Name: assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

Alle dyreforsøk i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Michigan, Ann Arbor. Alle musene ble plassert på en 12:12 lyssyklus i patogenfrie rom. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, dyr og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Konstruksjon av silikonballongkateteret
MERK: Silikonballongen er laget som beskrevet tidligere13.
<ol><li>Tilsett 9,5 ml destillert vann, 14,2 ml lett mais sirup og 33,8 g sukrose til et 100 ml beger. Varm opp og rør løsningen til sukkeret er helt oppløst.</li>
	<li>Forbered deigen ved å blande 10 g hvetemel og 5 g vann til en jevn konsistens oppnås og la den hvile i 10 minutter.</li>
	<li>Form et lite stykke deig til en oval "hodet" - og fest den til enden av en tørr spaghettistreng. Dypp deretter dette hodet i sukkeroppløsningen og fjern sakte fra løsningen, da hodet nå er helt belagt. NOTAT: Deigen skal være glatt og ha jevn tekstur. Størrelsene på deigen kan varieres for å generere forskjellige størrelser av ballonger, fra 5 mm (kort diameter) til 7 mm (lang diameter). Prøv å dekke dem med en tynn film av sukkeroppløsning.</li>
	<li>Heng spaghettistrengen på en isoporskumblokk eller andre holdere for å danne et blankt deksel jevnt over hodet og tørk over natten.</li>
	<li>Dypp formen i silikondispersjon (silikonelastomer dispergert i xylen). Legg spaghettitråden tilbake i isoporskumblokken ved 37 °C i 2 timer eller til den er tørr. Gjenta dette trinnet én gang. MERK: Det er viktig å forhindre at silikondispersjonsgelen oksiderer på grunn av lufteksponering, da dette vil generere en ujevn ballongtykkelse.</li>
	<li>Plasser formen i vannet for å skille og samle ballongen. Oppbevar ballongen i 0,02% natriumazid.</li>
	<li>Skjær en to-stump spiss fra en 22 G nål; monter en stump ende på silikonballongen og en annen stump ende på PE-slangen. Bruk 4-0 silke for å binde ballongen på plass på nålen. MERK: Test ballongens integritet ved å injisere vann inn i den. Når ballongen er fylt, trykker du ballongen mykt for å teste om ballongen opprettholder spenningen på innsiden. Bruk en ny ballong hvis den lekker. De monterte ballongene kan lagres for fremtidig bruk.</li>
</ol>2. Forberedelse av hjerteperfusjonssystemet
<ol><li>Lag 1 liter Krebs-Henseleit (KH) perfusjonsbuffer og overfør den til vannreservoaret Langendorff-systemet.</li>
	<li>Koble luftrøret til vannbeholderen og slå på luftstrømmen for å balansere KH-bufferen med 5 % CO2 og 95 %O2 i minst 30 minutter.</li>
	<li>Sett vannbadet på 41,5 °C og sirkuler vannet i det ytre laget av Langendorff-systemet for å varme opp systemet og KH-bufferen. MERK: Vannbadtemperaturen krever optimalisering for hvert system. For dette systemet vil vannbadets temperatur opprettholde KH ved 37-37,5 °C når den perfuserer inn i hjertet.</li>
</ol>3. Isolasjon, montering og kanylering av musehjertet
<ol><li>For antikoagulasjon, adminster 200 enheter heparin i saltvann ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon i høyre kvadrant av C57/B6 mus abdomen. Aspirer sprøyten før injeksjon for å bekrefte at nålens skråning ikke er i blæren eller lumen i GI-kanalen. Bruk minst fire mus i hver eksperimentell tilstand (men vurder også størrelsen på behandlingseffekten).<ol><li>Etter 30 minutter administreres 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin i.p. for å bedøve musen. Sjekk om den bedøvede musen er bevisstløs ved å utføre en tåklemme og sikre at ingen respons blir observert. Acepromazin 2mg/kg kan tilsettes ket/xyl-cocktailen hvis den brukte stammen av mus ikke når et tilstrekkelig anestesinivå kun med ket/xyl.</li>
		<li>Lag et snitt rett under brystbenet. Bruk saks til å åpne brystet ved å kutte membranen og ribbeina. Brett den fremre brystveggen for å eksponere brystet helt. Kutt ved den synkende aorta (lukket til aortabuen). Overfør hjertet, lungene og thymus av musen til kald histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) buffer. Isoler organene under iskald HTK-buffer. Eksponer aorta ved å fjerne bindevev. MERK: Maksimere aorta lengde ved å inkludere både stigende aorta og aortabuen regionen i excision å tillate nok plass til å koble til en nål.</li>
