Name: assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

Alle dyreforsøg i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Michigan, Ann Arbor. Alle mus blev anbragt i en 12:12 lyscyklus i patogenfrie rum. Se Materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, dyr og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Konstruktion af silikoneballonkateteret
OBS: Silikoneballonen er lavet som beskrevet tidligere13.
<ol><li>Tilsæt 9,5 ml destilleret vand, 14,2 ml let majssirup og 33,8 g saccharose til et 100 ml bægerglas. Opvarm og rør opløsningen, indtil sukkeret er helt opløst.</li>
	<li>Forbered dejen ved at blande 10 g hvedemel og 5 g vand, indtil der opnås en jævn konsistens, og lad den hvile i 10 min.</li>
	<li>Form et lille stykke dej til en oval - "hovedet" - og fastgør det til enden af en tør spaghettistreng. Dyp derefter hovedet i sukkeropløsningen og fjern langsomt fra opløsningen, da hovedet nu er helt belagt. BEMÆRK: Dejen skal være glat og af jævn tekstur. Dejstørrelserne kan varieres for at generere forskellige størrelser balloner, fra 5 mm (kort diameter) til 7 mm (lang diameter). Prøv at dække dem med en tynd film af sukkeropløsning.</li>
	<li>Suspender spaghettistrengen på en polystyrenskumblok eller andre holdere for at danne et blankt dæksel jævnt over hovedet og tør natten over.</li>
	<li>Dyp formen i silikonedispersion (silikone elastomer dispergeret i xylen). Spaghettistrengen hældes tilbage i polystyrenskumblokken ved 37 °C i 2 timer eller indtil den er tør. Gentag dette trin én gang. BEMÆRK: Det er vigtigt at forhindre, at silikonedispersionsgelen oxiderer på grund af lufteksponering, da dette vil generere en ujævn ballontykkelse.</li>
	<li>Placer formen i vandet for at adskille og samle ballonen. Opbevar ballonen i 0,02% natriumazid.</li>
	<li>Skær en to-stump spids fra en 22 G nål; Monter en stump ende på silikoneballonen og en anden stump ende på PE-slangen. Brug 4-0 silke til at binde ballonen på plads på nålen. BEMÆRK: Test ballonens integritet ved at injicere vand i den. Når ballonen er fyldt, skal du trykke let på ballonen for at teste, om ballonen opretholder spændingen indeni. Brug en ny ballon, hvis den lækker. De monterede balloner kan opbevares til fremtidig brug.</li>
</ol>2. Forberedelse af hjerteperfusionssystemet
<ol><li>Lav 1 L Krebs-Henseleit (KH) perfusionsbuffer og overfør den til vandreservoiret Langendorff-systemet.</li>
	<li>Tilslut luftrøret til vandbeholderen, og tænd for luftstrømmen for at afbalancere KH-bufferen med 5% CO 2 og 95% O2 i mindst 30 minutter.</li>
	<li>Indstil vandbadet til 41,5 °C, og cirkulere vandet i det ydre lag af Langendorff-systemet for at opvarme systemet og KH-bufferen. BEMÆRK: Vandbadstemperaturen kræver optimering for hvert system. For dette system vil vandbadstemperaturen holde KH på 37-37,5 ° C, når den perfuseres ind i hjertet.</li>
</ol>3. Isolering, montering og kanylering af musehjertet
<ol><li>Til antikoagulation administreres 200 enheder heparin i saltvand ved intraperitoneal injektion (i.p.) i højre kvadrant af C57/B6 museabdomen. Opsug sprøjten før injektion for at bekræfte, at nålens skråning ikke er i blæren eller lumen i mave-tarmkanalen. Brug mindst fire mus i hver eksperimentel tilstand (men overvej også størrelsen af behandlingseffekten).<ol><li>Efter 30 minutter administreres 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin i.p. for at bedøve musen. Kontroller, om den bedøvede mus er bevidstløs ved at udføre en tåklemme og sikre, at der ikke observeres noget svar. Acepromazin 2 mg / kg kan tilsættes til ket/xyl-cocktailen, hvis den anvendte stamme af mus ikke når et tilstrækkeligt niveau af anæstesi kun med ket/xyl.</li>
		<li>Lav et snit lige under brystbenet. Brug en saks til at åbne brystet ved at skære membranen og ribbenene. Fold den forreste brystvæg for at udsætte brystet helt. Skær ved den nedadgående aorta (lukket for aortabuen). Overfør musens hjerte, lunger og thymus til kold histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK) buffer. Isoler organerne under iskold HTK-buffer. Udsæt aorta ved at fjerne bindevæv. BEMÆRK: Maksimer aortalængden ved at inkludere både den stigende aorta og aortabuen i udskæringen for at give plads nok til at forbinde til en nål.</li>
