Name: the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

Dina Aranovich'e protein saflaştırma ve etiketleme için teşekkür ederiz. G.L., Jabotinsky Doktora Bursu için İsrail Bilim, Teknoloji ve Uzay Bakanlığı'na minnettardır. A.B.G., İsrail Bilim Vakfı'na (hibe 2101/20) ve İsrail Devleti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'na (hibe 3-17491) mali destek için minnettardır.

1. Cam yüzey işleme ve pasivasyon:
NOT: Bu bölüm üç ana adımı içermektedir (bkz. Şekil 1): (i) temizleme ve hidrofilizasyon, (ii) silinizasyon ve (iii) yüzey pasivasyonu.
<ol><li>Temizleme ve hidrofilizasyon<ol><li>Cam yüzey temizliği için Piranha solüsyonunu kullanın. NOT: Piranha çözeltisi% 30 H2 O2 ve% 70 H2 S04(Malzeme Tablosu) karışımıdır. Başlıca amacı, kapak kayması...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).</li><li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).</li><li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+mechanics:+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel.">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li><li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics.">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li><li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material.">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li><li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+cell+hydraulics.">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li><li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells.">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li><li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments.">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility.">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li><li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters.">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li><li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks.">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li><li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+or+myosin+contraction:+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking.">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).</li><li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility.">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).</li><li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks.">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413 (2019).</li><li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2/3+branches.">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li><li>Pontani, L. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome.">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li><li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+does+it+all:+Assembly,+remodeling,+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity.">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li><li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+gels:+Dynamics+of+patterning+and+self-organization.">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).</li><li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state.">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li><li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility.">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li><li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets.">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction:+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin.">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li><li>Margossian, S. S., Lowey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+myosin+and+its+subfragments+from+rabbit+skeletal+muscle.">Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle.</a> In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).</li><li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy.">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li><li>Cheng, N. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol&#8722;water+mixture.">Formula for the viscosity of a glycerol&#8722;water mixture.</a> Industrial &amp; Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+Physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells.">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li><li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks.">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).</li><li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels.">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).</li><li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins.">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).</li><li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks.">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li></ol>

Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin mekaniğini, hücre sitoiskeletinin ve daha genel olarak, poroelastik bir materyal olarak davrandığı gösterilen hücre sitoplazmasının model bir sistemi olarak karakterize etmek için in vitro bir yaklaşım kullanılmaktadır 3,5. Hücre sitoiskeletinin (sitoplazma) reolojisi, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içi sitozolik sıvının hücre içinde yeniden dağılmasının ne kadar süreceğini be...

