Name: zebrafish animal model for the study of allergic reactions in response to tick saliva biomolecules
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules at JoVE.com

Vorremmo ringraziare i membri del gruppo SaBio per la loro collaborazione nella progettazione sperimentale e l'assistenza tecnica con l'impianto sperimentale del pesce e Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spagna) per aver fornito il pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spagna e EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras è finanziata dal Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spagna, sovvenzione IJC2020-042710-I.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università di Castilla La Mancha nell'ambito dello studio "Valutazione della risposta immunitaria al vaccino M. bovis inattivato e sfida con M. marinum nel numero di modello del pesce zebra PR-2017-05-12".
Le zecche sono state ottenute dalla colonia di laboratorio, dove campioni rappresentativi di zecche nella colonia sono stati testati mediante PCR per i patogeni comuni ...

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Il pesce zebra è un modello economico e facile da maneggiare che è stato anche uno strumento molto fattibile per lo studio dei meccanismi molecolari della risposta immunitaria, delle malattie patogene, dei nuovi test farmacologici, della vaccinazione e della protezione contro le infezioni33,34,35. Lo studio sul comportamento del pesce zebra è utile poiché studi precedenti hanno scoperto che alcune specie di pesci rimangono i...

Le zecche sono vettori di agenti patogeni che causano malattie e sono anche la causa di reazioni allergiche, che influenzano la salute degli esseri umani e degli animali in tutto il mondo 1,2. Durante l'alimentazione delle zecche, le biomolecole nella saliva delle zecche, in particolare proteine e lipidi, facilitano l'alimentazione di questi ectoparassiti, evitando le difese dell'ospite3. Alcune biomolecole di saliva con glicani Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificano la produzione di alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE dopo la puntura di zecca, solo in alcuni individui, che è noto come sindrome α-Gal (AGS)4. Questa è una malattia associata all'allergia IgE-mediata che può causare anafilassi alle punture di zecca, consumo di carne di mammifero non primate e alcuni farmaci come cetuximab5. Le reazioni a α-Gal sono spesso gravi e talvolta possono essere fatali 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Il α-Gal si trova in tutti i mammiferi ad eccezione delle scimmie del Vecchio Mondo, delle scimmie e degli esseri umani che non hanno la capacità di sintetizzare α-Gal13. Tuttavia, agenti patogeni come batteri e protozoi esprimono questo glicano sulla loro superficie, che può indurre la produzione di elevate quantità di anticorpi anti-α-Gal IgM/IgG e può essere un meccanismo protettivo contro questi patogeni16,17. Tuttavia, la produzione di anticorpi anti-α-Gal aumenta il rischio di sviluppare allergie anti-α-Gal mediate da IgE 7,13. Gli anticorpi anti-α-Gal naturali prodotti nell'uomo, principalmente dei sottotipi IgM/IgG, potrebbero essere associati a questa modificazione presente nei batteri del microbiota intestinale16. L'AGS può essere una diagnosi clinica impegnativa, poiché il principale metodo diagnostico al momento si basa su una storia clinica di reazioni allergiche ritardate, in particolare associate ad allergie alimentari (cioè prurito, orticaria localizzata o angioedema ricorrente ad anafilassi, orticaria e sintomi gastrointestinali) e la misurazione dei livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE9. I risultati attuali suggeriscono che le punture di zecca costituiscono uno dei principali rischi nella comparsa di AGS 18,19, un aumento di 20 volte o più dei livelli di IgE a α-Gal a seguito di una puntura di zecca 19, una storia di punture di zecca in pazienti con AGS20,21,22, l'esistenza di anticorpi reattivi agli antigeni delle zecche nei pazienti AGS 19, e che le IgE anti-α-Gal sono fortemente correlate ai livelli di IgE anti-zecca19,23, ma sono necessari ulteriori studi per valutare quali biomolecole sono effettivamente coinvolte.
Inoltre, un altro scenario possibile sono i pazienti che presentano forti reazioni allergiche alle punture di zecca e alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE, ma sono tolleranti al consumo di carne di mammifero12. Pertanto, l'allergia alla carne di mammifero potrebbe essere un particolare tipo di allergia correlata al morso di zecca. Le principali specie di zecche associate all'AGS includono Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasile), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Giappone), Ixodes holocyclus (Australia) e Ixodes ricinus (il principale vettore della borreliosi di Lyme in Europa)11,24. 
L'unico modello che è stato utilizzato per valutare la produzione di IgE correlata alle punture di zecca è il modello murino geneticamente modificato con il gene per topi α-1,3-galattosiltransferasi knocked out (α-Gal KO)25,26 perché, come altri mammiferi, i topi esprimono anche α-Gal su proteine e lipidi e non producono IgE in α-Gal. Tuttavia, il pesce zebra (Danio rerio) è un modello utile per la ricerca biomedica applicata ai mammiferi perché condivide molte somiglianze anatomiche con i mammiferi e, come gli umani, non è anche in grado di sintetizzare α-Gal. Poiché α-Gal non è prodotto naturalmente nel pesce zebra, è un modello economico, facile da manipolare e consente un'elevata dimensione del campione per lo studio delle reazioni allergiche correlate al α-Gal.
In questo studio, il pesce zebra viene utilizzato come organismo modello per caratterizzare e descrivere le reazioni allergiche locali, i modelli comportamentali e i meccanismi molecolari associati alla risposta alla sensibilizzazione percutanea alla saliva delle zecche26,27 e al successivo consumo di carne di mammifero. A tale scopo, i pesci vengono esposti alla saliva delle zecche mediante iniezione intradermica e quindi vengono nutriti con mangimi per cani, che contengono prodotti derivati dalla carne di mammifero adatti all'uso animale che contengono α-Gal27, quindi vengono valutate eventuali reazioni allergiche correlate. Questo metodo può essere applicato allo studio di altre biomolecole correlate ai processi allergici, in particolare quelli correlati all'AGS.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Prep DNA/RNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatics facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection set</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog Food - Red Classic</td>
			<td>Acana</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates-96 well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10547781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&#945;-Gal)&#160;</td>
			<td>Dextra</td>
			<td>NGP0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Supermix</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7638-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pilocarpine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip P10&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium food tropical fish</td>
			<td>DAPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge Animal Holder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made from scrap foam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler Real-Time PCR</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulphonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish animal model for the study of allergic reactions in response to tick saliva biomolecules