	</ol></li>
	<li>Tilslut enden af aorta til en 22 G nål, og bind med en 6-0 silkesutur. Sørg for, at kanylen er over aortaroten for ikke at forstyrre aortaklappen. Perfus aorta med 10 ml kold (4 °C) HTK-buffer over ca. 10 min. BEMÆRK: Det tager mindre end 15 minutter fra fjernelse af hjertet til kanylering af aorta; Det er dog vigtigt at holde perfusionshastigheden på det passende niveau. Injektioner, der er for hurtige og kraftige, kan generere høje tryk og forårsage vaskulær / hjerteskade.</li>
	<li>Opbevar hjertet i et 50 ml rør med iskold HTK i 8 timer eller udfør straks perfusionen (opbevar ikke kontrollen) og undgå direkte kontakt med is. BEMÆRK: Direkte kontakt af hjertevævet med is kan føre til kuldeskade.</li>
	<li>Tilslut det nålemonterede hjerte til kanylen i Langendorff-apparatet og bind det med en silkesutur. BEMÆRK: For at standardisere proceduren skal du vente i alt 3 minutter på kanyleringsprocessen før perfusion.</li>
	<li>Start perfusionen med en konstant strømningstilstand ved 3 ml / min; Skift derefter til konstant tryktilstand ved 70-80 mmHg og juster hjertet til ~ 6 ml / min. BEMÆRK: Palpering af hjertet blødt kan hjælpe med at fremskynde hjertegenoplivning. Hvis perfusionsstrømningshastigheden er meget højere end 6 ml / min ved konstant tryktilstand, kan der være en lækage i kanyleringen, eller aortaventilen fungerer muligvis ikke korrekt. Juster forbindelserne for at rette lækagen. Den konstante strømningstilstand tilsidesætter hjertets vaskulære tone, selvregulering. Den konstante tryktilstand gør det muligt for hjertet at regulere sin koronar perfusionsstrøm. Derfor vil den konstante tryktilstand præcist måle hjertets hjertefunktion og bevaringskvalitet.</li>
	<li>Tilslut en tømt, vandfyldt ballon til en tryktransducer og en vandfyldt sprøjte med en trevejshane. Efter en 15-20 minutters ligevægtsperiode skal du skære det højre atrium (RA) og indsætte ballonen i RV'en gennem RA. Brug tape til at holde ballonen inde i autocamperen. Minimer det åbne område af RA for at hjælpe med at begrænse ballonen i ventriklen (se figur 1 for opsætningen). BEMÆRK: En periode med ligevægt er nødvendig, da hjertekontraktion og afslapning ikke er stabil i begyndelsen, og målingen er mindre nøjagtig og repræsentativ. Hvis AV-knuden er beskadiget under åbningen af RA, vil hjertet vise hyppige arytmier.</li>
	<li>Efter 20 minutters RV-funktionel dataindsamling skal du skære venstre atrium (LA) og indsætte en tømt vandfyldt ballon til LV gennem LA. Brug tape til at holde ballonen inde i LV. BEMÆRK: Hjertet skal opretholde stabil hæmodynamik i mere end 1,5 timer.</li>
</ol>4. Registrering af funktionelle data
<ol><li>Kalibrering af tryktransduceren<ol><li>Fyld en 10 ml sprøjte med varmt saltvand, og tilslut sprøjten til kuplen gennem en trevejshane. Åbn hanen og fyld langsomt kuplen med saltvand, og luk derefter alle vandhaner og fjern sprøjten. Fastgør den fyldte kuppel til transduceren; Tilslut manometeret til den tredje ende af trevejshanet.</li>
		<li>I optagelsessoftwaren skal du vælge Bridge Amp i rullemenuen for den kanal, der opretter forbindelse til transduceren. Omdøb kanalen til Perfuseret tryk. Klik på Nul for at nulstille transduceren.</li>
		<li>Start optagelsen ved at klikke på Start , så transduceren nu læser 0 mmHg. Efter flere sekunders optagelse skubbes sprøjten langsomt og øges trykket til 100. Klik på stop for at stoppe optagelsen.</li>
		<li>I dialogboksen Enhedskonvertering skal du vælge et optagelsesområde for 0 mmHg og klikke på pilen til Punkt 1 og skrive 0 mmHg. Vælg optagelsesområde for 100 mmHg, klik på pilen til punkt 2, og skriv 100 mmHg. Klik på OK for at kalibrere transduceren.</li>
	</ol></li>
	<li>Omdøb kanalen svarende til tryktransduceren med ballonen som ventrikeltryk. Start optagelsen, når hjertet er tilsluttet systemet. Når du har indsat ballonen i ventriklen, skal du justere vandmængden i ballonen ved hjælp af en mikrometersprøjte gennem trevejshanen for at opretholde det diastoliske tryk ved 5-10 mmHg. BEMÆRK: Det diastoliske mål kan falde under målingen, helst startende ved tæt på 10 mmHg.</li>
