Name: zebrafish animal model for the study of allergic reactions in response to tick saliva biomolecules
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo SaBio por sua colaboração no projeto experimental e assistência técnica com a instalação experimental de peixes e Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Espanha) pelo fornecimento de peixe-zebra. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Espanha e EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras é financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espanha, bolsa IJC2020-042710-I.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Castilla La Mancha sob o estudo "Avaliação da resposta imune à vacina inativada contra M. bovis e desafio com M. marinum no modelo de peixe-zebra número PR-2017-05-12".
Os carrapatos foram obtidos da colônia de laboratório, onde amostras representativas de carrapatos na colônia foram testadas por PCR para patógenos comuns de carrapatos para confirmar a...

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	<li>de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cetuximab-induced+anaphylaxis+and+IgE+specific+for+galactose-alpha-1,3-galactose.">Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).</li><li>Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+tick+bite+reactions+and+red+meat+allergy+in+humans.">An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans.</a> The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).</li><li>Cabezas-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+molecular+drivers+of+the+&#945;-Gal+syndrome.">Environmental and molecular drivers of the &#945;-Gal syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).</li><li>de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-Gal+syndrome:+new+insights+into+the+tick-host+conflict+and+cooperation.">The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation.</a> Parasites &amp; Vectors. 12 (1), 154 (2019).</li><li>Platts-Mills, T. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amblyomma+sculptum+tick+saliva:+&#945;-Gal+identification,+antibody+response+and+possible+association+with+red+meat+allergy+in+Brazil.">Amblyomma sculptum tick saliva: &#945;-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil.</a> International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).</li><li>Contreras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+reactions+and+immunity+in+response+to+tick+salivary+biogenic+substances+and+red+meat+consumption+in+the+zebrafish+model.">Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).</li><li>Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond.">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li><li>Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prednisolone+on+behavior+and+hypothalamic-pituitary-interrenal+axis+activity+in+zebrafish.">Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).</li><li>Alestr&#246;m, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Housing+and+husbandry+recommendations.">Zebrafish: Housing and husbandry recommendations.</a> Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).</li></ol>

O peixe-zebra é um modelo custo-efetivo e de fácil manuseio, que também tem sido uma ferramenta bastante viável para o estudo de mecanismos moleculares da resposta imune, doenças patogênicas, testes de novas drogas e vacinação e proteção contra infecções33,34,35. O estudo sobre o comportamento do peixe-zebra é útil, uma vez que estudos anteriores descobriram que algumas espécies de peixes permanecem imóveis no fu...

