Name: assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

Alla djurförsök i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Michigan, Ann Arbor. Alla möss hölls i en ljuscykel på 12:12 i patogenfria rum. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, djur och utrustning som används i detta protokoll.
1. Konstruktion av silikonballongkatetern
OBS: Silikonballongen är gjord enligt beskrivningen tidigare13.
<ol><li>Tillsätt 9,5 ml destillerat vatten, 14,2 ml lätt majssirap och 33,8 g sackaros till en 100 ml bägare. Värm och rör om tills sockret är helt upplöst.</li>
	<li>Förbered degen genom att blanda 10 g vetemjöl och 5 g vatten tills en jämn konsistens uppnås och låt den vila i 10 min.</li>
	<li>Forma en liten bit deg till en oval - "huvudet" - och fäst den i änden av en torr spaghettitråd. Doppa sedan detta huvud i sockerlösningen och ta långsamt bort det från lösningen, eftersom huvudet nu är helt belagt. OBS: Degen ska vara slät och ha jämn konsistens. Storleken på degen kan varieras för att generera olika storlekar på ballonger, från 5 mm (kort diameter) till 7 mm (lång diameter). Försök att täcka dem med en tunn film av sockerlösning.</li>
	<li>Häng upp spaghettisträngen på ett polystyrenskumblock, eller andra hållare, för att bilda ett glansigt lock jämnt över huvudet och torka över natten.</li>
	<li>Doppa formen i silikondispersion (silikonelastomer dispergerad i xylen). Sätt tillbaka spaghettisträngen i polystyrenskumblocket vid 37 °C i 2 timmar eller tills den är torr. Upprepa detta steg en gång. OBS: Det är viktigt att förhindra att silikondispersionsgelen oxiderar på grund av luftexponering, eftersom detta kommer att generera en ojämn ballongtjocklek.</li>
	<li>Placera formen i vattnet för att separera och samla upp ballongen. Förvara ballongen i 0,02 % natriumazid.</li>
	<li>Skär av en spets med två trubbiga ändar från en 22 G nål; montera en trubbig ände på silikonballongen och en annan trubbig ände på PE-slangen. Använd 4-0 silke för att knyta ballongen på plats på nålen. OBS: Testa ballongens integritet genom att injicera vatten i den. När ballongen är fylld, tryck försiktigt på ballongen för att testa om ballongen bibehåller spänningen inuti. Använd en ny ballong om den läcker. De monterade ballongerna kan förvaras för framtida bruk.</li>
</ol>2. Beredning av hjärtperfusionssystemet
<ol><li>Gör 1 l Krebs-Henseleit (KH) perfusionsbuffert och överför den till Langendorff-systemets vattenreservoar.</li>
	<li>Anslut luftslangen till vattenbehållaren och slå på luftflödet för att balansera KH-bufferten med 5 % CO2 och 95 % O2 i minst 30 min.</li>
	<li>Ställ in vattenbadet på 41,5 °C och cirkulera vattnet i det yttre lagret av Langendorff-systemet för att värma upp systemet och KH-bufferten. OBS: Vattenbadstemperaturen kräver optimering för varje system. För detta system kommer vattenbadstemperaturen att hålla KH på 37-37,5 °C vid perfusion i hjärtat.</li>
</ol>3. Isolering, montering och kanylering av mushjärtat
<ol><li>För antikoagulantia, adminstrera 200 enheter heparin i koksaltlösning genom intraperitoneal (i.p.) injektion i den högra kvadranten av C57/B6 musbuk. Aspirera sprutan före injektion för att bekräfta att nålarnas avfasning inte finns i urinblåsan eller lumen i mag-tarmkanalen. Använd minst fyra möss i varje försöksbetingelse (men tänk också på storleken på behandlingseffekten).<ol><li>Efter 30 minuter administreras 80 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin i.p. för att bedöva musen. Kontrollera om den sövda musen är medvetslös genom att nypa ihop tårna och se till att ingen reaktion observeras. Acepromazin 2 mg/kg kan tillsättas till ket/xyl-cocktailen om den använda musstammen inte når en tillräcklig anestesinivå med enbart ket/xyl.</li>
		<li>Gör ett snitt precis under bröstbenet. Använd en sax för att öppna bröstet genom att klippa av diafragman och revbenen. Vik den främre bröstväggen så att bröstkorgen exponeras helt. Skär vid den nedåtgående aortan (stängd mot aortabågen). Överför hjärtat, lungorna och brässen från musen till kall histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) buffert. Isolera organen under iskall HTK-buffert. Exponera aortan genom att ta bort eventuell bindväv. OBS: Maximera aortalängden genom att inkludera både den stigande aortan och aortabågen i excisionen för att ge tillräckligt med utrymme för att ansluta till en nål.</li>
	</ol></li>
	<li>Anslut änden av aortan till en 22 G nål och knyt med en 6-0 silkessutur. Se till att kanylen är ovanför aortaroten för att inte störa aortaklaffen. Genomsök aortan med 10 ml kall (4 °C) HTK-buffert under cirka 10 minuter. OBS: Det tar mindre än 15 minuter från hjärtborttagning till kanylering av aortan; Det är dock viktigt att hålla perfusionshastigheten på lämplig nivå. Injektioner som är för snabba och kraftfulla kan generera högt tryck och orsaka kärl-/hjärtskador.</li>
	<li>Förvara hjärtat i en 50 ml tub med iskall HTK i 8 timmar eller utför omedelbart perfusionen (förvara inte kontrollen) och undvik direktkontakt med is. OBS: Direktkontakt av hjärtvävnaden med is kan leda till köldskador.</li>
	<li>Anslut det nålmonterade hjärtat till kanylen i Langendorff-apparaten och knyt ihop det med en silkessutur. OBS: För att standardisera proceduren, vänta i totalt 3 minuter för kanyleringsprocessen före perfusion.</li>
