Name: assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

이 프로토콜의 모든 동물 실험은 앤아버에 있는 미시간 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 마우스는 병원체가 없는 방에서 12:12 광 주기로 수용되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 동물 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 실리콘 풍선 카테터 제작
알림: 실리콘 풍선은 앞에서 설명한 대로 만들어집니다13.
<ol><li>100mL 비커에 증류수 9.5mL, 경질 옥수수 시럽 14.2mL, 자당 33.8g을 넣습니다. 설탕이 완전히 녹을 때까지 용액을 가열하고 저어줍니다.</li>
	<li>밀가루 10g과 물 5g을 섞어 균일한 농도가 될 때까지 반죽을 준비하고 10분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>작은 반죽 조각을 타원형의 "머리"로 만들고 마른 스파게티 가닥 끝에 붙입니다. 그런 다음 이 머리를 설탕 용액에 담그고 헤드가 완전히 코팅되었으므로 용액에서 천천히 제거합니다. 알림: 반죽은 매끄럽고 질감이 균일해야 합니다. 반죽의 크기는 5mm(짧은 직경)에서 7mm(긴 직경)까지 다양한 크기의 풍선을 생성하기 위해 다양할 수 있습니다. 설탕 용액의 얇은 막으로 덮으십시오.</li>
	<li>스파게티 가닥을 폴리스티렌 폼 블록 또는 기타 홀더에 매달아 머리 위에 고르게 광택 덮개를 형성하고 밤새 건조시킵니다.</li>
	<li>금형을 실리콘 분산액(자일렌에 분산된 실리콘 엘라스토머)에 담그십시오. 스파게티 가닥을 37°C의 폴리스티렌 폼 블록에 2시간 동안 또는 마를 때까지 다시 넣습니다. 이 단계를 한 번 반복합니다. 알림: 실리콘 분산 젤이 공기 노출로 인해 산화되는 것을 방지하는 것이 중요합니다., 고르지 않은 풍선 두께를 생성하기 때문에.</li>
	<li>몰드를 물에 넣어 풍선을 분리하고 모으십시오. 풍선을 0.02% 아지드화나트륨에 보관하십시오.</li>
	<li>22G 바늘에서 두 개의 뭉툭한 끝 끝을 자릅니다. 한쪽 뭉툭한 끝을 실리콘 풍선에 장착하고 다른 쪽 뭉툭한 끝을 PE 튜브에 장착합니다. 4-0 실크를 사용하여 풍선을 바늘에 묶습니다. 알림: 풍선에 물을 주입하여 풍선 무결성을 테스트합니다. 풍선이 채워지면 풍선을 부드럽게 눌러 풍선이 내부의 장력을 유지하는지 테스트합니다. 풍선이 새는 경우 새 풍선을 사용하십시오. 장착된 풍선은 나중에 사용할 수 있도록 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 심장 관류 시스템의 준비
<ol><li>1L의 Krebs-Henseleit(KH) 관류 완충액을 만들어 저수지 Langendorff 시스템으로 옮깁니다.</li>
	<li>공기 튜브를 물통에 연결하고 공기 흐름을 켜서 KH 버퍼를 5% CO 2 및 95% O2와 최소 30분 동안 균형을 맞춥니다.</li>
	<li>수조를 41.5°C로 설정하고 Langendorff 시스템의 외부 층에서 물을 순환시켜 시스템과 KH 버퍼를 예열합니다. 알림: 수조 온도는 각 시스템에 대한 최적화가 필요합니다. 이 시스템의 경우 수조 온도는 심장에 관류할 때 KH를 37-37.5°C로 유지합니다.</li>
</ol>3. 쥐 심장의 분리, 장착 및 캐뉼레이션
<ol><li>항응고를 위해 C57/B6 마우스 복부의 오른쪽 사분면에 복강내(ip) 주사로 식염수에 헤파린 200단위를 투여합니다. 주사 전에 주사기를 흡인하여 바늘의 경사가 위장관의 방광이나 내강에 있지 않은지 확인합니다. 각 실험 조건에서 최소 4마리의 마우스를 사용합니다(그러나 치료 효과의 크기도 고려).<ol><li>30분 후 80mg/kg의 케타민과 10mg/kg의 자일라진 i.p.를 투여하여 마우스를 마취시킵니다. 마취된 쥐가 발가락 꼬집기를 수행하고 반응이 관찰되지 않는지 확인하여 의식이 없는지 확인합니다. Acepromazine 2mg/kg은 사용된 마우스 균주가 ket/xyl만으로 적절한 수준의 마취에 도달하지 못하는 경우 ket/xyl 칵테일에 첨가할 수 있습니다.</li>
		<li>흉골 바로 아래를 절개합니다. 가위를 사용하여 횡격막과 갈비뼈를 잘라 가슴을 엽니다. 앞쪽 흉벽을 접어 가슴을 완전히 노출시킵니다. 하행 대동맥(대동맥 아치에 닫힘)에서 절단합니다. 쥐의 심장, 폐 및 흉선을 차가운 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트(HTK) 완충액으로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 HTK 완충액으로 장기를 분리합니다. 결합 조직을 제거하여 대동맥을 노출시킵니다. 알림: 바늘에 연결할 수 있는 충분한 공간을 확보하기 위해 절제에 상행 대동맥과 대동맥궁 영역을 모두 포함하여 대동맥 길이를 최대화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>대동맥 끝을 22G 바늘에 연결하고 6-0 실크 봉합사로 묶습니다. 캐뉼라가 대동맥 판막을 방해하지 않도록 대동맥 뿌리 위에 있는지 확인하십시오. 약 10분에 걸쳐 10mL의 냉(4°C) HTK 완충액을 대동맥에 관류합니다. 참고: 심장 제거에서 대동맥 캐뉼레이션까지 15분도 채 걸리지 않습니다. 그러나 관류 속도를 적절한 수준으로 유지하는 것이 중요합니다. 너무 빠르고 격렬한 주사는 고압을 발생시켜 혈관/심장 손상을 유발할 수 있습니다.</li>
	<li>심장을 얼음처럼 차가운 HTK가 있는 50mL 튜브에 8시간 동안 보관하거나 즉시 관류를 수행하고(대조군을 보관하지 않음) 얼음과의 직접적인 접촉을 피하십시오. 알림: 심장 조직이 얼음에 직접 닿으면 추위를 입을 수 있습니다.</li>
	<li>바늘에 장착된 심장을 Langendorff 장치의 캐뉼라에 연결하고 실크 봉합사로 묶습니다. 알림: 절차를 표준화하려면 관류 전에 캐뉼레이션 과정을 총 3분 동안 기다리십시오.</li>