Canlı hücreler benzersiz mekanik özelliklere sahiptir. Uygulanan kuvvetlere pasif olarak tepki verme yeteneğinin yanı sıra, dış uyaranlara yanıt olarak aktif olarak kuvvet üretme yeteneğine de sahiptirler1. Özellikle hücre hareketliliği sırasında çeşitli hücresel süreçler için gerekli olan bu özellikler, öncelikle hücre hücre iskeletinin, özellikle polar aktin filamentlerinin, miyozin moleküler motorlarının ve aksesuar proteinlerinin aktif bir jeli olan aktomiyozin sitoiskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine atfedilir. Bu aktomiyosin ağları, aktin filamentlerini çapraz bağlayan ve ATP hidrolizi2 tarafından beslenen ağda aktif olarak mekanik stresler üreten miyozin motor proteinleri tarafından tahrik edilen içsel öz-organizasyon ve büzülme özellikleri sergiler.
Hücre iskeletinin malzeme özelliklerini incelemek için çok sayıda deneysel ve teorik çalışma yapılmıştır3. Yaygın olarak kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir materyal gibi davrandığı yönündedir4. Bu, kısa zaman ölçeklerinde, hücre iskeletinin elastik bir malzeme gibi davrandığı ve uzun zaman ölçeklerinde, çapraz bağlama proteinleri ve miyozin motor dekolmanı (ve yeniden bağlanması) nedeniyle viskoz bir sıvı gibi davrandığı anlamına gelir. ağın dinamik olarak dönmesini sağlar. Bununla birlikte, birçok durumda, viskoelastik model, hücre iskeletini ve daha genel olarak, poroelastik aktif madde 5,6 olarak tanımlanan hücre sitoplazmasını tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları tanımlayamaz. Bu tür malzemeleri karakterize eden iki ana özellik vardır. (i) İlk ana özellik, hücre kanaması7, motilitesi8 ve hücre şekli salınımları9 gibi işlemlerin altında yatan miyozin motorları tarafından tahrik edilen kontraktilite gradyanları tarafından jel gözenekleri boyunca nüfuz eden sitosol ("çözücü") akışının oluşturulmasıdır. Bu tür sitozolik akışların ortaya çıkışı, hücre hareketliliğinde olduğu gibi lokal, blebbing için veya küresel olabilir. İkinci durumda, hücre arkasındaki kontraktil uygulanan gerilmeler, sitozolik sıvının akışını hücre önüne doğru yönlendirir ve bu da lamellipodia montajı8 için gerekli protein havuzunu doldurur. (ii) İkinci ana özellik, gerilmelerin gevşemesinin difüzif olması ve jel elastik modülüne, jel gözenekliliğine ve çözücü viskozitesine bağlı olan etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilmesidir5. Poroelastik difüzyon sabiti, sistemin uygulanan bir gerilime ne kadar hızlı tepki verdiğini belirler. Daha yüksek difüzyon sabitleri, daha hızlı gerilim yeniden dağılımına karşılık gelir. Bu da, hücre içi sitozolik sıvının, miyozin motorları tarafından üretilen aktif kontraktil stresler gibi harici veya dahili olsun, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içinde yeniden dağıtılmasının ne kadar süreceğini belirler. Bu nedenle, bu örnekler, sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığını ve ayrı ayrı tedavi edilemeyeceğini göstermektedir3.
Hücreler mekanik özelliklerini çeşitli şekillerde düzenleyebildiklerinden, ağ mekaniği ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim tam olarak anlaşılamamıştır. Güçlü bir alternatif yaklaşım, çeşitli mikroskobik bileşenlerin ve sistem parametrelerinin tam kontrolüne izin veren in vitro yeniden yapılandırılmış sistemlerin kullanılmasıdır ve bu da bu model sistemleri fiziksel analiz için en uygun hale getirir10,11. Bu yaklaşım, protein bileşiminin ve sistem geometrisinin aktin bazlı motilitesi 12,13,14,15,16,17,18, aktomiyosin ağlarının 2D modellemesi 19,20,21,22 üzerindeki etkisini incelemek için başarıyla kullanılmıştır ve bu makalenin odak noktası olan poroelastik aktomiyosin jellerinin ağ kontraktilitesi ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim23.
Bu yazıda, kontrol edilebilir boyutlara ve malzeme özelliklerine sahip kontraktil elastik aktomiyosin ağlarının hazırlanması, Ideses ve ark.23'ün çalışmalarına dayanarak tartışılmıştır. Sözleşme jelinin ve boşaltılmış çözücünün dinamikleri analiz edilir ve ölçülür, bu sayede bu aktomiyosin jellerinin poroelastik bir aktif madde olarak tanımlanabileceği gösterilmiştir. Solvent viskozitesinin stres difüzyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi, bu ağların poroelastik doğasını daha da doğrulamaktadır. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçeklendirme ilişkileri sağlanır. Son olarak, deneysel zorluklar, ortak tuzaklar ve deneysel sonuçların hücre hücre iskeleti ile ilgisi de tartışılmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>175617</td>
			<td>Stored under Argon atmosphere at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1070521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A10254</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 647</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>A20347</td>
			<td>Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>A3059</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma -Aldrich Company</td>
			<td>C9322</td>
			<td>The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Mezel-glaser</td>
			<td>CG2222-1.5</td>
			<td>Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10736988001</td>
			<td>Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.&#160; The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10621714001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche Life Science Products</td>
			<td>10708984001</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual view Simultaneous Imaging System&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>DV2-CUBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td>DV 887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve Delta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>525050300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Lamp</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17151-10</td>
			<td>200 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>194024</td>
			<td>When dissolved should be kept at -20 &#176;C and used within 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>G7141</td>
			<td>Kept in -20 &#176;C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>800687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>216763</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bio-Lab ltd</td>
			<td>1368052100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>442615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-5k&#160;</td>
			<td>Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red microspheres</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-2056-2&#160;</td>
			<td>2300 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (10x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>HC PL AP0</td>
			<td>UPlanFL Numerical Aperture = 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (2.5x)</td>
			<td>Leica Germany</td>
			<td>506304</td>
			<td>&#160;Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>WTC Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter Driver</td>
			<td>Vincet Associates</td>
			<td>VMM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01907.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>410301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Pharmacia</td>
			<td>Ultraspec 2100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td>1&#8211;10 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2017b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Data quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mechanics of (poro-)elastic contractile actomyosin networks as a model system of the cell cytoskeleton

