Name: crispr/cas9-mediated highly efficient gene targeting in embryonic stem cells for developing gene-manipulated mouse models
Uploaded: 2022-08-24T14:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models at JoVE.com

אנו מודים לסאקי נישיוקה באוניברסיטת אוסקה, מחקר ופיתוח ביוטכנולוגיה (ארגון ללא מטרות רווח), ולמיו קיקוצ'י ורייקו סאקאמוטו במכון למדעי הרפואה, אוניברסיטת טוקיו, על הסיוע הטכני המצוין שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי: משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT)/האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקי KAKENHI ל- MI (JP19H05750, JP21H05033), ו- MO (20H03162); מחקר הליבה למדע וטכנולוגיה אבולוציונית (CREST), מענק סוכנות המדע והטכנולוגיה של יפן (JST) ל- MI (JPMJCR21N1 ); המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר ל-MI (R01HD088412); קרן ביל ומלינדה גייטס ל-MI (מענק חקר האתגרים הגדולים INV-001902); והמענק לפרויקט מחקר משותף של מכון המחקר למחלות מיקרוביאליות, אוניברסיטת אוסקה ל-MI ו-MO.

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Oji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+in+ES+cells+and+its+application+for+chimeric+analysis+in+mice.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice.</a> Scientific Reports. 6, 31666 (2016).</li><li>Kaneko, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation.">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases.">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+proto-oncogene+int-2+in+mouse+embryo-derived+stem+cells:+a+general+strategy+for+targeting+mutations+to+non-selectable+genes.">Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.</a> Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).</li><li>Johnson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nonexpressed+genes+in+embryonic+stem+cells+via+homologous+recombination.">Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination.</a> Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).</li><li>Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+a+subtle+mutation+into+the+Hox-2.6+locus+in+embryonic+stem+cells.">Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells.</a> Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).</li><li>Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M., Hatada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mouse+embryonic+stem+cells+via+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+(RNP)+mediated+genome+editing.">Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing.</a> Genome Editing in Animals - Methods and Protocols 2nd edition. , (2022).</li><li>Yagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+ground-state+female+ES+cells+maintaining+gamete-derived+DNA+methylation.">Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation.</a> Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).</li><li>Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+an+extrachromosomal+plasmid+vector+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).</li><li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors.">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322 (5903), 949-953 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+chimeric+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+4-+to+8-cell+and+blastocyst+embryos.">Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos.</a> Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Chimeras+through+Injection+and+Coculture+of+Embryos.">Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos.</a> Stem Cells International. 2014, 409021 (2014).</li><li>Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+double-strand+break+indel+byproducts+with+secondary+guide+RNAs+improves+Cas9+HDR-mediated+genome+editing+efficiencies.">Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies.</a> Nature Communications. 13 (1), 2351 (2022).</li><li>Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+complementation+using+Prdm14-deficient+rats+enables+efficient+germline+transmission+and+generation+of+functional+mouse+spermatids+in+rats.">Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats.</a> Nature Communications. 12 (1), 1328 (2021).</li><li>Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+chimeric+mice+with+spermatozoa+fully+derived+from+embryonic+stem+cells+using+a+triple-target+CRISPR+method+for+Nanos3.">Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3.</a> Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