	<li>3mL/min의 일정한 흐름 모드로 관류를 시작합니다. 그런 다음 70-80mmHg에서 정압 모드로 변경하고 심장을 ~6mL/분으로 조정합니다. 알림: 심장을 부드럽게 촉진하면 심장 재생을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 정압 모드에서 관류 유속이 6mL/분보다 훨씬 높으면 캐뉼레이션에 누출이 있거나 대동맥 판막이 제대로 작동하지 않을 수 있습니다. 누출을 해결하기 위해 연결을 조정하십시오. 일정한 흐름 모드는 심장의 혈관 긴장도 자체 조절을 무시합니다. 일정한 압력 모드를 사용하면 심장이 관상 동맥 관류 흐름을 조절할 수 있습니다. 따라서 정압 모드는 심장 기능과 심장의 보존 품질을 정확하게 측정합니다.</li>
	<li>공기가 빠진 물이 채워진 풍선을 압력 변환기와 물이 채워진 주사기에 3방향 탭으로 연결합니다. 15-20분의 평형 기간 후 오른쪽 아트리움(RA)을 자르고 RA를 통해 풍선을 RV에 삽입합니다. 테이프를 사용하여 RV 내부의 풍선을 고정합니다. RA의 열린 영역을 최소화하여 심실의 풍선을 제한합니다(설정은 그림 1 참조). 알림: 심장 수축과 이완이 처음에는 안정적이지 않고 측정의 정확성과 대표성이 떨어지기 때문에 평형 기간이 필요합니다. RA가 열리는 동안 AV 노드가 손상되면 심장에 빈번한 부정맥이 나타납니다.</li>
	<li>20분 동안 RV 기능 데이터를 수집한 후 왼쪽 아트리움(LA)을 자르고 공기를 뺀 물이 채워진 풍선을 LA를 통해 LV에 삽입합니다. 테이프를 사용하여 풍선을 LV 내부에 고정합니다. 알림: 심장은 1.5시간 이상 안정적인 혈류역학을 유지해야 합니다.</li>
</ol>4. 기능적 데이터 기록
<ol><li>압력 트랜스듀서의 교정<ol><li>10mL 주사기에 따뜻한 식염수를 채우고 3방향 탭을 통해 주사기를 돔에 연결합니다. 수도꼭지를 열고 돔에 식염수를 천천히 채운 다음 모든 수도꼭지를 닫고 주사기를 제거합니다. 채워진 돔을 변환기에 부착합니다. 압력계를 3방향 탭의 세 번째 끝에 연결합니다.</li>
		<li>녹음 소프트웨어에서 Bridge Amp 변환기에 연결하는 채널의 드롭다운 메뉴에서. 채널 의 이름을 관류 압력으로 바꿉니다. 0(Zero )을 클릭하여 변환기를 0으로 설정합니다.</li>
		<li>변환기가 이제 0mmHg를 읽도록 시작을 클릭하여 기록을 시작합니다. 몇 초 동안 기록한 후 주사기를 천천히 누르고 압력을 100으로 높입니다. 녹음을 중지하려면 중지를 클릭합니다.</li>
		<li>단위 변환 대화 상자에서 0mmHg에 대한 기록 영역을 선택하고 화살표를 클릭하여 포인트 1을 클릭하고 0mmHg를 입력합니다. 100mmHg의 기록 영역을 선택하고 화살표를 클릭하여 포인트 2를 입력한 다음 100mmHg를 입력합니다. OK(확인)를 클릭하여 변환기를 보정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>풍선이 있는 압력 변환기에 해당하는 채널의 이름을 Ventricle pressure로 바꿉니다. 심장이 시스템에 연결되면 녹음을 시작합니다. 풍선을 심실에 삽입한 후 마이크로미터 주사기를 사용하여 3방향 탭을 통해 풍선의 물의 양을 조절하여 이완기 말압 을 5-10mmHg로 유지합니다. 알림: 이완기 말기 측정은 측정 중에 감소할 수 있으며, 가급적이면 10mmHg에 가까운 곳에서 시작하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>빈 채널의 이름을 dP/dt로 바꿉니다. 드롭다운 메뉴에서 Derivative | source channel을 Ventricle Pressure로 선택합니다. 채널은 수축 기간 동안 심실강의 압력 변화 비율을 기록합니다.</li>
	<li>안정적인 측정 기간을 선택한 다음 혈압 모듈에서 설정을 클릭합니다.<ol><li>심실 압력을 입력 채널로 선택하고 계산 기간 동안 선택을 클릭합니다. 확인.</li>
		<li>분류기 보기를 클릭하여 이상치 심장 주기(예: 비정상적인 주기 시간 또는 압력)를 제거합니다.</li>
		<li>테이블 뷰를 클릭하여 선택한 기간의 최대 dP/dt(수축) 및 최소 dP/dt(완화)의 평균 테이블을 생성합니다. 알림: 기록 저장 file 각 s에 대한 samp통계 분석을 위해 평균 심장 기능 표를 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+of+heart+transplantation.">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li><li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+&amp;#34;high-risk&amp;#34;+donor+hearts:+Implications+for+infection.">Transplantation of &amp;#34;high-risk&amp;#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li><li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+the+market+for+heart+transplantation.">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679 (2016).</li><li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria.">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li><li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation.">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li><li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation:+a+thorn+amongst+the+roses.">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury:+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release.">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li><li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion.">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997 (2021).