	<li>Starta perfusionen med ett konstant flödesläge vid 3 ml/min; byt sedan till konstant tryckläge vid 70-80 mmHg och justera hjärtat till ~6 ml/min. OBS: Att palpera hjärtat mjukt kan hjälpa till att påskynda hjärtats återupplivning. Om perfusionsflödet är mycket högre än 6 ml/min i konstant tryckläge kan det finnas en läcka i kanyleringen eller så kanske aortaventilen inte fungerar som den ska. Justera anslutningarna för att åtgärda läckan. Det konstanta flödesläget åsidosätter hjärtats självreglering av kärltonen. Det konstanta tryckläget gör det möjligt för hjärtat att reglera sitt kranskärlsperfusionsflöde. Därför kommer det konstanta tryckläget att exakt mäta hjärtats funktion och bevarandekvalitet.</li>
	<li>Anslut en tömd, vattenfylld ballong till en tryckgivare och en vattenfylld spruta med en trevägskran. Efter en jämviktsperiod på 15-20 minuter skär du av höger förmak (RA) och för in ballongen i RV genom RA. Använd tejp för att hålla ballongen inuti husbilen. Minimera den öppna ytan av RA för att hjälpa till att begränsa ballongen i kammaren (se figur 1 för inställningen). OBS: En period av jämvikt är nödvändig, eftersom hjärtats sammandragning och avslappning inte är stabil i början, och måttet är mindre exakt och representativt. Om AV-knutan skadas under öppningen av RA, kommer hjärtat att uppvisa frekventa arytmier.</li>
	<li>Efter 20 minuters insamling av RV-funktionella data, skär av vänster förmak (LA) och sätt in en tömd vattenfylld ballong på LV genom LA. Använd tejp för att hålla ballongen inuti LV. OBS: Hjärtat ska upprätthålla stabil hemodynamik i mer än 1,5 timme.</li>
</ol>4. Registrering av funktionella data
<ol><li>Kalibrering av tryckgivaren<ol><li>Fyll en 10 ml spruta med varm koksaltlösning och anslut sprutan till kupolen genom en trevägskran. Öppna kranen och fyll långsamt kupolen med koksaltlösning, stäng sedan alla kranar och ta bort sprutan. Fäst den fyllda kupolen på givaren; Anslut manometern till den tredje änden av trevägskranen.</li>
		<li>I inspelningsprogrammet väljer du Bridge Amp från rullgardinsmenyn för kanalen som ansluter till givaren. Byt namn på kanalen till Perfunderat tryck. Klicka på Noll för att nollställa givaren.</li>
		<li>Starta inspelningen genom att klicka på Start så att givaren nu läser 0 mmHg. Efter flera sekunders registrering trycker du långsamt på sprutan och ökar trycket till 100. Klicka på stopp för att stoppa inspelningen.</li>
		<li>I dialogrutan Enhetskonvertering väljer du ett inspelningsområde för 0 mmHg och klickar på pilen till Punkt 1 och skriver 0 mmHg. Välj inspelningsområde för 100 mmHg, klicka på pilen till punkt 2 och skriv 100 mmHg. Klicka på OK för att kalibrera givaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Byt namn på kanalen som motsvarar tryckgivaren med ballongen till ventrikeltryck. Starta registreringen när hjärtat är anslutet till systemet. Efter att ha fört in ballongen i kammaren, justera vattenvolymen i ballongen med hjälp av en mikrometerspruta genom trevägskranen för att bibehålla det slutdiastoliska trycket på 5-10 mmHg. OBS: Det slutdiastoliska måttet kan minska under mätningen, helst med början vid nära 10 mmHg.</li>
	<li>Byt namn på en tom kanal till dP/dt. Från rullgardinsmenyn väljer du Derivat | källkanal som ventrikeltryck. Kanalen kommer att registrera förhållandet mellan tryckförändringen i kammarhålan under kontraktionsperioden.</li>
	<li>Välj en stabil mätperiod och klicka sedan på Inställning på modulen Blodtryck.<ol><li>Välj ventrikeltrycket som ingångskanal och klicka på val för en beräkningsperiod | Okej.</li>
		<li>Klicka på Klassificerarvyn för att ta bort den avvikande hjärtcykeln (t.ex. onormal cykeltid eller tryck).</li>
		<li>Klicka på tabellvyn för att generera tabellerna med medelvärdet av max dP/dt (kontraktion) och min dP/dt (relaxation) för den valda perioden. OBS: Lagra registreringen file för varje sample och spara tabellen över genomsnittlig hjärtfunktion för statistisk analys.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+of+heart+transplantation.">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li><li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+&amp;#34;high-risk&amp;#34;+donor+hearts:+Implications+for+infection.">Transplantation of &amp;#34;high-risk&amp;#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li><li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+the+market+for+heart+transplantation.">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679 (2016).</li><li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria.">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li><li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation.">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li><li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation:+a+thorn+amongst+the+roses.">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li><li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury:+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release.">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li><li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion.">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997 (2021).