Hücreler şekillerini aktif olarak değiştirebilir ve iç yapılarını aktif olarak yeniden düzenleme yeteneklerine bağlı bir özellik olan hareketli hale gelebilir. Bu özellik, hücre hücre iskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine, özellikle de polar aktin filamentlerinin, miyozin motorlarının ve içsel kasılma özellikleri sergileyen aksesuar proteinlerin aktif bir jeli olan aktomiyozin hücre iskeletine atfedilir. Genellikle kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir malzeme gibi davranmasıdır. Bununla birlikte, bu model, hücre iskeletini poroelastik bir aktif materyal olarak tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları her zaman açıklayamaz - sitosol ile gömülü elastik bir ağ. Miyozin motorları tarafından üretilen kontraktilite gradyanları, sitosolün jel gözenekleri boyunca akışını yönlendirir, bu da sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığı sonucuna varır. Poroelastisitenin ana özelliklerinden biri, jel elastik modülüne, gözenekliliğine ve sitosol (çözücü) viskozitesine bağlı etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilen, ağdaki streslerin difüzif gevşemesidir. Hücrelerin yapılarını ve malzeme özelliklerini düzenlemenin birçok yolu olduğu için, sitoiskelet mekaniğinin ve sitosol akış dinamiklerinin nasıl birleştiğine dair mevcut anlayışımız tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin materyal özelliklerini hücre hücre iskeleti için bir model sistem olarak karakterize etmek için in vitro bir rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmaktadır. Jel büzülmesi, nüfuz eden çözücünün akışının ortaya çıkmasına neden olan miyozin motor kontraktilitesi tarafından tahrik edilir. Makale, bu jellerin nasıl hazırlanacağını ve deneylerin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, solvent akışının ve jel büzülmesinin hem yerel hem de küresel ölçekte nasıl ölçüleceğini ve analiz edileceğini tartışıyoruz. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçekleme ilişkileri verilmiştir. Son olarak, deneysel zorluklar ve ortak tuzaklar, hücre hücre iskeleti mekaniği ile ilgileri de dahil olmak üzere tartışılmaktadır.

Deney başına iki cam kapak fişi kullanılır. Cam kapaklar PEG polimerleri ile temizlenir ve pasifleştirilir. Pasivasyon, çözünür proteinlerin erken deneysel aşamalarda cam yüzeylere yapışmasını önlemek ve sözleşme ağının cam duvarlarla etkileşimini en aza indirmek için gereklidir. İyi pasivasyon elde edilememesi verimsiz büzülmeye yol açabilir ve aşırı durumlarda aktin ağı oluşumunu bile engelleyebilir.
Şekil 1, yüzey işleme pro...

Watch this Scientific Journal Video about The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton at JoVE.com

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Bu çalışmada, kontrollü koşullar altında aktomiyosin jellerinin poroelastisitesini incelemek için in vitro rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Aktomiyosin jelinin ve gömülü çözücünün dinamikleri, ağ poroelastisitesinin gösterildiği şekilde ölçülür. Ayrıca deneysel zorlukları, ortak tuzakları ve hücre hücre iskeleti mekaniği ile olan ilgisini tartışıyoruz.

Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Poroelastik aktomiyosin jellerinin mekaniğini, hücre sitoiskeletinin ve daha genel olarak, poroelastik bir aktif materyal olarak davrandığı gösterilen sitoplazmanın model bir sistemi olarak karakterize etmek için in vitro bir yaklaşım geliştirdik. Bu yöntem, miyozin kontraktilitesinin bir sıvı akışının ortaya çıkmasına nasıl katkıda bulunduğuna ve ağ ve sitosol hızlarının zaman ve uzayda nasıl ilişkili olduğuna dair içgörüler sağlar. Bu basit yaklaşım, AFIM gibi geleneksel araçların kullanılamadığı herhangi bir sofistike ekipman veya teknik kullanmadan dinamik olarak gelişen sistemlerin mekanik özelliklerini çıkarmamızı sağlar.Bu yöntem, aktif jelin ve gömülü sıvının özgüllüğünden bağımsız olarak poroelastik aktif malzemelerin reolojisi hakkında fikir verebilir. Başlamak için, ev yapımı bir politetrafloroetilen tutucuya 10 ila 12 numaralı 1.5 cam örtü fişi yerleştirin ve 400 mililitrelik bir beherde Piranha çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi kimyasal bir başlıkta buz üzerinde hazırlayın.Tutucuyu Piranha dolgulu beher içine aktarın. Üç saat sonra, fazla Piranha'yı kapaklardan yıkamak için tutucuyu taze çift damıtılmış suyla doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın ve beheri 80 hertz'de bir sonikasyon banyosuna ve 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca tam güce aktarın. Bu adımı taze çift damıtılmış su ile iki kez daha tekrarlayın.Tuzlanma için, tutucuyu 300 mililitre saf metanol ile doldurulmuş temiz bir behere, ardından 30 dakika boyunca bir sonikasyon banyosuna aktarın. Daha sonra tutucuyu bir silan çözeltisine aktarın. Beheri parafilmle kapatın ve gece boyunca buzdolabında dört santigrat derecede saklayın.Ertesi gün, tutucuyu 15 saniye boyunca 300 mililitre saf metanol ile doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın. Fazla metanolü çıkarmak için tutucunun tabanını kurutun ve temiz bir behere aktarın. Ardından, cam kapakları 120 santigrat derecede beş dakika kurutmak için beheri fırına aktarın.Yüzey pasivasyonunu elde etmek için, her deney için iki kapak parçası alın ve bunları başlangıçta etanol ile temizlenmiş bir parafilm tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin. Her bir kapak kaymasını, 22 santigrat derecede bir saat boyunca 1X PBS'de bir mililitre metoksipolietilen glikol maleimid ile inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, Petri kabını çıkarmak ve sabitlemek için eğin.Her bir kapağı beş mililitre çift damıtılmış suyla durulayın ve azot gazı akışıyla kurutun. Pasivasyondan sonra kapakların ıslak tutulması gerektiğinden, pegile yüzeylere hemen bir mililitre 10 milimolar Tris koyun ve kapak fişlerini iki saat boyunca kullanın. Büyük miyozin agregaları oluşturmak için, nihai 25 milimolar potasyum klorür konsantrasyonuna ulaşmak için miyozin stok çözeltisini 10 milimolar Tris ile seyreltin.Seyreltilmiş miyozin çözeltisini oda sıcaklığında 10 dakika bekletin ve kullanana kadar buza aktarın. Motorlar iki saate kadar tamamen aktiftir. jel gözenekleri boyunca çözücü akışını izlemek için, pasifleştirilmiş floresan boncuklar hazırlayın ve bir mikrolitre boncuğu beş mikromolar G-aktin ile 20 dakika boyunca inkübe ederek boncuklar ile aktomiyosin ağı arasındaki etkileşimi azaltın.Fazla G-aktinini santrifüjleme ile çıkarın. Kalan kaplanmamış yüzeyi bloke etmek için mililitre sığır serum albümini başına 10 miligram ile bu adımı tekrarlayın ve boncukları deneylerde bir ila 10.000 arasında son seyreltmede kullanın. Aktomiyosin çözeltisini hazırlamak için, eksi 80 santigrat derecede depolanan protein alikotlarını çözün ve buzun