	</ol></li>
	<li>Koble enden av aorta til en 22 G nål, og bind med en 6-0 silke sutur. Forsikre deg om at kanylen er over aortaroten for ikke å forstyrre aortaklaffen. Perfus aorta med 10 ml kald (4 °C) HTK-buffer over ca. 10 minutter. MERK: Det tar mindre enn 15 min fra hjertefjerning til kanylering av aorta; Det er imidlertid viktig å holde perfusjonshastigheten på riktig nivå. Injeksjoner som er for raske og kraftige kan generere høyt trykk og forårsake vaskulær-/hjerteskade.</li>
	<li>Oppbevar hjertet i et 50 ml rør med iskald HTK i 8 timer eller utfør perfusjonen umiddelbart (ikke oppbevar kontrollen) og unngå direkte kontakt med is. MERK: Direkte kontakt av hjertevevet med is kan føre til kuldeskade.</li>
	<li>Koble det nålmonterte hjertet til kanylen i Langendorff-apparatet og bind det med en silkeutur. MERK: For å standardisere prosedyren, vent i totalt 3 minutter for kanyleringsprosessen før perfusjon.</li>
	<li>Start perfusjonen med en konstant strømningsmodus ved 3 ml/min; bytt deretter til konstant trykkmodus ved 70-80 mmHg og juster hjertet til ~ 6 ml / min. MERK: Palpere hjertet mykt kan bidra til å akselerere hjerte reanimation. Hvis perfusjonsstrømningshastigheten er mye høyere enn 6 ml / min ved konstant trykkmodus, kan det være en lekkasje i kanylasjonen eller aortaklaffen fungerer kanskje ikke som den skal. Juster tilkoblingene for å fikse lekkasjen. Den konstante strømningsmodusen overstyrer hjertets vaskulære tone-selvregulering. Den konstante trykkmodusen gjør at hjertet kan regulere sin koronar perfusjonsstrøm. Derfor vil den konstante trykkmodusen nøyaktig måle hjertefunksjonen og bevaringskvaliteten til hjertet.</li>
	<li>Koble en deflatert, vannfylt ballong til en trykktransduser og en vannfylt sprøyte med en treveis kran. Etter en 15-20 min likevektsperiode, kutt høyre atrium (RA) og sett ballongen til bobilen gjennom RA. Bruk tape til å holde ballongen inne i bobilen. Minimer det åpne området av RA for å begrense ballongen i ventrikkelen (se figur 1 for oppsettet). MERK: En periode med likevekt er nødvendig, da hjertekontraksjonen og avslapningen ikke er stabil i begynnelsen, og tiltaket er mindre nøyaktig og representativt. Hvis AV-knuten er skadet under åpningen av RA, vil hjertet vise hyppige arytmier.</li>
	<li>Etter 20 min RV funksjonell datainnsamling, kutt venstre atrium (LA) og sett inn en deflatert vannfylt ballong til LV gjennom LA. Bruk tape for å holde ballongen inne i LV. MERK: Hjertet bør opprettholde stabil hemodynamikk i mer enn 1,5 time.</li>
</ol>4. Funksjonell dataregistrering
<ol><li>Kalibrering av trykktransduseren<ol><li>Fyll en 10 ml sprøyte med varmt saltvann og koble sprøyten til kuppelen gjennom en treveis kran. Åpne kranen og fyll kuppelen sakte med saltvann, og lukk deretter alle kraner og fjern sprøyten. Fest den fylte kuppelen til transduseren; Koble trykkmåleren til den tredje enden av treveiskranen.</li>
		<li>I opptaksprogramvaren velger du Bridge Amp fra rullegardinmenyen til kanalen som kobles til transduseren. Gi nytt navn til kanalen som Perfused pressure. Klikk Null for å nullstille svingeren.</li>
		<li>Start opptaket ved å klikke Start slik at svingeren nå leser 0 mmHg. Etter flere sekunders opptak, skyv sprøyten sakte og øk trykket til 100. Klikk stopp for å stoppe opptaket.</li>
		<li>I dialogboksen Enhetskonvertering velger du et opptaksområde for 0 mmHg og klikker på pilen til punkt 1 og skriver 0 mmHg. Velg opptaksområde for 100 mmHg, klikk pilen til punkt 2, og skriv 100 mmHg. Klikk OK for å kalibrere svingeren.</li>
	</ol></li>
	<li>Gi nytt navn til kanalen som tilsvarer trykktransduseren med ballongen som Ventrikkeltrykk. Start opptaket når hjertet er koblet til systemet. Etter å ha satt ballongen inn i ventrikkelen, juster vannvolumet i ballongen ved hjelp av en mikrometersprøyte gjennom treveiskranen for å opprettholde det endediastoliske trykket ved 5-10 mmHg. MERK: Den endediastoliske målingen kan reduseres under målingen, helst starte ved nær 10 mmHg.</li>