	<li>Omdøb en tom kanal til dP/dt. I rullemenuen skal du vælge Afledt | kildekanal som ventrikeltryk. Kanalen registrerer forholdet mellem trykændring i ventrikulært hulrum i sammentrækningsperioden.</li>
	<li>Vælg en stabil måleperiode, og klik derefter på Indstilling på blodtryksmodulet.<ol><li>Vælg ventrikeltrykket som indgangskanal, og klik på valg for en beregningsperiode | OK.</li>
		<li>Klik på Klassificeringsvisning for at fjerne den afvigende hjertecyklus (f.eks. unormal cyklustid eller unormalt tryk).</li>
		<li>Klik på tabelvisning for at generere tabellerne over gennemsnittet af max dP/dt (sammentrækning) og min dP/dt (afslapning) for den valgte periode. BEMÆRK: Gem optagelsesfilen for hver prøve, og gem tabellen over gennemsnitlig hjertefunktion til statistisk analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+of+heart+transplantation.">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li><li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+&amp;#34;high-risk&amp;#34;+donor+hearts:+Implications+for+infection.">Transplantation of &amp;#34;high-risk&amp;#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li><li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+the+market+for+heart+transplantation.">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679 (2016).</li><li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria.">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li><li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation.">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li><li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation:+a+thorn+amongst+the+roses.">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li><li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury:+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release.">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li><li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion.">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997 (2021).</li><li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated,+Langendorff-perfused+mouse+hearts.">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li><li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation.">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li><li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation.">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004 (2021).</li><li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation.">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology &amp; Biomaterials. 1 (101), (2011).</li><li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation.">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li><li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+function+and+failure:+report+of+a+National+Heart,+Lung,+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure.">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Denne protokol beskriver retrograd perfusion Langendorff-metoden via aortakanylering. Denne teknik kan bruges til at evaluere LV og RV funktion af murine hjerter efter kold opbevaring. Resultaterne viser, at langvarig køleopbevaring af donorhjerter fører til nedsat hjertefunktion i både LV og RV ved hjælp af denne protokol. 
Studierne af akut og kronisk afstødning efter hjertetransplantation fokuserer bredt på immunbiologi14. Virkningerne af indfødte celler på PGD under kold opbevaring undersøges mindre godt. PGD forekommer i ~ 10% -20% af hjertetransplantationer og tegner sig for 66% af tidlig død inden for 30 dage efter transplantation. Især forekomsten af PGD, der påvirker LV versus RV, varierer efter transplantation11. Uden bidrag fra modtagercellulære responser fokuserer denne ex vivo-metode på indfødte hjertecellers bidrag til PGD efter kold konservering af donorhjerter. Yderligere undersøgelser kan inkorporere modtagerresponser i en murin hjertetransplantationsmodel. 