üzerine yerleştirin.Daha sonra çözeltiyi 10 milimolar Tris, beş mikromolar G-aktin, 280 nanomolar GST Fascin ve 1.67 nanomolar miyozin II.Polietilen glikol pasifleştirilmiş kapak kaymalarından birini nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde hazırlayın. Üzerine yağlanmış bir paraform ara parça yerleştirin ve numune tutucuya yerleştirin. Tutucuya monte edilmiş kapak kaymasına 1,1 mikrolitre aktomiyosin çözeltisi ekleyin ve ikinci kapak kapağını üstüne yerleştirin.Numuneyi kapatmak için tutucuyu vidalayın. Numune tutucuyu mikroskop üzerine yerleştirin ve edinimi başlatın. İlk edinme süresini azaltmak için mikroskobu önceden hazırlayın.Örnekleri ters çevrilmiş bir floresan mikroskopla görüntülemek için, 2.5X hedefinin düşük büyütmelerini kullanarak tüm jel alanını görselleştirin ve zamanla makroskopik büzülmesini izleyin. Ağ gözenekliliğini ve yapısını karakterize etmek ve ağın kendi kendine örgütlenmesini ve zamanla daralmasını takip etmek için 10X'lik bir hedef kullanın. Eşzamanlı iki renkli görüntüleme için, 488 nanometrede aktini ve 561 nanometrede miyozin II motorlarını heyecanlandırın ve görüntüleri aynı anda bir çift emisyon aparatı kullanarak bir EMCCD kameraya kaydedin.Aktin jelini ve floresan miyozin II motorlarını aynı anda görüntülemek için aynı görüntüleme sistemini kullanın. Aynı anda iki renkli görüntüleme için, aktini 488 nanometrede ve 2.300 nanometre boncukları 561 nanometrede heyecanlandırın. Ve çift emisyon aparatı kullanarak görüntüleri aynı anda bir EMCCD kameraya kaydedin.Aktin jelini ve floresan boncukları aynı anda görüntülemek için aynı görüntüleme sistemini kullanın. İlk gün, aktomiyosin ağının elastik bir malzeme gibi davrandığını göstermeyi içerir. Burada bir aktomiyosin ağının şematik bir temsili tasvir edilmiştir.Floresan mikroskopi görüntüleri, aktin filamentlerinin kendiliğinden çekirdeklendiğini ve zamanla kabalaşan ve sonunda makroskopik olarak büzülen izotropik birbirine bağlı bir ağa polimerize olduğunu göstermektedir. Ağ çekimi jel çevresinde başlar ve jel kütlesine doğru içeri doğru yayılır. Jel merkezi bir C ile işaretlenmiştir.Aktin filament demetleri ağ daralması sırasında düz kalır.Kontur uzunluğu ile uçtan uca mesafe arasındaki oranın T316 saniye ve T327 saniyedeki dağılımı burada gösterilmiştir. İkinci amaç, dışa doğru bir çözücü akışının miyozin kontraktilitesi tarafından üretildiğini göstermeyi içerir. Kasılmanın ara aşamalarında jelin düşük büyütmedeki görüntüsü burada gösterilmiştir.Bu daireler dört boncuğun konumlarını işaretler. Oklar, boncuk hareketinin küresel yönünü işaretler. Seçilen dokuz boncuğun yörüngeleri burada tasvir edilmiştir.Ağ gözenekliliğinin çözülmesi ve çözücünün kasılmanın ileri aşamalarında jel gözenekleri boyunca hareketi burada tasvir edilmiştir. Üçüncü amaç, stres gevşemesinin etkili bir poroelastik difüzyon sabiti ile karakterize olduğunu göstermeyi içerir. Karıştırma süresinden kararlı duruma kadar düşük büyütmede büzülen bir aktomiyosin jelinin üstten görünümlü floresan görüntüleri burada gösterilmiştir.Aktomiyosin ağları poroelastik aktif bir madde gibi davranır. Bu prosedürü denerken, hızlı ve doğru çalışın ve yüzey korumasının önemini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Bir Gemi Stent Dağıtım sırasında Duvar Mekaniği izlenmesi

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

Manuel Lens sedye ile Lens konaklama mekaniği simüle

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kolajen peptid Microcarriers hücre genişletme ve hücre teslim sistemi bir biyoreaktör olarak potansiyel kullanım için ben Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...