</li><li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated,+Langendorff-perfused+mouse+hearts.">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li><li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation.">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li><li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation.">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004 (2021).</li><li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation.">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology &amp; Biomaterials. 1 (101), (2011).</li><li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation.">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li><li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+function+and+failure:+report+of+a+National+Heart,+Lung,+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure.">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Detta protokoll beskriver den retrograda perfusionsmetoden Langendorff via aortakanylering. Denna teknik kan användas för att utvärdera LV- och RV-funktionen hos murina hjärtan efter kylförvaring. Resultaten visar att långvarig kylförvaring av donatorhjärtan leder till nedsatt hjärtfunktion i både LV och RV med hjälp av detta protokoll. 
Studierna av akut och kronisk avstötning efter hjärttransplantation fokuserar i stor utsträckning på immunobiologi14. Effekterna av naturliga celler på PGD under kylförvaring är mindre väl undersökta. PGD förekommer i ~10%-20% av hjärttransplantationerna och står för 66% av de tidiga dödsfallen inom 30 dagar efter transplantationen. I synnerhet skiljer sig incidensen av PGD som påverkar LV jämfört med RVefter transplantation 11. Utan bidrag från mottagarens cellulära svar fokuserar denna ex vivo-metod på bidragen från naturliga hjärtceller till PGD efter kall konservering av donatorhjärtan. Ytterligare studier kan inkludera mottagarsvar i en murin hjärttransplantationsmodell. 
I detta protokoll fokuserade Langendorff-perfusionen av kallkonserverade donatorhjärtan på de naturliga hjärtsvaren på varm kristalloid perfusion utan att infiltrera cellulär immunitet. För att uppnå reproducerbara resultat standardiserades flera kritiska steg. Mushjärtana stoppades med HTK-lösning och förvarades i iskall HTK, på samma sätt som klinisk praxis. Perfusionsvolymen och infusionstiden för HTK-lösningen för varje hjärta övervakades noggrant med en timer. Donatorhjärtat förvarades i förkylda rör på is innehållande HTK i ett rum med 4 °C. Kanyleringstiden standardiserades till ~3 min före perfusion. Alla dessa steg säkerställde att köldkonserveringstiden var den viktigaste variabeln i studien. 
En period av oregelbunden hjärtkontraktilitet i ~20 minuter sågs ofta i början av perfusionen. Denna jämvikts- och återhämtningsperiod underlättades av gradvis uppvärmning och syresättning av hjärtvävnaden. En relativt stabil period förväntades efter de inledande 20 minuterna. Ballongen fördes in i ventrikelhålan vid ~18 minuter efter den initiala jämviktsperioden. Vi började registrera hemodynamik efter att hjärtat varit stabilt i ~25 minuter, när ballongen sattes in. Perfusion med KH-buffert bibehöll stabil hjärtfunktion i ~1,5-2 timmar. Vi valde därför att registrera hemodynamiken i 20 minuter i var och en av vänster och höger kammare.
Det finns flera begränsningar för retrograd perfusion för att studera PGD i hjärtan efter kylförvaring. För det första, på grund av ballongstorleken och bristen på utrymme i varje kammare (i synnerhet RV), är det mycket utmanande att samtidigt sätta in två ballonger i både LV och RV. Således mäter vi funktionen av RV och LV sekventiellt. Det är viktigt att notera att den interventrikulära skiljeväggen bidrar avsevärt till både vänster och höger kammarfunktion. Septum bidrar till ~50% av höger kammarfunktion, så det finns ett interventrikulärt beroende15. Det är också viktigt att notera att medan procedurerna för reperfusion av murinhjärtat i Langendorff-enheten tar ~3 min, tar kirurgisk implantation av det mänskliga hjärtat i det relativt varma kirurgiska fältet ~45 min. I jämförelse ådrar sig det murina hjärtat i detta Langendorff-system mindre ischemisk tid. Detta bör beaktas när klinisk översättning övervägs.
Eftersom vi använde KH-buffert för att perfusionera hjärtat utan blod, kan detta också ha mindre effektivitet i syretillförseln. Hjärtfunktionen är dock relativt stabil under de första 1,5-2 timmarna av perfusion, vilket möjliggör tillförlitliga hemodynamiska mätningar. Tyvärr finns det för närvarande inga fungerande hjärtperfusionsmodeller för dessa mindre murina hjärtan, och effekten av kammarbelastning kan inte utvärderas i detta system. Trots detta är perfusionssystemet mycket reproducerbart och mindre arbetsintensivt och tidskrävande än transplantationsmodeller. Det är också billigare än transplantationsstudier, vilket kan göra det mer lämpligt för screening av olika terapeutiska alternativ och olika molekylära vägar. Med modifieringar av konserveringslösningar genom att lägga till läkemedelskandidater kan denna plattform användas för att utvärdera effekterna av farmakologiska medel för att minska PGD i både LV och RV.