I denne protokol fokuserede Langendorff-perfusionen af koldt bevarede donorhjerter på de indfødte hjerteresponser på varm krystalloid perfusion uden at infiltrere cellulær immunitet. For at opnå reproducerbare resultater blev flere kritiske trin standardiseret. Musens hjerter blev arresteret ved hjælp af HTK-opløsning og opbevaret i iskold HTK, svarende til klinisk praksis. HTK-opløsningens perfusionsvolumen og infusionstid for hvert hjerte blev nøje overvåget med en timer. Donorhjertet blev opbevaret i forkølede rør på is indeholdende HTK i et rum med 4 °C. Kanyleringstiden blev standardiseret til ~ 3 minutter før perfusion. Alle disse trin sikrede, at varigheden af kuldekonservering var den største variabel i undersøgelsen. 
En periode med uregelmæssig hjertekontraktilitet i ~ 20 minutter blev almindeligt set i begyndelsen af perfusionen. Denne ligevægts- og restitutionsperiode blev lettet ved gradvis opvarmning og iltning af hjertevæv. En relativt stabil periode forventedes efter de første 20 min. Ballonen blev indsat i ventrikelhulen ~ 18 minutter efter den indledende ligevægtsperiode. Vi begyndte at registrere hæmodynamik, efter at hjertet var stabilt i ~ 25 minutter, når ballonen blev indsat. Perfusion med KH-buffer opretholdt stabil hjerteydelse i ~ 1,5-2 timer. Vi valgte derfor at registrere hæmodynamik i 20 min i hver af venstre og højre ventrikler.
Der er flere begrænsninger af retrograd perfusion for at studere PGD af hjerter efter kold opbevaring. For det første på grund af ballonstørrelsen og manglen på plads i hvert ventrikulært hulrum (især RV) er den samtidige indsættelse af to balloner i både LV og RV meget udfordrende. Således måler vi funktionen af RV og LV sekventielt. Det er vigtigt at bemærke, at det interventrikulære septum bidrager væsentligt til både venstre og højre ventrikulær funktion. Septumet bidrager til ~ 50% af højre ventrikulær funktion, så der er interventrikulær afhængighed15. Det er også vigtigt at bemærke, at mens procedurerne for reperfusion af murinhjertet i Langendorff-enheden tager ~ 3 minutter, tager kirurgisk implantation af det menneskelige hjerte i det relativt varme kirurgiske felt ~ 45 minutter. Til sammenligning pådrager murinhjertet i dette Langendorff-system mindre iskæmisk tid. Dette bør tages i betragtning, når klinisk oversættelse overvejes.
Da vi brugte KH-buffer til at perfusere hjertet uden blod, kan dette også have mindre effektivitet i ilttilførsel. Imidlertid er hjertefunktionen relativt stabil gennem de indledende 1,5-2 timers perfusion, hvilket muliggør pålidelige hæmodynamiske målinger. Desværre er der i øjeblikket ingen levedygtige arbejdshjerteperfusionsmodeller for disse mindre murine hjerter, og effekten af ventrikulær belastning kan ikke evalueres i dette system. På trods af dette er perfusionssystemet meget reproducerbart og mindre arbejdskrævende og tidskrævende end transplantationsmodeller. Det er også billigere end transplantationsundersøgelser, hvilket kan gøre det mere egnet til screening af forskellige terapeutiske muligheder og forskellige molekylære veje. Med ændringer af konserveringsløsninger ved at tilføje kandidatlægemidler kan denne platform bruges til at evaluere virkningerne af farmakologiske midler på reduktion af PGD i både LV og RV.