	<li>Gi nytt navn til en tom kanal som dP/dt. Fra rullegardinmenyen velger du Derivative | source channel som Ventrikkeltrykk. Kanalen vil registrere forholdet mellom trykkendring i ventrikkelhulen i sammentrekningsperioden.</li>
	<li>Velg en stabil måleperiode, og klikk deretter på Innstilling på blodtrykksmodulen.<ol><li>Velg ventrikkeltrykket som inngangskanal og klikk valg for en beregningsperiode | OK.</li>
		<li>Klikk Klassifiseringsvisning for å fjerne den ytre hjertesyklusen (f.eks. unormal syklustid eller trykk).</li>
		<li>Klikk tabellvisning for å generere tabellene over gjennomsnittet av maks dP/dt (sammentrekning) og min dP/dt (avslapning) for den valgte perioden. MERK: Lagre opptaksfilen for hver prøve og lagre tabellen over gjennomsnittlig hjertefunksjon for statistisk analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+of+heart+transplantation.">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li><li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+&amp;#34;high-risk&amp;#34;+donor+hearts:+Implications+for+infection.">Transplantation of &amp;#34;high-risk&amp;#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li><li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+the+market+for+heart+transplantation.">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679 (2016).</li><li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria.">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li><li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation.">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li><li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation:+a+thorn+amongst+the+roses.">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li><li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury:+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release.">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li><li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion.">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997 (2021).</li><li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated,+Langendorff-perfused+mouse+hearts.">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li><li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation.">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li><li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation.">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004 (2021).</li><li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation.">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology &amp; Biomaterials. 1 (101), (2011).</li><li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation.">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li><li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+function+and+failure:+report+of+a+National+Heart,+Lung,+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure.">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Denne protokollen beskriver retrograd perfusjon Langendorff-metoden via aortakanylering. Denne teknikken kan brukes til å evaluere LV- og RV-funksjonen til murinhjerter etter kald lagring. Resultatene viser at langvarig kjølelagring av donorhjerter fører til redusert hjertefunksjon i både LV og RV ved hjelp av denne protokollen. 
Studiene av akutt og kronisk avstøtning etter hjertetransplantasjon fokuserer mye på immunbiologi14. Effekten av stedegne celler på PGD under kjølelagring er mindre godt undersøkt. PGD forekommer hos ~10%-20% av hjertetransplantasjoner og står for 66% av tidlig død innen 30 dager etter transplantasjon. Spesielt er forekomsten av PGD som påvirker LV versus RV forskjellig etter transplantasjon11. Uten bidrag fra mottakerens cellulære responser, fokuserer denne ex vivo-metoden på bidragene fra innfødte hjerteceller til PGD etter kuldekonservering av donorhjerter. Videre studier kan inkludere mottakerresponser i en murine hjertetransplantasjonsmodell. 