Os carrapatos são vetores de patógenos causadores de doenças e também são causadores de reações alérgicas, afetando a saúde humana e animal em todo omundo1,2. Durante a alimentação do carrapato, biomoléculas presentes na saliva do carrapato, especialmente proteínas e lipídios, facilitam a alimentação desses ectoparasitas, evitando as defesas do hospedeiro3. Algumas biomoléculas salivares com modificações no glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) levam à produção de altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE após a picada do carrapato, apenas em alguns indivíduos, o que é conhecido como Síndrome de α-Gal (AGS)4. Trata-se de uma doença associada à alergia mediada por IgE que pode resultar em anafilaxia a picadas de carrapatos, consumo de carne de mamíferos não primatas e alguns fármacos, como o cetuximabe5. As reações à α-Gal são frequentemente graves e algumas vezes podem ser fatais 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
O α-Gal é encontrado em todos os mamíferos, exceto macacos do Velho Mundo, macacos e humanos que não têm a capacidade de sintetizar α-Gal13. Entretanto, patógenos como bactérias e protozoários expressam esse glicano em sua superfície, o que pode induzir a produção de grandes quantidades de anticorpos IgM/IgG anti-α-Gal e pode ser um mecanismo protetor contra esses patógenos16,17. Entretanto, a produção de anticorpos anti-α-Gal aumenta o risco de desenvolvimento de alergias anti-α-Gal mediadas por IgE 7,13. Anticorpos naturais anti-α-Gal produzidos em humanos, principalmente dos subtipos IgM/IgG, poderiam estar associados a essa modificação presente em bactérias da microbiota intestinal16. A AGS pode ser um diagnóstico clínico desafiador, uma vez que o principal método diagnóstico no momento baseia-se na história clínica de reações alérgicas tardias, especialmente associadas a alergias alimentares (isto é, prurido, urticária localizada ou angioedema recorrente à anafilaxia, urticária e sintomas gastrointestinais) e na dosagem de anticorpos IgE anti-α-Gal9. Os achados atuais sugerem que a picada de carrapato constitui um dos principais riscos no aparecimento da AGS 18,19, um aumento de 20 vezes ou mais nos níveis de IgE para α-Gal após uma picada de carrapato 19, uma história de picada de carrapato em pacientes com AGS20,21,22, a existência de anticorpos reativos a antígenos de carrapatos em pacientes com AGS 19, e que a IgE anti-α-Gal está fortemente relacionada aos níveis de IgE anti-carrapato19,23, mas mais estudos são necessários para avaliar quais biomoléculas estão realmente envolvidas.
Além disso, outro cenário possível são pacientes que apresentam fortes reações alérgicas a picadas de carrapatos e altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE, mas são tolerantes ao consumo de carne de mamíferos12. Portanto, a alergia à carne de mamíferos pode ser um tipo particular de alergia relacionada à picada de carrapato. As principais espécies de carrapatos associadas à AGS incluem Amblyomma americanum (EUA), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Japão), Ixodes holocyclus (Austrália) e Ixodes ricinus (principal vetor da borreliose de Lyme na Europa)11,24. 
O único modelo que tem sido utilizado para avaliar a produção de IgE relacionada a picadas de carrapatos é o modelo de camundongos geneticamente modificados com o gene para camundongos knocked out de α−1,3-galactosiltransferase (α-Gal KO)25,26, pois, assim como outros mamíferos, camundongos também expressam α-Gal em proteínas e lipídios e não produzem IgE para α-Gal. No entanto, o peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo útil para pesquisas biomédicas aplicadas a mamíferos porque compartilha muitas semelhanças anatômicas com mamíferos e, como os humanos, também é incapaz de sintetizar α-Gal. Como o α-Gal não é produzido naturalmente em peixe-zebra, é um modelo acessível, fácil de manipular e permite um alto tamanho de amostra para o estudo de reações alérgicas relacionadas ao α-Gal.
Neste estudo, o zebrafish é utilizado como organismo modelo para caracterizar e descrever reações alérgicas locais, padrões comportamentais e mecanismos moleculares associados à resposta à sensibilização percutânea à saliva do carrapato26,27 e subsequente consumo de carne de mamíferos. Para este fim, os peixes são expostos à saliva do carrapato por injeção intradérmica e, em seguida, são alimentados com ração para cães, que contém produtos derivados da carne de mamíferos adequados para uso animal que contém α-Gal27, em seguida, possíveis reações alérgicas relacionadas são avaliadas. Este método pode ser aplicado ao estudo de outras biomoléculas relacionadas a processos alérgicos, especialmente aquelas relacionadas à AGS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Prep DNA/RNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatics facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disection set</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog Food - Red Classic</td>
			<td>Acana</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates-96 well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10547781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&#945;-Gal)&#160;</td>
			<td>Dextra</td>
			<td>NGP0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Supermix</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7638-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pilocarpine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip P10&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium food tropical fish</td>
			<td>DAPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge Animal Holder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made from scrap foam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler Real-Time PCR</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulphonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish animal model for the study of allergic reactions in response to tick saliva biomolecules