</li><li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated,+Langendorff-perfused+mouse+hearts.">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li><li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation.">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li><li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation.">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004 (2021).</li><li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation.">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology &amp; Biomaterials. 1 (101), (2011).</li><li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation.">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li><li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+function+and+failure:+report+of+a+National+Heart,+Lung,+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure.">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 대동맥 캐뉼레이션을 통한 역행성 관류 Langendorff 방법을 설명합니다. 이 기술은 냉장 보관 후 쥐 심장의 LV 및 RV 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 그 결과, 기증자의 심장을 장기간 냉장 보관하면 이 프로토콜을 사용하여 좌심실과 RV 모두에서 심장 기능이 저하되는 것으로 나타났습니다. 
심장 이식 후 급성 및 만성 거부 반응에 대한 연구는 면역생물학에 초점을 맞추고 있다14. 콜드 스토리지 동안 PGD에 대한 네이티브 셀의 영향은 잘 조사되지 않았습니다. PGD는 심장 이식의 ~10%-20%에서 발생하며 이식 후 30일 이내 조기 사망의 66%를 차지합니다. 특히, 이식 후 LV와 RV에 영향을 미치는 PGD의 발생률은 차이가 있다11. 수혜자 세포 반응의 기여가 없는 이 체외 방법은 기증자 심장의 냉간 보존 후 PGD에 대한 자연 심장 세포의 기여에 중점을 둡니다. 추가 연구에서는 쥐 심장 이식 모델에서 수혜자 반응을 통합할 수 있습니다. 
이 프로토콜에서 차갑게 보존된 기증자 심장의 Langendorff 관류는 세포 면역을 침윤하지 않고 따뜻한 결정체 관류에 대한 기본 심장 반응에 초점을 맞췄습니다. 재현 가능한 결과를 얻기 위해 몇 가지 중요한 단계가 표준화되었습니다. 쥐의 심장은 HTK 용액을 사용하여 체포하고 임상 실습과 유사하게 얼음처럼 차가운 HTK에 보관했습니다. 모든 심장에 대한 HTK 용액의 관류량과 주입 시간은 타이머로 면밀히 모니터링되었습니다. 기증자의 심장은 4°C 방에서 HTK가 함유된 얼음 위의 사전 냉각된 튜브에 보관되었습니다. 캐뉼레이션 시간은 관류 전 ~3분으로 표준화되었습니다. 이 모든 단계는 저온 보존 기간이 연구의 주요 변수임을 확인했습니다. 
~20분 동안 불규칙한 심장 수축 기간은 일반적으로 관류 초기에 관찰되었습니다. 이러한 평형 및 회복 기간은 심장 조직의 점진적인 온난화와 산소화에 의해 촉진되었습니다. 초기 20분 이후에는 비교적 안정적인 시간이 예상되었습니다. 풍선은 초기 평형 기간 후 ~18분에 심실강에 삽입되었습니다. 우리는 풍선을 삽입한 후 심장이 ~25분 동안 안정된 후 혈류역학을 기록하기 시작했습니다. KH 완충액을 사용한 관류는 ~1.5-2시간 동안 안정적인 심장 성능을 유지했습니다. 따라서 우리는 좌심실과 우심실에서 각각 20분 동안 혈류역학을 기록하기로 결정했습니다.
냉장 보관 후 심장의 PGD를 연구하기 위한 역행성 관류에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 풍선 크기와 각 심실강(특히 RV)의 공간 부족으로 인해 LV와 RV에 두 개의 풍선을 동시에 삽입하는 것은 매우 어렵습니다. 따라서 RV와 LV의 기능을 순차적으로 측정합니다. 심실 중격은 좌심실과 우심실 기능에 크게 기여한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 중격은 우심실 기능의 ~50%에 기여하므로 심실 간 의존성이 있다15. Langendorff 장치에서 쥐 심장의 재관류 절차는 ~3분이 소요되는 반면, 상대적으로 따뜻한 수술 부위에 인간 심장을 외과적으로 이식하는 데는 ~45분이 소요된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이에 비해 이 랑겐도르프 시스템의 쥐 심장은 허혈성 시간이 적습니다. 임상 번역을 고려할 때 이 점을 고려해야 합니다.
혈액 없이 심장을 관류하기 위해 KH 완충액을 사용했기 때문에 산소 전달의 효율성이 떨어질 수도 있습니다. 그러나 심장 기능은 초기 1.5-2시간의 관류를 통해 비교적 안정적이므로 신뢰할 수 있는 혈류역학적 측정이 가능합니다. 불행히도, 현재 이러한 작은 쥐 심장에 대한 실행 가능한 작동 심장 관류 모델은 없으며 이 시스템에서는 심실 부하의 영향을 평가할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 관류 시스템은 이식 모델보다 재현성이 높고 노동 집약적이며 시간이 덜 걸립니다. 또한 이식 연구보다 비용이 적게 들기 때문에 다양한 치료 옵션과 다양한 분자 경로를 선별하는 데 더 적합할 수 있습니다. 후보 약물을 추가하여 보존 용액을 수정하면 이 플랫폼을 사용하여 LV 및 RV 모두에서 PGD 감소에 대한 약리학적 제제의 효과를 평가할 수 있습니다.