Hjertetransplantation forbedrer overlevelsen og livskvaliteten hos patienter med hjertesvigt i slutstadiet1. Desværre begrænser manglen på hjertedonorer antallet af patienter, der kunne drage fordel af denne behandling og begrænser klinikernes evne til optimalt at matche donorer med modtagere 2,3,4. Desuden har det nye tildelingssystem bidraget til længere iskæmiske tider og øget brugen af marginale donorer betydeligt siden 20185. Derfor øges gennemsnitsalderen for hjertedonorer og den iskæmiske tid over tid, hvilket fører til en højere grad af primær transplantatdysfunktion (PGD) på trods af betydelige forbedringer i strategierne for hjertebevarelse 6.
PGD kan påvirke venstre, højre eller begge ventrikler og forbliver en livstruende komplikation, der repræsenterer den førende årsag til tidlige dødsfald efter hjertetransplantation. Undersøgelse af mekanismerne i PDG og udvikling af strategier for bedre hjertebevarelse er vigtige overvejelser i betragtning af den potentielle livreddende indvirkning på hjertemodtagere. Derfor er eksperimentelle modeller, der muliggør en robust og pålidelig vurdering af donorhjertefunktionen efter en længere opbevaringstid, afgørende for at øge vores forståelse af PGD og lette udviklingen af nye terapier. Evnen til nøjagtigt at vurdere hjertefunktionen i musehjertet giver adgang til et stort repertoire af transgene murinmodeller, der nøjagtigt kan identificere PGD-mekanismer.
I fysiologiske og farmakologiske undersøgelser anvendes Langendorff retrograd perfusionsmodellen i vid udstrækning til at vurdere hjertefunktion7. Specifikt detekteres hjerteydelse af en silikoneballon forbundet til en tryktransducer i venstre ventrikulære (LV) hulrum. Et centralt træk ved PGD er utilstrækkelig sammentrækning og afslapning af ventrikelmusklen. Tidligere Langendorff-undersøgelser har fokuseret på at bruge en LV-ballon til at producere pålidelige og reproducerbare resultater i LV-funktionsvurdering 8,9,10. Imidlertid er brugen af en intracavitær ballon til vurdering af højre ventrikulær (RV) funktion ved hjælp af ballonsystemet mindre anerkendt.
I betragtning af en signifikant PGD-hastighed, der involverer RV efter transplantation11, ville eksperimentelle metoder til undersøgelse af både LV- og RV-funktion hjælpe med at bestemme de molekylære og fysiologiske mekanismer, der bidrager til RV PGD. Denne protokol viser, at intracavitære silikoneballoner kan give pålidelige vurderinger af LV- og RV-funktion i det samme murinhjerte12. For at evaluere den potentielle anvendelse af Langendorff-systemet i PGD-undersøgelsen undersøgte vi hjertefunktionerne med forskellige opbevaringsperioder og fandt nedsat hjertefunktion ved sammentrækning og afslapning ved langvarig kold opbevaring af murinhjerter. Interessant nok har LV en højere funktionel reduktion end RV. Sammenfattende kan protokollen beskrevet her bruges til at vurdere effekten af et kandidatlægemiddel og molekylære veje på både LV- og RV-funktion. Evnen til at anvende denne metode på murinhjerter vil lette udførelsen af detaljerede mekanistiske undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All purpose flour</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn Syrup</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol HTK Solution</td>
			<td>Essential Pharmaceuticals LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393/14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Henseleit buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusil silicone dispersions</td>
			<td>Avantor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion system</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130101BEZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1126</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model

Primær transplantatdysfunktion (PGD) er fortsat den hyppigste årsag til tidlig død efter hjertetransplantation. Langvarig iskæmisk tid under kuldekonservering er en vigtig risikofaktor for PGD, og pålidelig evaluering af hjertefunktionen er afgørende for at studere donorhjertets funktionelle reaktioner efter kuldekonservering. Den ledsagende video beskriver en teknik til vurdering af murin højre og venstre ventrikelfunktion ved hjælp af ex vivo perfusion baseret på en Langendorff-model efter kuldekonservering i forskellige varigheder. Kort sagt isoleres hjertet og opbevares i en kold histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK) opløsning. Derefter perfuseres hjertet med en Kreb-buffer i en Langendorff-model i 60 min. En silikoneballon indsættes i venstre og højre ventrikel, og hjertefunktionsparametre registreres (dP / dt, trykvolumenforhold). Denne protokol tillader pålidelig evaluering af hjertefunktion efter forskellige hjertebevaringsprotokoller. Det er vigtigt, at denne teknik tillader undersøgelse af hjertebevaringsresponser specifikt i indfødte hjerteceller. Brugen af meget små murinhjerter giver adgang til et enormt udvalg af transgene mus for at undersøge mekanismerne i PGD.

