Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

Благодарим Дину Аранович за очистку и маркировку белка. Г.Л. благодарен Министерству науки, технологий и космоса Израиля за стипендию доктора философии им. Жаботинского. A.B.G. благодарен Израильскому научному фонду (грант 2101/20) и Министерству науки и технологий Государства Израиль (грант 3-17491) за финансовую поддержку.

1. Обработка и пассивация поверхности стекла:
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел включает три основных этапа (см. рис. 1): (i) очистка и гидрофилизация, (ii) силанизация и (iii) пассивация поверхности.
<ol><li>Очистка и гидрофилизация<ol><li>Используйте раствор Piranha для очистки по...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Здесь используется подход in vitro для характеристики механики пороэластичных гелей актомиозина как модельной системы клеточного цитоскелета и, в более общем плане, цитоплазмы клетки, которая, как было показано, ведет себя как пороэластический материал 3,5<sup class="xref"...

Живые клетки обладают уникальными механическими свойствами. Помимо способности пассивно реагировать на приложенные силы, они также способны активно генерировать силы в ответ на внешние раздражители1. Эти характеристики, которые необходимы для различных клеточных процессов, особенно во время подвижности клеток, в первую очередь объясняются механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, особенно цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, молекулярных моторов миозина и вспомогательных белков. Эти актомиозиновые сети проявляют присущие им свойства самоорганизации и сокращения, обусловленные моторными белками миозина, которые сшивают актиновые филаменты и активно генерируют механические напряжения в сети, подпитываемой гидролизом АТФ2.
Были проведены многочисленные экспериментальные и теоретические исследования по изучению свойств материала цитоскелета3. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал4. Это означает, что на коротких временных масштабах цитоскелет ведет себя как эластичный материал, а на длительных временных масштабах он ведет себя как вязкая жидкость из-за сшивающих белков и моторной отслойки миозина (и повторного прикрепления), что позволяет сети динамически вращаться. Однако во многих ситуациях вязкоупругая модель не может описать экспериментальные результаты, которые в большей степени согласуются с картиной, описывающей цитоскелет и, в более общем плане, цитоплазму клетки, описываемую как пороупругий активный материал 5,6. Эти типы материалов характеризуются двумя основными особенностями. (i) Первой основной особенностью является генерация потока проникающего цитозоля («растворителя») через поры геля за счет градиентов сократительной способности, управляемых моторами миозина, что лежит в основе таких процессов, как клеточный блеббинг7, подвижность8 и колебания формы клетки9. Возникновение таких цитозольных потоков может быть локальным, для блеббинга, или глобальным, как при подвижности клеток. В последнем случае сократительные напряжения в задней части клетки направляют поток цитозольной жидкости к передней части клетки, что пополняет белковый пул, необходимый для сборки ламеллиподий8. (ii) Вторая основная особенность заключается в том, что релаксация напряжений является диффузионной и характеризуется эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости геля и вязкости растворителя5. Константа пороупругой диффузии определяет, насколько быстро система реагирует на приложенное напряжение. Более высокие константы диффузии соответствуют более быстрому перераспределению напряжений. Это, в свою очередь, определяет, сколько времени требуется внутриклеточной цитозольной жидкости для перераспределения внутри клетки после приложенного механического напряжения, будь то внешнего или внутреннего, такого как активные сократительные напряжения, генерируемые миозиновыми моторами. Эти примеры, таким образом, демонстрируют, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана и не может рассматриваться отдельно3.
Поскольку ячейки могут регулировать свои механические свойства различными способами, взаимодействие между сетевой механикой и динамикой потока жидкости остается плохо изученным. Мощным альтернативным подходом является использование восстановленных in vitro систем, которые позволяют полностью контролировать различные микроскопические компоненты и параметры системы, что делает эти модельные системы оптимальными для физического анализа10,11. Этот подход был успешно использован для изучения влияния белкового состава и геометрии системы на актиновую подвижность 12,13,14,15,16,17,18, 2D-паттернирование актомиозиновых сетей 19,20,21,22 , а также взаимодействие между сократимостью сети и динамикой потока жидкости пороэластичных гелей актомиозина, которое находится в центре внимания данной статьи23.
В этой рукописи обсуждается получение сократительных эластичных сетей актомиозина контролируемых размеров и свойств материала на основе работы Ideses et al.23. Проанализирована и количественно определена динамика сжимающегося геля и дренированного растворителя, с помощью которой продемонстрировано, что эти гели актомиозина могут быть описаны как пороупругий активный материал. Изучение влияния вязкости растворителя на диффузию напряжений еще раз подтверждает пороупругую природу этих сетей. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, также обсуждаются экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и актуальность экспериментальных результатов для клеточного цитоскелета.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