심장 이식은 말기 심부전 환자의 생존율과 삶의 질을 향상시킨다1. 안타깝게도 심장 기증자의 부족은 이 치료법의 혜택을 받을 수 있는 환자의 수를 제한하고 임상의가 기증자와 수혜자를 최적으로 매칭할 수 있는 능력을 제한한다 2,3,4. 또한, 새로운 할당 시스템은 허혈 시간을 늘리는 데 기여했으며 2018년 이후 한계 기증자의 사용을 크게 증가시켰다5. 결과적으로, 심장 기증자의 평균 연령과 허혈 시간은 시간이 지남에 따라 증가하여 심장 보존 전략이 크게 개선되었음에도 불구하고 원발성 이식편 기능 장애(PGD)의 비율이 더 높다 6.
PGD는 좌심실, 우심실 또는 양쪽 심실에 영향을 미칠 수 있으며, 심장 이식 후 조기 사망의 주요 원인으로 생명을 위협하는 합병증으로 남아 있습니다. PDG의 메커니즘을 조사하고 더 나은 심장 보존을 위한 전략을 개발하는 것은 심장 이식자의 생명을 구하는 잠재적인 영향을 고려할 때 중요한 고려 사항입니다. 따라서 장기간 보관 후 기증자의 심장 기능을 강력하고 신뢰할 수 있게 평가할 수 있는 실험 모델은 PGD에 대한 이해를 높이고 새로운 치료법 개발을 촉진하는 데 필수적입니다. 쥐 심장의 심장 기능을 정확하게 평가할 수 있는 능력은 PGD 메커니즘을 정확하게 식별할 수 있는 형질전환 쥐 모델의 방대한 레퍼토리에 접근할 수 있게 해줍니다.
생리학 및 약리학적 연구에서 랑겐도르프 역행성 관류 모델은 심장 기능을 평가하는 데 널리 사용된다7. 특히, 심장 기능은 좌심실(LV) 강 내의 압력 변환기에 연결된 실리콘 풍선에 의해 감지됩니다. PGD의 주요 특징은 심실 근육의 부적절한 수축과 이완입니다. 이전의 Langendorff 연구는 LV 기능 평가 8,9,10에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 생성하기 위해 LV 풍선을 사용하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 풍선 시스템을 사용하여 우심실(RV) 기능을 평가하기 위해 강내 풍선을 사용하는 것은 잘 알려져 있지 않습니다.
이식 후 RV와 관련된 상당한 PGD 비율을 감안할 때11, LV 및 RV 기능을 모두 연구하는 실험 방법은 RV PGD에 기여하는 분자 및 생리학적 메커니즘을 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 공동내 실리콘 풍선이 동일한 쥐 심장(12)에서 LV 및 RV 기능에 대한 신뢰할 수 있는 평가를 제공할 수 있음을 보여준다. PGD 연구에서 Langendorff 시스템의 잠재적 사용을 평가하기 위해 보관 기간이 다른 심장 기능을 조사한 결과 쥐 심장을 장기간 냉장 보관하면 수축 및 이완에서 심장 기능이 감소하는 것을 발견했습니다. 흥미롭게도 LV는 RV보다 기능적 감소가 더 높습니다. 요약하면, 여기에 설명된 프로토콜은 LV 및 RV 기능 모두에 대한 후보 약물 및 분자 경로의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 쥐 심장에 이 방법을 사용할 수 있는 능력은 상세한 기계론적 연구의 수행을 용이하게 할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All purpose flour</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn Syrup</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol HTK Solution</td>
			<td>Essential Pharmaceuticals LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393/14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Henseleit buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusil silicone dispersions</td>
			<td>Avantor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion system</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130101BEZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1126</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model