Voksne C57Bl/6 musehjerter, 3 måneder gamle, blev høstet og monteret på Langendorff systemet. Donorhjertet blev opbevaret i HTK i 0 og 8 timer og derefter perfuseret med iltet KH-buffer. En silikoneballon, der forbinder til en tryktransducer, blev brugt til at måle sammentrækning og afslapning af LV- og RV-funktionen.
Aortatrykket blev opretholdt i området 70-80 mmHg. Hjertefrekvensen var sammenlignelig i musehjerter med 0 og 8 timers opbevaring. LV- og RV-funktionen blev undersøgt ved måling af systolisk og diastolisk tryk. dP / dt, et derivat til beregning af forholdet mellem trykændring, blev beregnet til at bestemme trykdynamikken. Det absolutte antal max dP/dt og min dP/dt kunne repræsentere niveauet af muskelsammentrækning og afslapning. Ved 0 timers opbevaring havde LV højere systolisk tryk sammenlignet med RV (figur 2C og figur 3A). LV viste mere muskelsammentrækning og afslapning end RV efter perfusion af 0 timers opbevaring (figur 2C og figur 3B, C). Efter 8 timers køleopbevaring viste både LV og RV imidlertid en signifikant funktionel reduktion sammenlignet med en 0 timers baseline (figur 2A-D og figur 3B,C). Faldet i hjertekontraktion var mere alvorligt i LV. Efter 8 timers opbevaring var sammentrækningen og lempelsen af LV 25,1 % og 30,7 % af 0 timers baseline, mens RV havde 32,5 % og 29,1 % af funktionen sammenlignet med 0 timers baseline (figur 3B, C). Disse resultater viste, at PGD af LV efter langvarig opbevaring havde en mere signifikant hjertekontraktionsreduktion end RV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> Figur 1: Montering og kanylering af musehjertet . (A) Samlet opsætning af perfusionsopsætningen. 1. Perfusionsreservoir. 2. Iltningskammer. 3. Luftfældekammer. 4. Hjertekammer. 5. Værdiafbryder til konstant flow og tryk. 6 og 7. Tilstrømning af ilt. (B) Kanylerede hjerter med autocamperen foran. (C) RV'ens placering til at skære for at åbne hulrummet. (D) Bank på ballonrøret med kanylen. Forkortelse: RV = højre ventrikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> Figur 2: Sammenligning af funktionen af LV versus RV. (A) Sporingsregistrering af max og min dP/dt i RV og LV i donorhjertet med 0 timers lagring. (B) Registrering af max og min dP/dt i RV og LV i donorhjertet med 8 timers opbevaring. (C,D) Detaljer om dP / dt, LV-tryk, puls og perfusionstryk i LV og RV ved 0 timer og 8 timer. Forkortelser: RV = højre ventrikel; LV = venstre ventrikel; dP/dt = tryk-tid forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> Figur 3: Sammenligning af funktionen af LV versus RV efter opbevaring og perfusion. (A) Systolisk og diastolisk tryk af LV og RV efter 0 timer og 8 timers opbevaring. (B) Max dP/dt og (C) Min dP/dt af LV og RV efter perfusion med 0 timer og 8 timers lagring. Dette tal er fra Lei et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Præsenteret her er en protokol til pålideligt at kvantificere højre og venstre ventrikulær funktion af donorhjerter efter kold konservering ved hjælp af et ex vivo perfusionssystem.