Os carrapatos são artrópodes vetores que causam doenças por transmissão de patógenos e cujas picadas podem estar relacionadas a reações alérgicas que impactam a saúde humana em todo o mundo. Em alguns indivíduos, altos níveis de anticorpos de imunoglobulina E contra o glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) foram induzidos por picadas de carrapatos. As reações anafiláticas mediadas por glicoproteínas e glicolipídios contendo o glicano α-Gal, presentes na saliva do carrapato, estão relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS) ou alergia à carne de mamíferos. O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um modelo de vertebrado amplamente utilizado para o estudo de diferentes patologias. Neste estudo, o peixe-zebra foi usado como modelo para o estudo de reações alérgicas em resposta ao consumo de carne de α-Gal e mamíferos porque, assim como os humanos, eles não sintetizam esse glicano. Para isso, foram avaliados os padrões comportamentais e as reações alérgicas do tipo anafilático hemorrágico em resposta ao consumo de saliva do carrapato Ixodes ricinus e carne de mamíferos. Esta abordagem experimental permite a obtenção de dados válidos que suportam o modelo animal do peixe-zebra para o estudo de alergias transmitidas por carrapatos, incluindo a AGS.

O protocolo aqui apresentado é baseado em vários aspectos de experimentos previamentepublicados27,30 e resultados realizados em nosso laboratório onde o modelo do zebrafish é estabelecido e validado para o estudo da AGS e da resposta imune ao α-Gal, pois tanto humanos quanto zebrafish não sintetizam essa molécula13. Este modelo permite caracterizar e avaliar uma variedade de reações alérgicas como resultado da resposta do hospede...

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Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

Aqui, o peixe-zebra (Danio rerio) é usado como modelo para estudar reações alérgicas e respostas imunes relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS), avaliando reações alérgicas à saliva de carrapatos e ao consumo de carne de mamíferos.

Modelo animal de peixe-zebra para o estudo de reações alérgicas em resposta a biomoléculas de saliva de carrapato

Ticks are arthropod vectors that cause disease by pathogen transmission and whose bites could be related to allergic reactions impacting human health ...

