rastrear o fluxo de solvente através dos poros do gel, preparar esferas fluorescentes passivadas e reduzir a interação entre as esferas e a rede de actomiosina, incubando um microlitro de esferas com cinco G-actina micromolar por 20 minutos.Remova o excesso de G-actina por centrifugação. Repetir esta etapa com 10 miligramas por mililitro de albumina de soro bovino para bloquear a superfície não revestida restante e usar as esferas em uma diluição final de um a 10.000 nos experimentos. Para preparar a solução de actomiosina, descongele as alíquotas de proteína armazenadas a menos 80 graus Celsius e coloque-as no gelo.Em seguida, prepare a solução para atingir uma concentração final de Tris 10 milimolares, cinco G-actina micromolares, 280 nanomolares GST Fascin, e 1,67 miosina nanomolar II. Tome uma das lamínulas passivadas de polietilenoglicol. Coloque um espaçador paraforme untado sobre ele e coloque-o no porta-amostras. Adicione 1,1 microlitros da solução de actomiosina à lamínula montada no suporte e coloque a segunda lamínula por cima.Rosqueie o suporte para selar a amostra. Coloque o porta-amostras no microscópio e inicie a aquisição. Preparar o microscópio com antecedência para reduzir o tempo de aquisição inicial.Para obter imagens das amostras com microscópio fluorescente invertido, visualize toda a área do gel usando aumentos baixos de objetiva de 2,5X e acompanhe sua contração macroscópica com o tempo. Use um objetivo de 10X para caracterizar a porosidade e estrutura da rede e acompanhar a auto-organização e contração da rede com o tempo. Para a imagem bicolor simultânea, excite a actina a 488 nanômetros e os motores de miosina II a 561 nanômetros e grave as imagens simultaneamente em uma câmera EMCCD usando um aparelho de emissão dupla.Use o mesmo sistema de imagem para obter imagens simultâneas do gel de actina e dos motores de miosina II fluorescente. Para imagens bicolores simultâneas, excite a actina a 488 nanômetros e 2.300 contas a 561 nanômetros. E grave as imagens simultaneamente em uma câmera EMCCD usando um aparelho de dupla emissão.Use o mesmo sistema de imagem para obter imagens simultâneas do gel de actina e das esferas fluorescentes. O primeiro dia envolve a demonstração de que a rede de actomiosina se comporta como um material elástico. Uma representação esquemática de uma rede de actomiosina é descrita aqui.Imagens de microscopia de fluorescência demonstram que os filamentos de actina se nucleam espontaneamente e polimerizam em uma rede isotrópica interconectada que se enrola com o tempo e eventualmente se contrai macroscopicamente. A atração da rede inicia-se na periferia do gel e propaga-se para dentro do volume do gel. O centro do gel é marcado com um C.Os feixes filamentares de actina permanecem retos durante a contração da rede.A distribuição da relação entre o comprimento do contorno e a distância término-terminal em T316 segundos e T327 segundos é mostrada aqui. O segundo objetivo envolve demonstrar que um fluxo de solvente para fora é gerado pela contratilidade da miosina. A imagem do gel em baixa magnificação em estágios intermediários de contração é mostrada aqui.Esses círculos marcam as posições de quatro contas. As setas marcam a direção global do movimento do talão. As trajetórias das nove contas selecionadas são retratadas aqui.A resolução da porosidade da rede e o movimento do solvente através dos poros do gel em estágios avançados de contração são descritos aqui. O terceiro objetivo envolve demonstrar que o relaxamento sob tensão é caracterizado por uma constante efetiva de difusão poroelástica. Imagens de fluorescência de visualização superior de um gel de actomiosina em contração em baixa ampliação desde o tempo de mistura até o estado estacionário são mostradas aqui.As redes de actomiosinas comportam-se como material ativo poroelástico. Ao tentar esse procedimento, trabalhe de forma rápida e precisa e tenha em mente a importância da preservação da superfície.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Bioengenharia

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Monitorização da Mecânica de parede durante a implantação de stent em um vaso

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Simulando a mecânica de lente Alojamento através de uma lente Manual esticador

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...