Hjärttransplantation förbättrar överlevnaden och livskvaliteten hos patienter med hjärtsvikt i slutstadiet1. Dessvärre begränsar bristen på hjärtdonatorer antalet patienter som kan dra nytta av denna behandling och begränsar klinikernas förmåga att optimalt matcha donatorer med mottagare 2,3,4. Dessutom har det nya tilldelningssystemet bidragit till längre ischemiska tider och avsevärt ökat användningen av marginella donatorer sedan 20185. Följaktligen ökar medelåldern för hjärtdonatorer och den ischemiska tiden med tiden, vilket leder till en högre frekvens av primär transplantatdysfunktion (PGD) trots signifikanta förbättringar i strategierna för hjärtbevarande 6.
PGD kan drabba vänster, höger eller båda kamrarna och är fortfarande en livshotande komplikation som utgör den främsta orsaken till tidig död efter hjärttransplantation. Att undersöka mekanismerna för PDG och utveckling av strategier för bättre hjärtbevarande är viktiga överväganden, med tanke på den potentiella livräddande effekten på hjärtmottagare. Därför är experimentella modeller som möjliggör en robust och tillförlitlig bedömning av donatorers hjärtfunktion efter en längre lagringstid avgörande för att öka vår förståelse för PGD och underlätta utvecklingen av nya terapier. Förmågan att noggrant bedöma hjärtfunktionen i mushjärtat ger tillgång till en stor repertoar av transgena murina modeller som exakt kan identifiera PGD-mekanismer.
I fysiologiska och farmakologiska studier används Langendorffs retrograda perfusionsmodell i stor utsträckning för att bedöma hjärtfunktion7. Specifikt detekteras hjärtprestanda av en silikonballong ansluten till en tryckgivare i vänster kammare (LV). En viktig egenskap hos PGD är den otillräckliga sammandragningen och avslappningen av ventrikelmuskeln. Tidigare Langendorff-studier har fokuserat på att använda en LV-ballong för att producera tillförlitliga och reproducerbara resultat vid LV-funktionsbedömning 8,9,10. Användningen av en intrakavitär ballong för att bedöma högerkammarfunktionen (RV) med hjälp av ballongsystemet är dock mindre välkänd.
Med tanke på en signifikant PGD-frekvens som involverar RV efter transplantation11, skulle experimentella metoder för att studera både LV och RV-funktion hjälpa till att bestämma de molekylära och fysiologiska mekanismerna som bidrar till RV PGD. Detta protokoll visar att intrakavitära silikonballonger kan ge tillförlitliga bedömningar av LV- och RV-funktion i samma murina hjärta12. För att utvärdera den potentiella användningen av Langendorff-systemet i PGD-studien undersökte vi hjärtfunktionerna med olika lagringsperioder och fann minskad hjärtfunktion vid sammandragning och avslappning med långvarig kylförvaring av murina hjärtan. Intressant nog har LV en högre funktionsreduktion än RV. Sammanfattningsvis kan det protokoll som beskrivs här användas för att bedöma effekten av en läkemedelskandidat och molekylära vägar på både LV- och RV-funktion. Möjligheten att använda denna metod på murina hjärtan kommer att underlätta utförandet av detaljerade mekanistiska studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUTS104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All purpose flour</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn Syrup</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol HTK Solution</td>
			<td>Essential Pharmaceuticals LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393/14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Henseleit buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusil silicone dispersions</td>
			<td>Avantor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion system</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130101BEZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1126</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ex vivo murine biventricular function in a langendorff model