원발성 이식편 기능 장애(PGD)는 심장 이식 후 조기 사망의 주요 원인으로 남아 있습니다. 냉간 보존 중 허혈 시간이 길어지는 것은 PGD의 중요한 위험 요소이며, 냉간 보존 후 기증자 심장의 기능적 반응을 연구하기 위해서는 심장 기능에 대한 신뢰할 수 있는 평가가 필수적입니다. 첨부된 비디오는 다양한 기간 동안 저온 보존 후 Langendorff 모델을 기반으로 하는 생체 외 관류를 사용하여 쥐의 우심실 및 좌심실 기능을 평가하는 기술을 설명합니다. 간단히 말해서, 심장은 분리되어 차가운 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트(HTK) 용액에 저장됩니다. 그런 다음 심장은 Langendorff 모델에서 60분 동안 Kreb 완충액으로 관류됩니다. 좌심실과 우심실에 실리콘 풍선을 삽입하고 심장 기능 매개변수(dP/dt, 압력-부피 관계)를 기록합니다. 이 프로토콜을 사용하면 다양한 심장 보존 프로토콜 후에 심장 기능을 안정적으로 평가할 수 있습니다. 중요한 것은 이 기술을 통해 특히 천연 심장 세포에서 심장 보존 반응을 연구할 수 있다는 것입니다. 매우 작은 쥐 심장을 사용하면 PGD의 메커니즘을 조사하기 위해 엄청난 양의 형질전환 마우스에 접근할 수 있습니다.