I denne protokollen fokuserte Langendorff-perfusjonen av kaldbevarte donorhjerter på de opprinnelige hjerteresponsene på varm krystalloid perfusjon uten å infiltrere cellulær immunitet. For å oppnå reproduserbare resultater ble flere kritiske trinn standardisert. Musehjertene ble arrestert ved hjelp av HTK-løsning og lagret i iskald HTK, tilsvarende klinisk praksis. Perfusjonsvolumet og infusjonstiden for HTK-oppløsningen for hvert hjerte ble nøye overvåket med en timer. Donorhjertet ble oppbevart i forkjølte rør på is med HTK i et rom på 4 °C. Kanyleringstiden waas standardisert til ~ 3 min før perfusjon. Alle disse trinnene sørget for at kuldekonserveringsvarighet var den viktigste variabelen i studien. 
En periode med uregelmessig hjertekontraktilitet i ~20 min ble ofte sett i begynnelsen av perfusjonen. Denne likevekts- og gjenopprettingsperioden ble tilrettelagt ved gradvis oppvarming og oksygenering av hjertevev. Det var ventet en relativt stabil periode etter de første 20 min. Ballongen ble satt inn i ventrikkelhulen ved ~18 min etter den første likevektsperioden. Vi begynte å registrere hemodynamikk etter at hjertet var stabilt i ~25 min, når ballongen ble satt inn. Perfusjon med KH-buffer opprettholdt stabil hjerteytelse i ~1,5-2 timer. Vi valgte derfor å registrere hemodynamikk i 20 min i hver av venstre og høyre ventrikler.
Det er flere begrensninger ved retrograd perfusjon for å studere hjertets PGD etter kald lagring. For det første, på grunn av ballongstørrelsen og mangel på plass i hvert ventrikkelhulrom (spesielt RV), er samtidig innsetting av to ballonger i både LV og RV svært utfordrende. Dermed måler vi funksjonen til RV og LV sekvensielt. Det er viktig å merke seg at interventrikulær septum bidrar betydelig til både venstre og høyre ventrikulær funksjon. Septum bidrar til ~ 50% av høyre ventrikulær funksjon, så det er interventrikulær avhengighet15. Det er også viktig å merke seg at mens prosedyrene for reperfusjon av murine hjertet i Langendorff-enheten tar ~ 3 min, tar kirurgisk implantasjon av det menneskelige hjertet i det relativt varme kirurgiske feltet ~ 45 min. Til sammenligning pådrar murine hjertet i dette Langendorff-systemet mindre iskemisk tid. Dette bør tas i betraktning ved vurdering av klinisk oversettelse.
Siden vi brukte KH-buffer til å perfusere hjertet uten blod, kan dette også ha mindre effektivitet i oksygentilførsel. Imidlertid er hjertefunksjonen relativt stabil gjennom de første 1,5-2 timer med perfusjon, og tillater dermed pålitelige hemodynamiske målinger. Dessverre er det for tiden ingen levedyktige fungerende hjerteperfusjonsmodeller for disse mindre murinhjertene, og effekten av ventrikkelbelastning kan ikke evalueres i dette systemet. Til tross for dette er perfusjonssystemet svært reproduserbart og mindre arbeidskrevende og tidkrevende enn transplantasjonsmodeller. Det er også mindre kostbart enn transplantasjonsstudier, noe som kan gjøre det mer egnet for screening av ulike terapeutiske alternativer og ulike molekylære veier. Med modifikasjoner av konserveringsløsninger ved å legge til kandidatmedisiner, kan denne plattformen brukes til å evaluere effekten av farmakologiske midler på å redusere PGD i både LV og RV.