A questão é por que apenas alguns indivíduos expostos a picadas de carrapatos desenvolvem reações alérgicas. Para nós, elucidar as biomoléculas presentes na saliva do carrapato e os mecanismos imunológicos que envolvem esse processo é fundamental para resolver essa questão. O modelo animal da síndrome alfa-Gal reproduz padrões comportamentais humanos e reações alérgicas em resposta à saliva do carrapato.Esta abordagem experimental avança na compreensão da interação molecular carrapato-hospedeiro na qual temos conflito associado com a síndrome alfa-Gal e cooperação associada com a resposta de anticorpos para alfa-Gal, que são protetores contra a infecção por patógenos. Para tratar os peixes com saliva de carrapato, distribua peixes-zebra adultos em três grupos equilibrados em termos de gênero. Use Gala1-3Gal-BSA 3 ou alfa-Gal comercial como controle positivo e PBS como controle negativo.Para a extração de saliva, utilizar carrapatos fêmeas semi-ingurgitadas, livres de patógenos, alimentadas por seis a sete dias em cobaias. Trate o carrapato com cinco microlitros de uma solução a 2% de cloridrato de pilocarpina em PBS a pH 7,4 no hemocoel usando uma seringa de 50 microlitros com uma agulha de 0,33 milímetros. Coletar saliva do carrapato hipostomo usando uma ponta de 10 microlitros montada em uma micropipeta.Coloque a saliva em um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo e armazene-a a 80 graus Celsius negativos. Determinar a concentração de proteína da saliva para estabelecer a quantidade de proteína a ser injetada no peixe usando um kit de ensaio de proteína BCA, seguindo as recomendações do fabricante. Mantenha o peixe-zebra em um sistema de água de fluxo a 27 graus Celsius com um ciclo claro-escuro de 14 a 10 horas.Em seguida, selecione 10 peixes por grupo com uma proporção semelhante de fêmeas para machos e peso semelhante para injeção. Anestesiar brevemente os peixes por imersão em metanossulfonato de tricaína a 0,02%. Colocar o peixe anestesiado em sua metade lateral, utilizando pinça ou mãos, cuidadosamente, sobre uma esponja molhada, com a nadadeira caudal do lado direito para injetar os compostos na mesma direção para controlar as lesões.Injetar grupos de peixes por via intradérmica no músculo com uma seringa de 100 microlitros equipada com uma agulha de um centímetro e calibre 29 a cinco milímetros para a nadadeira caudal e um ângulo de 45 graus para o corpo do peixe. Após a injeção, coloque o peixe tratado de volta em um tanque de água doce sem anestesia para recuperação. Alimente os peixes duas vezes ao dia às 9h30.e 13h30 com 50 a 70 microgramas de ração seca por peixe até o segundo dia. Em seguida, amasse a ração do cão com uma argamassa e pilão para alimentar os peixes do segundo dia após a injeção do tratamento até o final do experimento no oitavo dia.Para a coleta das amostras, fixar os peixes eutanasiados em uma placa de parafina com pinos. Coletar o soro dos vasos sanguíneos branquiais dos peixes quando as brânquias ainda estiverem irrigadas com sangue usando uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de um centímetro e calibre 29. Armazenar o soro coletado em um tubo de 1,5 mililitro a 20 graus Celsius até o uso.Cortar o peixe sagitalmente com uma lâmina de bisturi e avaliar as lesões internas. Em seguida, colete o intestino e o rim de cada peixe em tubos separados de 1,5 mililitro. Extraia o RNA total do intestino e do rim usando um kit de purificação de RNA.Analisar a expressão de genes relacionados à resposta imune, realizando transcrição reversa quantitativa - reação em cadeia da polimerase, ou RT-qPCR utilizando uma mistura de transcrição reversa para RT-qPCR, de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar os valores de cT de mRNA contra o GAPDH do peixe-zebra e comparar entre os grupos usando um teste t de Student com variância desigual. Determinar títulos de anticorpos IgM que reconhecem alfa-Gal em amostras de soro por ELISA.Registrar os títulos de anticorpos como valores de densidade óptica de 450 nanômetros usando um leitor de placas e comparar entre os grupos usando um teste t de Student com variância desigual. Este modelo de zebrafish permite a caracterização e avaliação de várias reações alérgicas devido à resposta do hospedeiro à saliva do carrapato e sua implicação na síndrome alfa-Gal, ou AGS. Além disso, em comparação com os peixes controle, alterações em comportamentos como nadar lentamente, deitar no fundo do tanque e não comer, vibrar ou ziguezaguear foram observadas em peixes tratados com saliva de carrapato.Uma incidência significativa de reações alérgicas foi observada em peixes tratados com saliva de carrapato, mostrando rápida dessensibilização e tolerância. A mudança comportamental foi mais pronunciada nos peixes tratados com saliva de carrapato do que apenas com alfa-Gal. Análise adicional da expressão dos marcadores imunes representativos foi realizada por RT-PCR.Os resultados mostraram diferenças entre os grupos de peixe-zebra no rim, onde os marcadores de resposta imune foram regulados negativamente em peixes tratados com saliva e alfa-Gal em comparação com o grupo controle. Além disso, os peixes-zebra tratados com saliva e alfa-Gal desenvolveram anticorpos IgM contra alfa-Gal que mostraram níveis mais altos do que em peixes tratados com PBS. A injeção do tratamento, a avaliação das reações alérgicas e do comportamento e o relato do número de peixes mortos por reações alérgicas são os aspectos mais importantes do protocolo.O uso de tecnologias ômicas nos níveis de mRNA, proteína e também microbioma para caracterizar a resposta à saliva do carrapato permite identificar as principais biomoléculas envolvidas nesse processo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Imunologia e Infecção

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

A saliva, glândula salivar, e Coleta de hemolinfa de carrapatos Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

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Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

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