Le zecche sono vettori di artropodi che causano malattie per trasmissione di agenti patogeni e le cui punture potrebbero essere correlate a reazioni allergiche che hanno un impatto sulla salute umana in tutto il mondo. In alcuni individui, alti livelli di anticorpi immunoglobuline E contro il glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) sono stati indotti da punture di zecca. Le reazioni anafilattiche mediate da glicoproteine e glicolipidi contenenti il glicano α-Gal, presente nella saliva delle zecche, sono correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) o all'allergia alla carne di mammifero. Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un modello di vertebrati ampiamente utilizzato per lo studio di diverse patologie. In questo studio, il pesce zebra è stato utilizzato come modello per lo studio delle reazioni allergiche in risposta al consumo di carne di α-Gal e di mammifero perché, come gli esseri umani, non sintetizzano questo glicano. A tale scopo, sono stati valutati i modelli comportamentali e le reazioni allergiche di tipo anafilattico emorragico in risposta alla saliva della zecca Ixodes ricinus e al consumo di carne di mammifero. Questo approccio sperimentale consente di ottenere dati validi che supportano il modello animale zebrafish per lo studio delle allergie trasmesse dalle zecche incluso AGS.

Il protocollo qui presentato si basa su diversi aspetti degli esperimenti precedentemente pubblicati 27,30 e sui risultati eseguiti nel nostro laboratorio dove viene stabilito e validato il modello del pesce zebra per lo studio dell'AGS e della risposta immunitaria al α-Gal perché sia l'uomo che il pesce zebra non sintetizzano questa molecola13. Questo modello consente la caratterizzazione e la valutazione di una varietà di reazioni all...

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Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

Qui, il pesce zebra (Danio rerio) viene utilizzato come modello per studiare le reazioni allergiche e le risposte immunitarie correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) valutando le reazioni allergiche alla saliva delle zecche e al consumo di carne di mammifero.

Modello animale di zebrafish per lo studio delle reazioni allergiche in risposta alle biomolecole della saliva delle zecche

Ticks are arthropod vectors that cause disease by pathogen transmission and whose bites could be related to allergic reactions impacting human health ...