Primär transplantatdysfunktion (PGD) är fortfarande den främsta orsaken till tidig död efter hjärttransplantation. Förlängd ischemisk tid under köldkonservering är en viktig riskfaktor för PGD, och tillförlitlig utvärdering av hjärtfunktionen är avgörande för att studera donatorhjärtats funktionella respons efter köldkonservering. Den medföljande videon beskriver en teknik för att bedöma murina höger- och vänsterkammarfunktioner med hjälp av ex vivo-perfusion baserad på en Langendorff-modell efter kylkonservering under olika varaktigheter. I korthet isoleras hjärtat och förvaras i en kall histidin-tryptofan-ketoglutaratlösning (HTK). Därefter perfunderas hjärtat med en Kreb-buffert i en Langendorff-modell i 60 minuter. En silikonballong förs in i vänster och höger kammare, och hjärtats funktionella parametrar registreras (dP/dt, tryck-volym-relationer). Detta protokoll möjliggör tillförlitlig utvärdering av hjärtfunktionen efter olika hjärtbevarande protokoll. Viktigt är att denna teknik gör det möjligt att studera hjärtbevarande svar specifikt i naturliga hjärtceller. Användningen av mycket små murina hjärtan ger tillgång till en enorm mängd transgena möss för att undersöka mekanismerna för PGD.