Hjertetransplantasjon bedrer overlevelse og livskvalitet hos pasienter med hjertesvikt i sluttstadiet1. Dessverre begrenser mangelen på hjertedonorer antall pasienter som kan ha nytte av denne behandlingen og begrenser klinikernes evne til å matche donorer optimalt med mottakere 2,3,4. Videre har det nye tildelingssystemet bidratt til lengre iskemiske tider og økt bruken av marginale givere betydelig siden 20185. Følgelig øker gjennomsnittsalderen for hjertedonorer og iskemisk tid over tid, noe som fører til en høyere forekomst av primær transplantatdysfunksjon (PGD) til tross for betydelige forbedringer i strategiene for hjertebevaring 6.
PGD kan ramme venstre, høyre eller begge ventriklene, og er fortsatt en livstruende komplikasjon som representerer den viktigste årsaken til tidlige dødsfall etter hjertetransplantasjon. Undersøkelse av mekanismene til PDG og utvikling av strategier for bedre hjertebevaring er viktige hensyn, gitt den potensielle livreddende effekten på hjertemottakere. Derfor er eksperimentelle modeller som muliggjør en robust og pålitelig vurdering av donorhjertefunksjon etter forlenget lagringstid, avgjørende for å øke vår forståelse av PGD og legge til rette for utvikling av nye terapier. Evnen til nøyaktig å vurdere hjertefunksjonen i musehjertet gir tilgang til et stort repertoar av transgene murinmodeller som nøyaktig kan identifisere PGD-mekanismer.
I fysiologiske og farmakologiske studier er Langendorff retrograd perfusjonsmodell mye brukt til å vurdere hjertefunksjon7. Spesielt oppdages hjerteytelsen av en silikonballong koblet til en trykktransduser i venstre ventrikkel (LV) hulrom. Et sentralt trekk ved PGD er utilstrekkelig sammentrekning og avslapning av ventrikkelmuskelen. Tidligere Langendorff-studier har fokusert på å bruke en LV-ballong for å produsere pålitelige og reproduserbare resultater i LV funksjonsvurdering 8,9,10. Imidlertid er bruken av en intrakavitær ballong for å vurdere høyre ventrikulær (RV) funksjon ved hjelp av ballongsystemet mindre godt anerkjent.
Gitt en signifikant PGD-rate som involverer RV etter transplantasjon11, vil eksperimentelle metoder for å studere både LV- og RV-funksjon bidra til å bestemme molekylære og fysiologiske mekanismer som bidrar til RV PGD. Denne protokollen viser at intrakavitære silikonballonger kan gi pålitelige vurderinger av LV- og RV-funksjon i samme murine heart12. For å evaluere den potensielle bruken av Langendorff-systemet i PGD-studien, undersøkte vi hjertefunksjonene med ulike lagringsperioder og fant nedsatt hjertefunksjon ved sammentrekning og relaksasjon med langvarig kuldelagring av murinhjerter. Interessant nok har LV en høyere funksjonsreduksjon enn RV. Oppsummert kan protokollen beskrevet her brukes til å vurdere effekten av et kandidatmedikament og molekylære veier på både LV- og RV-funksjon. Evnen til å bruke denne metoden på murine hjerter vil lette utførelsen av detaljerte mekanistiske studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All purpose flour</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn Syrup</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol HTK Solution</td>
			<td>Essential Pharmaceuticals LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393/14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Henseleit buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusil silicone dispersions</td>
			<td>Avantor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion system</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130101BEZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1126</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model

Primær transplantatdysfunksjon (PGD) er fortsatt den viktigste årsaken til tidlig død etter hjertetransplantasjon. Forlenget iskemisk tid under kuldekonservering er en viktig risikofaktor for PGD, og pålitelig evaluering av hjertefunksjonen er avgjørende for å studere donorhjertets funksjonelle responser etter kuldekonservering. Den medfølgende videoen beskriver en teknikk for å vurdere murine høyre og venstre ventrikkelfunksjon ved hjelp av ex vivo perfusjon basert på en Langendorff-modell etter kuldekonservering i forskjellige varigheter. Kort fortalt isoleres hjertet og lagres i en kald histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) løsning. Deretter perfuseres hjertet med en Krib-buffer i en Langendorff-modell i 60 minutter. En silikonballong settes inn i venstre og høyre ventrikkel, og hjertefunksjonelle parametere registreres (dP / dt, trykk-volumforhold). Denne protokollen tillater pålitelig evaluering av hjertefunksjonen etter forskjellige hjertebevaringsprotokoller. Det er viktig at denne teknikken tillater studier av hjertebevarelsesresponser spesielt i innfødte hjerteceller. Bruken av svært små murinhjerter gir tilgang til et enormt utvalg av transgene mus for å undersøke mekanismene bak PGD.