생후 3개월의 성체 C57Bl/6 마우스 심장을 채취하여 Langendorff 시스템에 장착했습니다. 기증자 심장을 HTK에 0시간 및 8시간 동안 보관한 후 산소가 공급된 KH 완충액으로 관류했습니다. 압력 변환기에 연결된 실리콘 풍선을 사용하여 LV 및 RV 기능의 수축 및 이완을 측정했습니다.
대동맥압은 70-80mmHg 범위로 유지되었다. 심박수는 0시간 및 8시간 보관이 있는 쥐 심장에서 비슷했습니다. LV 및 RV 기능은 수축기 및 이완기 혈압을 측정하여 검사했습니다. 압력 변화의 비율을 계산하기 위한 도함수인 dP/dt를 계산하여 압력 역학을 결정했습니다. 최대 dP/dt 및 최소 dP/dt의 절대 수치는 근육 수축 및 이완 수준을 나타낼 수 있습니다. 보관 시간 0시간에서 LV는 RV에 비해 수축기 혈압이 더 높았습니다(그림 2C 및 그림 3A). LV는 0시간 보관 관류 후 RV보다 더 많은 근육 수축 및 이완을 보여주었습니다(그림 2C 및 그림 3B,C). 그러나 8시간의 냉장 보관 후 LV와 RV 모두 0시간 기준선에 비해 상당한 기능적 감소를 보였습니다(그림 2A-D 및 그림 3B,C). 심장 수축의 감소는 LV에서 더 심각했습니다. 8시간 보관 후 LV의 수축 및 이완은 0시간 기준선의 25.1% 및 30.7%인 반면 RV는 0시간 기준선에 비해 32.5% 및 29.1%의 기능을 보였습니다(그림 3B, C). 이러한 결과는 장기간 보관 후 LV의 PGD가 RV보다 더 유의한 심장 수축 감소를 보였다는 것을 보여주었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> 그림 1: 마우스 심장의 장착 및 캐뉼레이션 . (A) 관류 설정의 전체 설정. 1. 관류 저장소. 2. 산소 챔버. 3. 에어 트랩 챔버. 4. 심장 챔버. 5. 일정한 교류 및 압력을 위한 가치 스위치. 6 및 7. 산소 유입. (B) RV가 앞쪽에 있는 캐뉼라 하트. (C) 캐비티를 열기 위해 절단할 RV의 위치. (D) 캐뉼라로 풍선 튜브를 두드립니다. 약어: RV = 우심실. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> 그림 2: LV와 RV의 기능 비교. (A) RV의 최대 및 최소 dP/dt와 0시간의 보관이 있는 기증자 심장의 LV의 추적 기록. (B) RV의 최대 및 최소 dP/dt 및 기증자 심장의 LV와 8시간 보관 기록. (씨,디) 0시간 및 8시간에서 LV 및 RV의 dP/dt, LV 압력, 심박수 및 관류 압력에 대한 세부 정보. 약어: RV = 우심실; LV = 좌심실; dP/dt = 압력-시간 관계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> 그림 3: 보관 및 관류 후 LV와 RV의 기능 비교. (A) 0시간 및 8시간 보관 후 LV 및 RV의 수축기 및 이완기 압력. (B) 0시간 및 8시간 보관으로 관류 후 LV 및 RV의 최대 dP/dt 및 (C) 최소 dP/dt. 이 그림은 Lei et al.12에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