Vuxna C57Bl/6-mushjärtan, 3 månader gamla, skördades och monterades på Langendorff-systemet. Donatorhjärtat förvarades i HTK i 0 och 8 timmar och perfunderades sedan med syresatt KH-buffert. En silikonballong som anslöt till en tryckgivare användes för att mäta sammandragning och relaxation av LV och RV-funktion.
Aortatrycken bibehölls i intervallet 70-80 mmHg. Hjärtfrekvensen var jämförbar i mushjärtan med 0 och 8 timmars förvaring. LV- och RV-funktionen undersöktes genom att mäta systoliskt och diastoliskt tryck. dP/dt, en derivata för att beräkna förhållandet mellan tryckförändring, beräknades för att bestämma tryckdynamiken. Det absoluta antalet max dP/dt och min dP/dt kan representera nivån av muskelkontraktion och avslappning. Vid 0 timmars lagring hade LV högre systoliskt tryck jämfört med RV (Figur 2C och Figur 3A). LV visade mer muskelkontraktion och avslappning än RV efter perfusion av 0 timmars lagring (Figur 2C och Figur 3B,C). Men efter 8 timmars kylförvaring visade både LV och RV en signifikant funktionell minskning jämfört med en 0 timmars baslinje (Figur 2A-D och Figur 3B,C). Minskningarna av hjärtkontraktionen var allvarligare i LV. Efter 8 timmars lagring var kontraktionen och relaxationen av LV 25,1 % och 30,7 % av 0 timmars baslinjen, medan RV hade 32,5 % och 29,1 % av funktionen jämfört med 0 timmars baslinjen (Figur 3B,C). Dessa resultat visade att PGD hos LV efter långvarig lagring hade en mer signifikant minskning av hjärtkontraktionen än RV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> Figur 1: Montering och kanylering av mushjärtat . (A) Övergripande inställning av perfusionsinställningen. 1. Perfusionsbehållare. 2. Syresättning kammare. 3. Luftfälla. 4. Hjärtkammare. 5. Värdevakt för konstant flöde och tryck. 6 och 7. Inflöde av syre. (B) Kanylerade hjärtan med RV framtill. (C) Placeringen av RV att skära för att öppna dess hålighet. (D) Knacka på ballongslangen med kanylen. Förkortning: RV = höger kammare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> Figur 2: Jämförelse av funktionen hos LV kontra RV. (A) Spårningshistorik för max och min dP/dt i RV och LV i donatorhjärtat med 0 timmars lagring. (B) Registreringen av max och min dP/dt i RV och LV i donatorhjärtat med 8 timmars förvaring. (C,D) Detaljer om dP/dt, LV-tryck, hjärtfrekvens och perfusionstryck i LV och RV vid 0 h och 8 h. Förkortningar: RV = höger kammare; LV = vänster kammare; dP/dt = tryck-tid-förhållande. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> Figur 3: Jämförelse av funktionen hos LV kontra RV efter lagring och perfusion. (A) Systoliskt och diastoliskt tryck för LV och RV efter 0 timmar och 8 timmars lagring. (B) Max dP/dt och (C) Min dP/dt för LV och RV efter perfusion med 0 timmar och 8 timmars lagring. Denna figur är från Lei et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model at JoVE.com