Voksne C57Bl/6 musehjerter, 3 måneders alder, ble høstet og montert på Langendorff-systemet. Donorhjertet ble lagret i HTK i 0 og 8 timer, og deretter perfusjonert med oksygenert KH-buffer. En silikonballong som kobles til en trykktransduser ble brukt til å måle sammentrekning og avslapning av LV- og RV-funksjonen.
Aortatrykket ble opprettholdt i området 70-80 mmHg. Hjertefrekvensen var sammenlignbar i musehjerter med 0 og 8 timer lagringsplass. LV- og RV-funksjonen ble undersøkt ved å måle systolisk og diastolisk trykk. dP/dt, et derivat for å beregne forholdet mellom trykkendring, ble beregnet for å bestemme trykkdynamikken. Det absolutte antallet maks dP/dt og min dP/dt kan representere nivået av muskulær sammentrekning og avslapning. Ved 0 timers lagring hadde LV høyere systolisk trykk sammenlignet med RV (figur 2C og figur 3A). LV viste mer muskulær sammentrekning og relaksasjon enn bobilen etter perfusjon av 0 timers lagring (figur 2C og figur 3B,C). Etter 8 timers kjølelagring viste imidlertid både LV og RV en signifikant funksjonsreduksjon sammenlignet med en 0 h baseline (figur 2A-D og figur 3B, C). Reduksjonen i hjertekontraksjon var mer alvorlig i LV. Etter 8 timers lagring var sammentrekningen og relaksasjonen av LV 25,1 % og 30,7 % av baselinjen 0 timer, mens RV hadde 32,5 % og 29,1 % funksjon sammenlignet med baseline 0 timer (figur 3B,C). Disse resultatene viste at PGD for LV etter langvarig lagring hadde en mer signifikant hjertekontraksjonsreduksjon enn RV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> Figur 1: Montering og kanylering av musehjertet . (A) Generelt oppsett av perfusjonsoppsettet. 1. Perfusjonsreservoar. 2. Oksygeneringskammer. 3. Luftfellekammer. 4. Hjertekammer. 5. Verdibryter for konstant strømning og trykk. 6 og 7. Oksygentilførsel. (B) Kanylerte hjerter med bobilen foran. (C) Plassering av bobilen for å kutte for å åpne hulrommet. (D) Trykk på ballongrøret med kanylen. Forkortelse: RV = høyre ventrikkel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> Figur 2: Sammenligning av funksjonen til LV versus RV. (A) Sporingsregistrering av maks og min dP / dt i RV og LV i donorhjertet med 0 timers lagring. (B) Registreringen av maks og min dP / dt i RV og LV i donorhjertet med 8 timers lagring. (C,D) Detaljer om dP / dt, LV-trykk, hjertefrekvens og perfusjonstrykk i LV og RV ved 0 timer og 8 timer. Forkortelser: RV = høyre ventrikkel; LV = venstre ventrikkel; dP/dt = trykk-tid forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> Figur 3: Sammenligning av funksjonen til LV versus RV etter lagring og perfusjon. (A) Systolisk og diastolisk trykk av LV og RV etter 0 timer og 8 timers lagring. (B) Maks dP / dt og (C) Min dP / dt av LV og RV etter perfusjon med 0 timer og 8 timers lagring. Dette tallet er fra Lei et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Presentert her er en protokoll for pålitelig kvantifisering av høyre og venstre ventrikkelfunksjon av donorhjerter etter kuldekonservering ved hjelp av et ex vivo perfusjonssystem.