Клетки могут активно менять свою форму и становиться подвижными, что зависит от их способности активно реорганизовывать свою внутреннюю структуру. Эта особенность объясняется механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, в частности, цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, миозиновых моторов и вспомогательных белков, которые проявляют внутренние свойства сокращения. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал. Однако эта модель не всегда может объяснить экспериментальные результаты, которые больше согласуются с картиной, описывающей цитоскелет как пороупругий активный материал — эластичную сеть, встроенную в цитозоль. Градиенты сократимости, генерируемые миозиновыми моторами, управляют потоком цитозоля через поры геля, что делает вывод о том, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана. Одной из основных особенностей пороупругости является диффузионная релаксация напряжений в сети, характеризующаяся эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости и вязкости цитозоля (растворителя). Поскольку клетки имеют много способов регулировать свою структуру и свойства материала, наше нынешнее понимание того, как связаны механика цитоскелета и динамика потока цитозолей, остается плохо изученным. Здесь используется подход восстановления in vitro для характеристики свойств материала пороэластичных гелей актомиозина в качестве модельной системы для клеточного цитоскелета. Сокращение геля обусловлено моторной сократимостью миозина, что приводит к возникновению потока проникающего растворителя. В статье описано, как приготовить эти гели и провести эксперименты. Мы также обсудим, как измерять и анализировать поток растворителя и сжатие геля как в локальном, так и в глобальном масштабе. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, обсуждаются экспериментальные проблемы и распространенные ошибки, в том числе их отношение к механике клеточного цитоскелета.

Для эксперимента используются два стеклянных покровных стекла. Покровные стекла очищаются и пассивируются полимерами ПЭГ. Пассивация необходима для предотвращения прилипания солюбилизированных белков к стеклянным поверхностям на ранних экспериментальных стадиях и для минимизации...

Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

В этой работе используется подход восстановления in vitro для изучения пороэластичности гелей актомиозина в контролируемых условиях. Количественно определена динамика геля актомиозина и встроенного растворителя, с помощью которой продемонстрирована сетчатая пороупругость. Мы также обсуждаем экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и отношение к механике клеточного цитоскелета.

Механика (поро-)эластичных сократительных сетей актомиозина как модельная система клеточного цитоскелета