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Här presenteras ett protokoll för att på ett tillförlitligt sätt kvantifiera höger- och vänsterkammarfunktionen hos donatorhjärtan efter kallkonservering med hjälp av ett ex vivo-perfusionssystem .

Bedömning av ex vivo musbiventrikulär funktion i en Langendorff-modell

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Med det beskrivna protokollet kan vi jämföra donatorhjärtats vänstra kammare och kammarens funktion efter konservering, och vi kan undersöka skillnaden i bevarandebiologi i båda kamrarna under dessa konserveringsprocesser. Denna teknik använder ex vivo perfusionssystem för att undersöka hjärtats funktioner efter konservering. Det ger ett robust och tillförlitligt verktyg för att screena nya behandlingar för att förbättra donatorns hjärtfunktion efter konservering.Börja med beredningen av degen enligt beskrivningen i texten och forma en liten bit av degen till en oval form för att få fram huvudet. Fäst den i änden av en torr spaghettitråd. Doppa huvudet i den redan förberedda sockerlösningen och ta långsamt bort den när den är väl belagd med en tunn film av lösningen.Häng sedan upp spaghettisträngen på ett polystyrenskumblock eller andra hållare så att det bildas ett jämnt och glansigt lock över huvudet och torka det över natten. Nästa dag, doppa formen i silikonelastomer dispergerad i xylen och lägg tillbaka spaghettisträngen i polystyrenskumblocket vid 37 grader Celsius i två timmar eller tills den är torr. Upprepa detta steg en gång till.Placera sedan formen i vattnet för att separera och samla upp ballongen. Förvara ballongen i 0,02 % natriumazid. Klipp nu av en tvåtrubbig spets från en 22-gauge nål och montera den ena trubbiga änden på silikonballongen medan den andra trubbiga änden på en PE-slang.Använd en 4-0 silkessutur för att knyta ballongen på plats på nålen. Ta C57Black/6-musen och injicera intraperitonealt 200 enheter heparin i djurets buk för antikoagulantia. Efter att ha bekräftat korrekt anestesi med en tånyp, gör ett snitt precis under bröstbenet.Och använd en sax för att öppna bröstet genom att klippa diafragman i revbenen. Vik sedan den främre bröstväggen så att den exponerar bröstkorgen helt innan du gör ett snitt vid den nedåtgående aortan nära aortabågen. Överför nu musens hjärta, lungor och bräss till iskall histidin-tryptofan-ketoglutarat, eller HTK-buffert, för att isolera organen.Exponera aortan genom att ta bort eventuell bindväv. Anslut änden av aortan till en 22-gauge nål och knyt den med en 6-0 silkessutur. Se till att kanylen är ovanför aortaroten för att inte störa aortaklaffen.Perfundera aortan i cirka 10 minuter med 10 milliliter HTK-buffert, förkyld till fyra grader Celsius. Beroende på typ av experiment kan du antingen förvara hjärtat i ett 50-millilitersrör med iskall HTK i åtta timmar eller omedelbart utföra överskottet. För att utföra överflöd, anslut det nålmonterade hjärtat till kanylen i Langendorff-apparaten och knyt det med en silkessutur.Starta profusionen i ett konstant flödesläge med tre milliliter per minut, och sedan efter att ha bytt till ett konstant tryckläge vid 70 till 80 millimeter kvicksilver, justera perfusionshastigheten till cirka sex milliliter per minut. Anslut sedan en tömd vattenfylld silikonballong till en tryckgivare och en vattenfylld spruta med hjälp av en trevägskran. Efter 15 till 20 minuter av en jämviktsperiod efter föregående perfusion skär du av höger förmak, eller RA, och för in ballongen i höger kammare, eller RV, genom RA. Använd tejp för att hålla ballongen inuti husbilen och minimera den öppna ytan av RA för att hjälpa till att begränsa ballongen i kammaren.Efter 20 minuters funktionell datainsamling för RV, skär av vänster förmak, eller LA, och för in en tömd vattenfylld ballong i vänster kammare, eller LV, genom LA. Använd tejp för att hålla ballongen inuti LV.To kalibrera tryckgivaren, fyll först en 10 ml spruta med varm koksaltlösning och anslut sprutan till kupolen genom en trevägskran. Öppna kranen och fyll långsamt kupolen med koksaltlösning innan du stänger alla kranar och tar bort sprutan. Fäst sedan den fyllda kupolen på givaren genom att ansluta manometern till den tredje änden av trevägskranen.I inspelningsprogrammet, från