Vurdering av ex vivo murine biventrikulær funksjon i en Langendorff-modell

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Med den beskrevne protokollen kan vi sammenligne donorhjertets venstre ventrikkel og ventrikkelfunksjonen etter konservering, og vi kan undersøke forskjellen i bevaringsbiologi i begge ventriklene under disse konserveringsprosessene. Denne teknikken bruker ex vivo perfusjonssystem for å undersøke hjertefunksjonene etter bevaring. Det gir et robust og pålitelig verktøy for å screene nye behandlinger for å forbedre donorhjertefunksjonene etter bevaring.Begynn med tilberedning av deig som beskrevet i teksten og form et lite stykke deig til en oval form for å få hodet. Fest den til enden av en tørr spaghettistreng. Dypp hodet i den allerede tilberedte sukkeroppløsningen og fjern den sakte når den er godt belagt med en tynn film av løsningen.Deretter suspenderer du spaghettistrengen på en polystyrenskumblokk eller andre holdere for å tillate dannelse av et jevnt og blankt deksel over hodet og tørk det over natten. Neste dag, dypp formen i silikonelastomer dispergert i xylen og legg spaghettistrengen tilbake i polystyrenskumblokken ved 37 grader Celsius i to timer eller til den er tørr. Gjenta dette trinnet en gang til.Deretter plasserer du formen i vannet for å skille og samle ballongen. Oppbevar ballongen i 0,02 % natriumazid. Nå, kutt en to stump endespiss fra en 22-gauge nål og monter den ene stumpe enden til silikonballongen mens den andre stumpe enden til et PE-rør.Bruk en 4-0 silkesutur for å binde ballongen på plass på nålen. Ta C57Black/6-musen og injiser intraperitonealt 200 enheter heparin i dyrets mage for antikoagulasjon. Etter å ha bekreftet riktig anestesi med en tåklemme, gjør du et snitt rett under brystbenet.Og bruk saks, åpne brystet ved å kutte membranen i ribbeina. Deretter bretter du den fremre brystveggen for å eksponere brystet helt før du gjør et kutt i den synkende aorta nær aortabuen. Overfør nå musens hjerte, lunger og thymus til iskaldt histidin-tryptofan-ketoglutarat, eller HTK-buffer, for å isolere organene.Eksponer aorta ved å fjerne bindevev. Koble enden av aorta til en 22-gauge nål og bind den med en 6-0 silke sutur. Sørg for at kanylen er over aortaroten, for ikke å forstyrre aortaklaffen.Perfus aorta i ca. 10 minutter med 10 ml HTK-buffer, forkjølt til fire grader Celsius. Avhengig av type eksperiment, må du enten lagre hjertet i et 50 milliliter rør med iskald HTK i åtte timer eller umiddelbart utføre overflod. For å utføre overflod, koble det nålmonterte hjertet til kanylen i Langendorff-apparatet og bind det med en silkeutur.Start overflod i konstant strømningsmodus ved tre milliliter per minutt, og deretter etter å ha byttet til en konstant trykkmodus ved 70 til 80 millimeter kvikksølv, juster perfusjonshastigheten til omtrent seks milliliter per minutt. Deretter kobler du en deflatert vannfylt silikonballong til en trykktransduser og en vannfylt sprøyte ved hjelp av en treveis kran. Etter 15 til 20 minutter av en likevektsperiode etter forrige perfusjon, kutt høyre atrium, eller RA, og sett ballongen inn i høyre ventrikkel, eller RV, gjennom RA. Bruk tape for å holde ballongen inne i bobilen og minimere det åpne området av RA for å begrense ballongen i ventrikkelen.Etter 20 minutter med funksjonell datainnsamling for RV, kutt venstre atrium eller LA, og sett inn en deflatert vannfylt ballong i venstre ventrikkel, eller LV, gjennom LA. Bruk tape til å holde ballongen inne i LV.To kalibrer trykktransduseren, fyll først en 10 ml sprøyte med varmt saltvann og koble sprøyten til kuppelen gjennom en treveiskran. Åpne kranen og fyll kuppelen sakte med saltvann før du lukker alle kraner og fjerner sprøyten. Fest deretter den fylte kuppelen til transduseren ved å koble manometeret til den tredje enden av treveiskranen.I opptaksprogramvaren, fra rullegardinmenyen til kanalen som kobles til transduseren, velger du alternativet Bridge Amp. Klikk på 0 før du starter opptaket for å sette svingeravlesningen