La domanda è perché solo alcuni individui esposti a punture di zecca sviluppano reazioni allergiche. Per noi, chiarire le biomolecole nella saliva delle zecche e i meccanismi immunitari che coinvolgono questo processo è la chiave per affrontare questa domanda. Il modello animale zebrafish della sindrome alfa-Gal riproduce modelli comportamentali umani e reazioni allergiche in risposta alla saliva delle zecche.Questo approccio sperimentale migliora la comprensione dell'interazione molecolare tick-host in cui abbiamo conflitti associati alla sindrome alfa-Gal e cooperazione associata alla risposta anticorpale all'alfa-Gal, che sono protettivi contro l'infezione patogena. Per trattare il pesce con la saliva delle zecche, distribuire il pesce zebra adulto in tre gruppi equilibrati dal punto di vista del genere. Utilizzare Gala1-3Gal-BSA 3 o alpha-Gal commerciali come controllo positivo e PBS come controllo negativo.Per l'estrazione della saliva, utilizzare zecche femmine semi-gonfie, prive di agenti patogeni, alimentate per sei-sette giorni su porcellini d'India. Trattare il segno di spunta con cinque microlitri di una soluzione al 2% di pilocarpina cloridrato in PBS a pH 7,4 nell'emocele usando una siringa da 50 microlitri con un ago da 0,33 millimetri. Raccogliere la saliva dall'ipostoma delle zecche usando una punta da 10 microlitri montata su una micropipetta.Metti la saliva in un tubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio e conservala a meno 80 gradi Celsius. Determinare la concentrazione di proteine della saliva per stabilire la quantità di proteine da iniettare nel pesce utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA, seguendo le raccomandazioni del produttore. Mantenere il pesce zebra in un sistema di flusso d'acqua a 27 gradi Celsius con un ciclo luce-buio da 14 a 10 ore.Quindi, selezionare 10 pesci per gruppo con un rapporto simile tra femmine e maschi e un peso simile per l'iniezione. Anestetizzare brevemente il pesce mediante immersione in metansolfonato di tricaina allo 0,02%. Posizionare il pesce anestetizzato sulla sua metà lato usando una pinza o le mani con attenzione, su una spugna bagnata, con la pinna caudale sul lato destro per iniettare i composti nella stessa direzione per controllare le lesioni.Iniettare gruppi di pesci per via intradermica nel muscolo con una siringa da 100 microlitri dotata di un ago di un centimetro, calibro 29 a cinque millimetri dalla pinna caudale e un angolo di 45 gradi rispetto al corpo del pesce. Dopo l'iniezione, rimettere il pesce trattato in un serbatoio d'acqua dolce senza anestesia per il recupero. Dai da mangiare al pesce due volte al giorno alle 9:30.e alle 13:30 con 50-70 microgrammi di mangime secco per pesce fino al secondo giorno. Quindi schiacciare il cibo per cani con un mortaio e un pestello per nutrire il pesce dal secondo giorno dopo l'iniezione di trattamento fino alla fine dell'esperimento l'ottavo giorno.Per la raccolta dei campioni, fissare il pesce eutanasia su una piastra di paraffina con spilli. Raccogliere il siero dai vasi sanguigni branchiali del pesce quando le branchie sono ancora irrigate con sangue usando una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago da un centimetro, calibro 29. Conservare il siero raccolto in un tubo da 1,5 millilitri a 20 gradi Celsius fino all'uso.Tagliare il pesce sagittalmente con una lama di bisturi e valutare le lesioni interne. Quindi raccogliere l'intestino e il rene di ciascun pesce in tubi separati da 1,5 millilitri. Estrarre l'RNA totale dall'intestino e dai reni utilizzando un kit di purificazione dell'RNA.Analizzare l'espressione di geni correlati alla risposta immunitaria, eseguendo una reazione a catena quantitativa a trascrizione inversa-polimerasi, o RT-qPCR utilizzando un mix di trascrizione inversa per RT-qPCR, secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare i valori di mRNA cT rispetto al GAPDH del pesce zebra e confrontare tra i gruppi utilizzando un test t di Student con varianza disuguale. Determinare i titoli anticorpali IgM che riconoscono alfa-Gal nei campioni di siero mediante ELISA.Registrare i titoli anticorpali come valori di densità ottica di 450 nanometri utilizzando un lettore di piastre e confrontare tra gruppi utilizzando un test t di Student con varianza disuguale. Questo modello di zebrafish consente la caratterizzazione e la valutazione di varie reazioni allergiche dovute alla risposta dell'ospite alla saliva delle zecche e alla loro implicazione nella sindrome alfa-Gal, o AGS. Inoltre, rispetto al pesce di controllo, sono state osservate alterazioni nei comportamenti come il nuoto lento, sdraiarsi sul fondo della vasca e non mangiare, vibrare o zigzagare nei pesci trattati con saliva di zecca.Un'incidenza significativa di reazioni allergiche è stata osservata nei pesci trattati con saliva di zecca, mostrando una rapida desensibilizzazione e tolleranza. Il cambiamento comportamentale era più pronunciato nei pesci trattati con saliva di zecca che con solo alfa-Gal. Un'ulteriore analisi dell'espressione dei marcatori immunitari rappresentativi è stata eseguita mediante RT-PCR.I risultati hanno mostrato differenze tra i gruppi di zebrafish nel rene, dove i marcatori di risposta immunitaria erano sottoregolati nei pesci trattati con saliva e alfa-Gal rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, il pesce zebra trattato con saliva e alfa-Gal ha sviluppato anticorpi IgM contro alfa-Gal che hanno mostrato livelli più elevati rispetto ai pesci trattati con PBS. L'iniezione del trattamento, la valutazione delle reazioni allergiche e del comportamento e la segnalazione del numero di pesci morti da reazioni allergiche sono l'aspetto più importante del protocollo.L'utilizzo di tecnologie omiche a livello di mRNA, proteine e microbioma per caratterizzare la risposta alla saliva delle zecche ci consente di identificare le biomolecole chiave coinvolte in questo processo.

Research

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