rullgardinsmenyn för kanalen som ansluter till givaren, välj alternativet för Bridge Amp. Klicka på 0 innan du startar inspelningen för att ställa in givaravläsningen till noll millimeter kvicksilver. Efter flera sekunders registrering trycker du långsamt på sprutan och ökar trycket till 100.Klicka på Stopp för att avsluta inspelningen. I dialogrutan Enhetskonvertering väljer du inspelningsområdet för noll millimeter kvicksilver och klickar på pilen till 1 innan du skriver noll millimeter kvicksilver. På samma sätt väljer du inspelningsområdet för 100 millimeter kvicksilver.Klicka på pilen till 2 och skriv 100 millimeter kvicksilver. Klicka nu på OK för att kalibrera givaren. När kalibreringen är klar, byt namn på kanalen som motsvarar tryckgivaren med ballongen till Ventricle Pressure, eller LV Pressure, och börja spela in när hjärtat är anslutet till systemet.Efter att ha fört in ballongen i kammaren, justera vattenvolymen i ballongen med hjälp av en mikrometerspruta genom trevägskranen för att bibehålla det diastoliska sluttrycket på fem till 10 millimeter kvicksilver. Byt sedan namn på en tom kanal till dP/dt och behåll den härledda källkanalen som ventrikeltryck. Denna kanal registrerar förhållandet mellan tryckförändringen i kammarhålan under kontraktionen.Välj den stabila mätperioden innan du går till inställningen i blodtrycksmodulen. Välj sedan LV Pressure som ingångskanal och klicka på val innan du trycker på OK. Klicka nu på Klassificerarvy för att ta bort eventuella avvikande hjärtcykler och Tabellvy för att generera tabellerna för medelvärdet av maximalt dP/dt och lägsta dP/dt för den valda perioden. När mushjärtat förvarades i HTK-buffert i noll timmar före perfusion uppmättes ett högre systoliskt tryck för LV jämfört med RV. Dessutom, jämfört med RV, visade LV också betydligt mer muskelkontraktion, såväl som avslappning.Men när perfusion utfördes på hjärtat efter att ha utsatt det för åtta timmars kylförvaring, visade både LV och RV en signifikant funktionell minskning jämfört med nolltimmarsstadiet. Minskningarna observerades vara allvarligare i LV jämfört med RV. Kontraktionen och relaxationen av LV efter åtta timmars lagring var 25,1 % och 30,7 % av funktionen som motsvarar nolltimmarslagring, medan RV visade 32,5 % och 29,1 % av funktionen, jämfört med nolltimmarsbaslinjen. Indikationen på primär transplantatdysfunktion hos LV efter långvarig förvaring var mer signifikant än för RV. Konserveringskvaliteten beror till stor del på genomströmningen av HTK.Det är viktigt att se till att perfusionen är konsekvent för att exakt kunna jämföra olika behandlingar. Med exakt mätning av en donators hjärtfunktion med bevarande kan denna metod enkelt anpassas för att screena läkemedel som kan förbättra donatorns hjärtfunktion och sedan validera ytterligare med hjälp av en heterotopisk transplantationsmodell.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

En Människa<em&gt; Ex vivo</em&gt; Aterosklerotiska plack modell för att studera Lesion Biologi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion och Bedömning av ischemi-reperfusion skada i Langendorff-perfusion Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Bedömning av Plasma koagulation på levervävnad i en stor djurmodell In Vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten djurmodell för Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Inverkan av intrakardiellt nervceller på hjärtats elektrofysiologi och Arrhythmogenesis i ett Ex Vivo av System

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

Normothermic Ex Situ hjärtat Perfusion i arbetar läge: bedömning av hjärtfunktionen och Metabolism

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Icke-invasiv bedömning av Dorsiflexor muskelfunktion hos möss

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

En datoriserad funktionell kompetensbedömning och utbildningsprogram inriktning teknikbaserad vardagliga funktionella färdigheter

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiografi och elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-parfymera hjärtan

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut leverskivor som en Ex Vivo modell av leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...