til null millimeter kvikksølv. Etter flere sekunders opptak, skyv sprøyten sakte og øk trykket til 100.Klikk Stopp for å avslutte opptaket. I dialogboksen Enhetskonvertering velger du opptaksområdet for null millimeter kvikksølv og klikker pilen til 1 før du skriver null millimeter kvikksølv. På samme måte velger du opptaksområdet for 100 millimeter kvikksølv.Klikk pilen til 2, og skriv inn 100 millimeter kvikksølv. Klikk nå OK for å kalibrere svingeren. Etter at kalibreringen er fullført, gi nytt navn til kanalen som tilsvarer trykktransduseren med ballongen som Ventrikkeltrykk, eller LV-trykk, og start opptak når hjertet er koblet til systemet.Etter å ha satt ballongen inn i ventrikkelen, juster vannvolumet i ballongen ved hjelp av en mikrometersprøyte gjennom treveiskranen for å opprettholde endediastolisk trykk ved fem til 10 millimeter kvikksølv. Deretter gir du nytt navn til en tom kanal som dP/dt og beholder den deriverte kildekanalen som ventrikkeltrykk. Denne kanalen registrerer forholdet mellom trykkendring i ventrikkelhulen under sammentrekning.Velg stabil måleperiode før du går til innstilling i blodtrykksmodulen. Velg deretter LV-trykket som inngangskanal og klikk på valg før du trykker på OK. Klikk nå Klassifiseringsvisning for å fjerne eventuelle avvikende hjertesykluser, og tabellvisning for å generere tabellene for gjennomsnittet av maksimal dP/dt og minimum dP/dt for den valgte perioden. Når musehjertet ble lagret i HTK-buffer i null timer før perfusjon, ble det registrert høyere systolisk trykk for LV sammenlignet med RV. I tillegg, sammenlignet med RV, viste LV også betydelig mer muskulær sammentrekning, samt avslapning.Men når perfusjon ble utført på hjertet etter å ha utsatt det for åtte timers kjølelagring, viste både LV og RV en signifikant funksjonsreduksjon sammenlignet med nulltimerstadiet. Reduksjonene ble observert å være mer alvorlige i LV sammenlignet med RV. Sammentrekningen og avslapningen av LV etter åtte timers lagring var 25,1% og 30,7% av funksjonen som tilsvarer null-timers lagring, mens RV viste 32,5% og 29,1% av funksjonen, sammenlignet med null-timers baseline. Indikasjon på primær dysfunksjon av transplantat av LV etter langvarig lagring var mer signifikant enn for RV. Bevaringskvaliteten er i stor grad avhengig av perfusjonen av HTK.Det er viktig å sørge for at perfusjonen er konsistent for å nøyaktig sammenligne ulike behandlinger. Med presis måling av en donor hjertefunksjon av bevaring, kan denne metoden lett å tilpasse til skjermen medisiner som kan forbedre donor hjertefunksjon og deretter videre validere ved hjelp av en heterotopisk transplantasjon modell.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aterosklerotisk plakk modell for å studere Lesjon Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induksjon og vurdering av iskemi-reperfusjon Injury in Langendorff-perfuserte rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Vurdering av Plasma koagulering på leveren vev i en stor dyremodell i Vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten dyr modell av Ex Vivo Normothermic lever perfusjon

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Virkningen av Intracardiac Neurons Cardiac Electrophysiology og Arrhythmogenesis i en Ex Vivo Langendorff System

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

Normothermic Ex Situ hjertet perfusjon i arbeider modus: vurdering av hjertefunksjon og metabolisme

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Ikke-invasiv vurdering av Dorsiflexor muskel funksjon i mus

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

Et datastyrt funksjonsferdighetsvurderings- og opplæringsprogram rettet mot teknologibasert hverdagsfunksjonelle ferdigheter

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optocardiography og elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-perfusert Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Leverskiver som en Ex Vivo-modell av leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...