여기에 제시된 프로토콜은 체외 관류 시스템을 사용하여 냉간 보존 후 기증자 심장의 우심실 및 좌심실 기능을 안정적으로 정량화하기 위한 프로토콜입니다.

Langendorff 모델에서 생체 외 쥐 뇌실 기능 평가

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

설명된 프로토콜을 통해 기증자의 심장 좌심실과 보존 후 심실 기능을 비교할 수 있으며, 이러한 보존 과정에서 양쪽 심실의 보존 생물학의 차이를 조사할 수 있습니다. 이 기술은 생체 외 관류 시스템을 사용하여 보존 후 심장 기능을 검사합니다. 보존 후 기증자의 심장 기능을 개선하기 위해 새로운 치료법을 선별할 수 있는 강력하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.텍스트에 설명된 대로 반죽 준비부터 시작하여 반죽의 작은 조각을 타원형 모양으로 만들어 머리를 얻습니다. 마른 스파게티 가닥 끝에 부착하십시오. 이미 준비된 설탕 용액에 헤드를 담그고 용액의 얇은 필름으로 잘 코팅되면 천천히 제거합니다.그런 다음 스파게티 가닥을 폴리스티렌 폼 블록이나 다른 홀더에 매달아 머리 위에 균일하고 광택 있는 덮개가 형성되도록 하고 밤새 건조시킵니다. 다음날 자일렌에 분산된 실리콘 엘라스토머에 몰드를 담그고 스파게티 가닥을 섭씨 37도의 폴리스티렌 폼 블록에 2시간 동안 또는 마를 때까지 다시 넣습니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.그런 다음 틀을 물에 넣어 풍선을 분리하고 모으십시오. 풍선을 0.02% 아지드화나트륨에 보관하십시오. 이제 22게이지 바늘에서 두 개의 뭉툭한 끝 끝을 자르고 한쪽 뭉툭한 끝을 실리콘 풍선에 장착하고 다른 뭉툭한 끝을 PE 튜브에 장착합니다.4-0 실크 봉합사를 사용하여 풍선을 바늘에 묶습니다. C57Black/6 마우스를 사용하여 항응고를 위해 동물의 복부에 200단위의 헤파린을 복강내로 주입합니다. 발가락 꼬집으로 적절한 마취를 확인한 후 흉골 바로 아래를 절개합니다.그리고 가위를 사용하여 갈비뼈의 횡격막을 잘라 가슴을 엽니다. 그런 다음 전방 흉벽을 접어 흉부를 완전히 노출시킨 후 대동맥궁에 가까운 하행 대동맥을 절개합니다. 이제 쥐의 심장, 폐 및 흉선을 얼음처럼 차가운 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트 또는 HTK 완충액으로 옮겨 장기를 분리합니다.결합 조직을 제거하여 대동맥을 노출시킵니다. 대동맥 끝을 22게이지 바늘에 연결하고 6-0 실크 봉합사로 묶습니다. 대동맥 판막을 방해하지 않도록 캐뉼라가 대동맥 뿌리 위에 있는지 확인하십시오.섭씨 4도로 예냉된 10밀리리터의 HTK 완충액으로 약 10분 동안 대동맥을 관류합니다. 실험 유형에 따라 심장을 얼음처럼 차가운 HTK가 있는 50밀리리터 튜브에 8시간 동안 보관하거나 즉시 주입합니다. 풍성한 시술을 하려면 바늘에 장착된 심장을 랑겐도르프 장치의 캐뉼라에 연결하고 실크 봉합사로 묶습니다.분당 3밀리리터의 정유량 모드에서 풍량을 시작한 다음 수은 70-80밀리미터에서 정압 모드로 변경한 후 관류 속도를 분당 약 6밀리리터로 조정합니다. 그런 다음 3방향 탭을 사용하여 수축된 물이 채워진 실리콘 풍선을 압력 변환기와 물이 채워진 주사기에 연결합니다. 이전 관류 후 15-20분의 평형 기간 후에 우심방(RA)을 절단하고 RA를 통해 우심실(RV)에 풍선을 삽입합니다. 테이프를 사용하여 RV 내부의 풍선을 고정하고 RA의 열린 영역을 최소화하여 심실에서 풍선을 구속하는 데 도움이 됩니다.RV에 대한 기능 데이터 수집 20분 후 좌심방(LA)을 절단하고 공기를 뺀 물이 채워진 풍선을 LA를 통해 좌심실(LV)에 삽입합니다. 테이프를 사용하여 풍선을 LV.To 내부에 고정하고 압력 변환기를 보정하고 먼저 10밀리리터 주사기에 따뜻한 식염수를 채우고 3방향 탭을 통해 주사기를 돔에 연결합니다. 수도꼭지를 열고 돔에 식염수를 천천히 채운 후 모든 수도꼭지를 닫고 주사기를 제거합니다. 그런 다음 압력 게이지를 3방향 탭의 세 번째 끝에 연결하여 채워진 돔을 변환기에 부착합니다.녹음 소프트웨어의 변환기에 연결하는 채널의 드롭다운 메뉴에서 Bridge Amp 옵션을 선택합니다. 