Vurdering af ex vivo murin biventrikulær funktion i en Langendorff-model

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Med den beskrevne protokol kan vi sammenligne donorhjertets venstre ventrikel og ventrikelfunktion efter konservering, og vi kan undersøge forskellen i konserveringsbiologi i begge ventrikler under disse konserveringsprocesser. Denne teknik bruger ex vivo perfusionssystem til at undersøge hjertefunktionerne efter konservering. Det giver et robust og pålideligt værktøj til at screene nye behandlinger for at forbedre donorens hjertefunktioner efter konservering.Begynd med tilberedningen af dejen som beskrevet i teksten, og form et lille stykke dej til en oval form for at opnå hovedet. Fastgør det til enden af en tør spaghettistreng. Dyp hovedet i den allerede tilberedte sukkeropløsning og fjern det langsomt, når det er godt belagt med en tynd film af opløsningen.Suspender derefter spaghettistrengen på en polystyrenskumblok eller andre holdere for at tillade dannelse af et jævnt og blankt dæksel over hovedet og tør det natten over. Den næste dag dyppes formen i silikoneelastomer dispergeret i xylen og placeres spaghettistrengen tilbage i polystyrenskumblokken ved 37 grader Celsius i to timer eller indtil den er tør. Gentag dette trin endnu en gang.Placer derefter formen i vandet for at adskille og samle ballonen. Opbevar ballonen i 0,02% natriumazid. Skær nu en to stump endespids fra en 22-gauge nål og monter den ene stumpe ende på silikoneballonen, mens den anden stumpe ende på en PE-slange.Brug en 4-0 silkesutur til at binde ballonen på plads på nålen. Tag C57Black/6-musen og injicer intraperitonealt 200 enheder heparin i dyrets underliv til antikoagulation. Efter at have bekræftet korrekt anæstesi med en tåklemme, lav et snit lige under brystbenet.Og brug en saks til at åbne brystet ved at skære membranen i ribbenene. Fold derefter den forreste brystvæg for at eksponere brystet helt, før du laver et snit ved den nedadgående aorta tæt på aortabuen. Overfør nu musens hjerte, lunger og thymus til iskold histidin-tryptophan-ketoglutarat eller HTK-buffer for at isolere organerne.Udsæt aorta ved at fjerne bindevæv. Tilslut enden af aorta til en 22-gauge nål og bind den med en 6-0 silkesutur. Sørg for, at kanylen er over aortaroten for ikke at forstyrre aortaklappen.Perfus aorta i cirka 10 minutter med 10 ml HTK-buffer, forkølet til fire grader Celsius. Afhængigt af typen af eksperiment skal du enten opbevare hjertet i et 50 ml rør med iskold HTK i otte timer eller straks udføre overfloden. For at udføre overflod skal du forbinde det nålemonterede hjerte til kanylen i Langendorff-apparatet og binde det med en silkesutur.Start overfloden i en konstant strømningstilstand ved tre ml i minuttet, og juster derefter perfusionshastigheden til ca. seks ml pr. Minut efter skift til en konstant tryktilstand ved 70 til 80 millimeter kviksølv. Tilslut derefter en tømt vandfyldt silikoneballon til en tryktransducer og en vandfyldt sprøjte ved hjælp af en trevejshane. Efter 15 til 20 minutter af en ligevægtsperiode efter den foregående perfusion skal du skære højre atrium eller RA og indsætte ballonen i højre ventrikel eller RV gennem RA. Brug tape til at holde ballonen inde i RV og minimere det åbne område af RA for at hjælpe med at begrænse ballonen i ventriklen.Efter 20 minutters funktionel dataindsamling til RV skal du skære venstre atrium eller LA og indsætte en deflateret vandfyldt ballon i venstre ventrikel eller LV gennem LA. Brug tape til at holde ballonen inde i LV.To kalibrer tryktransduceren, fyld først en 10 ml sprøjte med varmt saltvand og tilslut sprøjten til kuplen gennem et trevejstryk. Åbn hanen, og fyld langsomt kuplen med saltvand, før du lukker alle vandhaner og fjerner sprøjten. Fastgør derefter den fyldte kuppel til transduceren ved at forbinde manometeret til den tredje ende af trevejshanet.I optagesoftwaren skal du vælge indstillingen Bridge Amp fra rullemenuen for den kanal, der opretter forbindelse til transduceren. Klik på 0, før du starter optagelsen, for at indstille transduceraflæsningen