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Мы разработали подход in vitro для характеристики механики пороупругих гелей актомиозина как модельной системы клеточного цитоскелета и, в более общем плане, цитоплазмы, которые, как было показано, ведут себя как пороупругий активный материал. Этот метод дает представление о том, как сократимость миозина способствует возникновению потока жидкости и как скорости сети и цитозоля коррелируют во времени и пространстве. Этот простой подход позволяет нам извлекать механические свойства динамически развивающихся систем без использования какого-либо сложного оборудования или методов, где обычные инструменты, такие как AFIM, не могут быть использованы.Этот метод может дать представление о реологии пороупругих активных материалов независимо от специфики активного геля и встроенной жидкости. Для начала поместите от 10 до 12 стеклянных покровных стекол No 1,5 в самодельный держатель из политетрафторэтилена и приготовьте раствор Piranha в стакане объемом 400 миллилитров. Приготовьте раствор на льду в химическом колпаке.Переложите держатель в стакан, наполненный пираньей. Через три часа переложите держатель в чистый стакан, наполненный свежей двойной дистиллированной водой, чтобы смыть излишки пираньи с покровных стекол, и перенесите стакан в ванну для обработки ультразвуком при частоте 80 герц и на полной мощности в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия. Повторите этот шаг еще два раза со свежей двойной дистиллированной водой.Для засоления переложите держатель в чистый стакан, наполненный 300 миллилитрами чистого метанола, а затем в ванну для обработки ультразвуком на 30 минут. Затем переведите держатель в силановый раствор. Запечатайте стакан парапленкой и храните его в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.На следующий день переложите держатель в чистый стакан, наполненный 300 миллилитрами чистого метанола на 15 секунд. Высушите нижнюю часть держателя, чтобы удалить излишки метанола, и перелейте его в чистый стакан. Затем переложите стакан в духовку, чтобы высушить стекло в течение пяти минут при температуре 120 градусов Цельсия.Чтобы добиться пассивации поверхности, возьмите два покровных стекла для каждого эксперимента и поместите их в чашку Петри, покрытую слоем парапленки, первоначально очищенным этанолом. Инкубируйте каждое покровное стекло с одним миллилитром метоксиполиэтиленгликоля малеимида в 1X PBS в течение одного часа при температуре 22 градуса Цельсия. В конце процесса инкубации наклоните чашку Петри, чтобы вынуть и приколоть.Промойте каждое покровное стекло пятью миллилитрами двойной дистиллированной воды и высушите потоком газообразного азота. Поскольку покровные стекла должны оставаться влажными после пассивации, немедленно нанесите один миллилитр 10-миллимолярного триса на пегилированные поверхности и используйте покровные стекла в течение двух часов. Чтобы сформировать большие агрегаты миозина, разбавьте исходный раствор миозина 10 миллимолярным Tris, чтобы достичь конечной концентрации 25 миллимоляров хлорида калия.Держите разбавленный раствор миозина в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем переложите его на лед до использования. Двигатели полностью активны до двух часов. чтобы отслеживать поток растворителя через поры геля, приготовьте пассивированные флуоресцентные шарики и уменьшите взаимодействие между шариками и актомиозиновой сетью, инкубируя один микролитр шариков с пятью микромолярными G-актином в течение 20 минут.Удалите избыток G-актина центрифугированием. Повторите этот шаг с 10 миллиграммами на миллилитр бычьего сывороточного альбумина, чтобы заблокировать оставшуюся поверхность без покрытия, и используйте шарики в окончательном разведении от одного до 10 000 в экспериментах. Чтобы приготовить раствор актомиозина, разморозьте белковые аликвоты, хранящиеся при температуре минус 80 градусов по Цельсию, и поместите их на лед.Затем приготовьте раствор до достижения конечной концентрации 10 миллимолярных трис, пяти микромолярных G-актина, 280 наномолярных GST фасцина и 1,67 наномолярного миозина II. Поместите поверх него смазанную маслом прокладку из параформы и поместите ее в держатель образца. Добавьте 1,1 микролитра раствора актомиозина в прилагаемое к держателю покровное стекло и поместите второе покровное стекло сверху.Закрутите держатель, чтобы запечатать образец. Поместите держатель образца на микроскоп и начните сбор. Подготовьте микроскоп заранее, чтобы сократить время первоначального сбора.Чтобы получить изображение образцов с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, визуализируйте всю область геля, используя низкое увеличение объектива в 2,5 раза, и проследите его макроскопическое сжатие со временем. Используйте цель 10X, чтобы охарактеризовать пористость и структуру сети, а также проследить самоорганизацию и сжатие сети со временем. Для одновременной двухцветной визуализации возбуждайте актин на 488 нанометрах и моторы миозина II на 561 нанометре и одновременно записывайте изображения на камеру EMCCD с помощью устройства с двойным излучением.Используйте одну и ту же систему визуализации для одновременного изображения актинового геля и флуоресцентных моторов миозина II. Для одновременной двухцветной визуализации возбуждайте актин на 488 нанометрах и 2 300 нанометровых шариков на 561 нанометре. И одновременно записывайте изображения на камеру EMCCD с помощью устройства с двойным излучением.Используйте одну и ту же систему визуализации для одновременного изображения актинового геля и флуоресцентных шариков. Первый день включает в себя демонстрацию того, что сеть актомиозина ведет себя как эластичный материал. Схематическое изображение сети актомиозина.Изображения флуоресцентной микроскопии показывают, что актиновые нити самопроизвольно зарождаются и полимеризуются в изотропную взаимосвязанную сеть, которая со временем грубеет и в конечном итоге макроскопически сжимается. Сетевое притяжение начинается на периферии геля и распространяется внутрь в гелевую массу. Центр геля отмечен буквой C. Пучки актиновых филаментов остаются прямыми во время сокращения сети.Здесь показано распределение соотношения между длиной контура и сквозным расстоянием при Т316 секунд и Т327 секундах. Вторая цель включает в себя демонстрацию того, что поток растворителя наружу генерируется сократимостью миозина. Показано изображение геля при малом увеличении на промежуточных стадиях сокращения.Эти круги отмечают положение четырех бусин. Стрелки отмечают глобальное направление движения бусины. Здесь изображены траектории движения девяти выбранных бусин.Здесь показано разрешение пористости сетки и движение растворителя по порам геля на поздних стадиях сжатия. Третья цель состоит в том, чтобы продемонстрировать, что релаксация напряжений характеризуется эффективной постоянной пороупругой диффузии. Здесь показаны флуоресцентные изображения сжимающегося геля актомиозина сверху при малом увеличении от времени смешивания до стационарного состояния.Сети актомиозина ведут себя как пороупругий активный материал. Пытаясь выполнить эту процедуру, работайте быстро и точно и помните о важности сохранения поверхности.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Магнитно резонансная Эластография методологии по оценке тканей Разработан Construct роста

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Мониторинг стены механики во время установки стента в сосуде

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Роботизированная Производство раковой клетки сфероидов с водной двухфазной системе для тестирования на наркотики

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Изготовление внеклеточного матрикса, производных Пены и микроносителями как Тканеспецифическая культуре клеток и платформ доставки

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Имитация механики объектив проживание через объектив ручное носилки

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Рекомбинатные коллаген я пептидные Microcarriers для расширения клеток и их потенциального использования в качестве системы доставки клеток в биореакторе модель

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

Спонтанного формирования и перегруппировки искусственных липидов нанотрубок сетей как модель снизу вверх для эндоплазматического ретикулума

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...