녹음을 시작하기 전에 0을 클릭하여 변환기 판독값을 수은 0mm로 설정합니다. 몇 초 동안 기록한 후 주사기를 천천히 누르고 압력을 100으로 높입니다.딸깍 하는 소리 중지 녹음을 종료합니다. 단위 변환 대화상자에서 0밀리미터의 수은에 대한 기록 영역을 선택하고 0밀리미터의 수은을 입력하기 전에 화살표를 1로 클릭합니다. 마찬가지로 100mm의 수은에 대한 기록 영역을 선택합니다.화살표 2를 클릭하고 100mm 수은을 입력합니다. 이제 OK(확인)를 클릭하여 변환기를 보정합니다. 보정이 완료되면 풍선이 있는 압력 변환기에 해당하는 채널의 이름을 심실 압력 또는 LV 압력으로 바꾸고 심장이 시스템에 연결되면 기록을 시작합니다.풍선을 심실에 삽입한 후 마이크로미터 주사기를 사용하여 3방향 탭을 통해 풍선의 물의 양을 조절하여 끝 이완기 압력을 5-10mm의 수은으로 유지합니다. 그런 다음 빈 채널의 이름을 dP/dt로 바꾸고 미분 소스 채널을 심실 압력으로 유지합니다. 이 채널은 수축 중 심실강의 압력 변화 비율을 기록합니다.혈압 모듈에서 설정으로 이동하기 전에 안정 측정 기간을 선택하십시오. 그런 다음 LV 압력을 입력 채널로 선택하고 확인을 누르기 전에 선택을 클릭합니다. 이제 Classifier View(분류기 보기)를 클릭하여 이상치 심장 주기를 제거하고 Table View(테이블 보기)를 클릭하여 선택한 기간의 최대 dP/dt 및 최소 dP/dt의 평균에 대한 테이블을 생성합니다. 쥐의 심장이 관류 전 0시간 동안 HTK 완충액에 보관되었을 때, RV에 비해 LV에 대해 더 높은 수축기 혈압이 기록되었습니다. 또한 RV에 비해 LV는 훨씬 더 많은 근육 수축과 이완을 보여주었습니다.그러나 심장을 8시간 동안 냉장 보관한 후 관류를 시행했을 때 LV와 RV 모두 0시간 단계에 비해 상당한 기능 감소를 보였습니다. 감소는 RV에 비해 LV에서 더 심각한 것으로 관찰되었습니다. 8시간 보관 후 LV의 수축 및 이완은 0시간 보관에 해당하는 기능의 25.1%와 30.7%였으며, RV는 0시간 기준선과 비교하여 32.5%와 29.1%의 기능을 나타냈습니다. 장기간 보관 후 LV의 원발성 이식편 기능 장애를 나타내는 것은 RV보다 더 유의했습니다. 보존 품질은 HTK의 관류에 크게 좌우됩니다.관류가 일관성이 있는지 확인하고 다른 치료를 정확하게 비교하는 것이 중요합니다. 기증자의 심장 보존 기능을 정밀하게 측정하면 기증자의 심장 기능을 개선할 수 있는 약물 스크리닝에 쉽게 적응할 수 있으며 이종 이식 모델을 사용하여 추가로 검증할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

인간의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 죽상 경화 모델 병변 생물학을 연구하는

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

연구

의학

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

플라즈마 응고는 큰 동물 모델에서 에서 Vivo에서 간 조직에의 평가

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

심장 전기 생리학 및 전 비보 Langendorff 시스템에서 Arrhythmogenesis Intracardiac 뉴런의 영향

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

작업 모드에 Situ 심장 관류 Ex normothermic: 심장 기능 및 대사 평가

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

비-침략 적 쥐에서 Dorsiflexor 근육 기능 평가

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

전산화된 기능 기술 평가 및 교육 프로그램 대상 기술 기반 일상 기능 기술

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

뮤린 정밀 절단 간 슬라이스 간 생물학의 Ex Vivo 모델로

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...