til nul millimeter kviksølv. Efter flere sekunders optagelse skubbes sprøjten langsomt og øges trykket til 100.Klik på Stop for at afslutte optagelsen. I dialogboksen Omregning af enheder skal du vælge optagelsesområdet for nul millimeter kviksølv og klikke på pilen til 1, før du skriver nul millimeter kviksølv. På samme måde skal du vælge optagelsesområdet for 100 millimeter kviksølv.Klik på pilen til 2 og skriv 100 millimeter kviksølv. Klik nu på OK for at kalibrere transduceren. Når kalibreringen er udført, skal du omdøbe kanalen svarende til tryktransduceren med ballonen som ventrikeltryk eller LV-tryk og begynde at registrere, når hjertet er tilsluttet systemet.Efter indsættelse af ballonen i ventriklen skal du justere vandmængden i ballonen ved hjælp af en mikrometersprøjte gennem trevejshanen for at opretholde det diastoliske sluttryk ved fem til 10 millimeter kviksølv. Omdøb derefter en tom kanal til dP / dt og hold den afledte kildekanal som ventrikeltryk. Denne kanal registrerer forholdet mellem trykændring i ventrikulært hulrum under sammentrækning.Vælg den stabile måleperiode, før du går til indstilling i blodtryksmodulet. Vælg derefter LV-trykket som indgangskanal, og klik på markeringen, før du trykker på OK. Klik nu på Klassificeringsvisning for at fjerne enhver afvigende hjertecyklus og Tabelvisning for at generere tabellerne for gennemsnittet af maksimal dP/dt og minimum dP/dt for den valgte periode. Når musehjertet blev opbevaret i HTK-buffer i nul timer før perfusion, blev der registreret højere systolisk tryk for LV sammenlignet med RV. Derudover viste LV sammenlignet med RV også betydeligt mere muskelsammentrækning samt afslapning.Men når perfusion blev udført på hjertet efter at have udsat det for otte timers køleopbevaring, viste både LV og RV en signifikant funktionel reduktion sammenlignet med nul-timers stadiet. Faldene blev observeret at være mere alvorlige i LV sammenlignet med RV. Sammentrækningen og lempelsen af LV efter otte timers lagring var 25,1% og 30,7% af funktionen svarende til nul-timers opbevaring, mens RV viste 32,5% og 29,1% af funktionen sammenlignet med nul-timers basislinjen. Angivelse af primær transplantatdysfunktion af LV efter langvarig opbevaring var mere signifikant end RV. Konserveringskvaliteten afhænger i høj grad af udbredelsen af HTK.Det er vigtigt at sikre, at perfusionen er konsistent til præcis sammenligning af forskellige behandlinger. Med præcis måling af en donorhjertefunktion af konservering kan denne metode let tilpasses til screening af lægemidler, der kan forbedre donorens hjertefunktion og derefter yderligere validere ved hjælp af en heterotopisk transplantationsmodel.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

En human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aterosklerotisk plaque Model til Studieinformationen Læsionssynligheden Biologi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion og vurdering af iskæmi-reperfusion skade i Langendorff-perfusionerede rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Vurdering af Plasma koagulation på leveren væv i en stor dyremodel In Vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En lille dyremodel af Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Virkningen af Intracardiac neuroner på hjerte Elektrofysiologi og Arrhythmogenesis i en Ex Vivo Langendorff System

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

Normothermic Ex Situ hjerte Perfusion i arbejde Mode: vurdering af hjertets funktion og stofskifte

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Non-invasiv vurdering af Dorsiflexor muskelfunktion i mus

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

En edb funktionel skills assessment og uddannelse Program Målretning Teknologi Baseret Everyday funktionelle færdigheder

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiografi og Elektrofysiologi studier af ex vivo Langendorff-perfbrugte hjerter

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Lever skiver som en Ex Vivo Model af leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...