מיקוד גנים של תאי גזע עובריים ואחריו ייצור כימרה שימשו באופן קונבנציונלי לפיתוח עכברים שעברו מניפולציה גנטית. אף על פי כן, יעילות הדפיקה של הגנים נותרה נמוכה למרות שווקטור המיקוד מכיל זרועות הומולוגיות ארוכות (> כמה קילובייט בדרך כלל) עם קלטות גנים חיוביות או שליליות לבחירת תרופות. הפרוטוקול שלנו הציג שיטת ESC KI מכוונת של דנ"א אקסוגני ארוך באמצעות פלסמיד מעגלי ללא קלטות לבחירת תרופות כווקטור מיקוד המלווה בעריכת גנום בתיווך Cas9-RNP ביעילות מקובלת לעבודות שגרתיות. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לעזור להפחית באופן משמעותי את משך הזמן הנדרש בייצור עכברים כימריים מהונדסים גנטית בהשוואה למיקוד ESC הקונבנציונלי.
בפרוטוקול זה השתמשנו ב-CRISPR/Cas9-RNP כדי לגרום לשברים דו-גדיליים ספציפיים לאתר בגנום, ופלסמיד מעגלי שימש כווקטור המיקוד במקום וקטור ליניארי. פלסמידים ליניאריים משמשים באופן קונבנציונלי כווקטור מיקוד לגן KI בגלל היעילות המוגברת שלהם של אינטגרציה גנומית 8,9,10. עם זאת, אינטגרציות גנומיות רבות אינן ספציפיות למרות שהווקטור מכיל זרועות הומולוגיות9. מצד שני, פלסמידים מעגליים משמשים לעתים רחוקות כווקטורים ממוקדים בגלל התכונה הקשה לשילוב שלהם בגנום של תאי גזע עובריים12 או פיברובלסטים13. לפיכך, ייתכן שיישום פלסמיד מעגלי כווקטור מיקוד המלווה בעריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 ממזער אינטגרציה אקראית לא ספציפית, אך ממקסם את האינטגרציה הספציפית לאתר בגנום ESC. ראוי לציין כי יעילות האינדוקציה של שבירת הגדילים הכפולים על ידי CRISPR/Cas9 חשובה למדי14, ולכן יהיה חיוני להשתמש ב-gRNA הגורם לשבר דו-גדילי ביעילות גבוהה. יש לשקול תכנון מחדש של gRNA כאשר יעילות ה-KI נמוכה מדי. במקרה המוצג באיור 2, 40.9% משיבוטי ESC הראו פס ספציפי ל-KI. למעשה, כמעבדת הליבה של המכון, אנו מבצעים באופן שגרתי מיקוד גנים באמצעות תאי גזע עובריים בשיטה המתוארת כאן והשגנו יעילות KI של 10%-50% עבור רצפים של 1-2 קילובייט כגון Cre, CreERT או כתבים פלואורסצנטיים, אם כי יש כמה וריאציות בהתאם למוקד הגן. רצפי הדנ"א הארוכים ביותר שיש לנו בהצלחה KI בשיטה זו הם בערך 11.2 קילובייט לתוך לוקוס Rosa26, והיעילות הייתה 12.2% (חמש מושבות KI מתוך 41 מושבות שנותחו).
כמו כן, יש לציין כי פרוטוקול זה משתמש בעוברים בעלי שמונה תאים או בשלב מורולה כמושתלים עבור מיקרו-הזרקות ESC אך לא עוברים בשלב הבלסטוציסט. למרות שלא ערכנו ניסויים משווים במאמר זה, מספר דיווחים הראו כי הזרקה של תאי גזע עובריים לעוברים בשלב שמונה תאים או מורולה משפרת באופן משמעותי את היעילות של תרומת ESC לצאצאים כימריים בהשוואה להזרקת ESC לבלסטוציסטים15,16,17,18 . ואכן, הזרקות ESC של קווי ESC שונים, כולל C57BL/6, B6-129 F1 ו-BALB/c, גרמו בדרך כלל להתפתחות כימרה בצבע פרווה גבוהה אצל חלק מהצאצאים, אך לא בכולם (ראו איור 4). המגבלה של השיטה היא שתאי גזע עובריים שהוזרקו לעובר טרום השרשה לא תמיד יכלו לתרום לתאי נבט בכימרה19,20. העברת Germline של ESCs תהיה תלויה באיכות של כל שיבוט ESC19. לכן, יהיה זה יתרון לפתח קווי שיבוט ESC מרובים כגיבוי לייצור עכברים כימריים יציבים. לסיכום, הפרוטוקולים המוצגים כאן משתמשים בווקטורי מיקוד פשוטים הכוללים רק כל זרוע הומולוגיה וגן שמעניין את KI ללא כל קלטת עמידה לתרופות. לכן, בניית הווקטור תהיה הרבה יותר קלה, וניתן יהיה לקצר את תקופת התרבות בהשוואה לטכניקת המיקוד הקונבנציונלית של ESC. זה יעזור לייצר במהירות ובהקלה סוגים שונים של עכברים מהונדסים גנטית לניתוח עתידי במדעי החיים.

ייצור עכברים מהונדסים גנטית וניתוח הפנוטיפ שלהם מאפשרים לנו להבין פונקציות גנטיות ספציפיות בפירוט, in vivo. ממצאים חשובים רבים נחשפו באמצעות מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטית בתחום מדעי החיים. יתר על כן, מאז הדו"ח של טכנולוגיית עריכת הגנום באמצעות CRISPR/Cas91, מחקר באמצעות עכברים מהונדסים גנטית התפשט במהירות למעבדות רבות 2,3. עריכת גנום של זיגוטים של עכברים על ידי CRISPR/Cas9 השיגה יעילות מקובלת לפיתוח שינוי DNA קצר, כגון נוקאאוט גנים מונחה מוטציה של אינדל4, החלפת נוקלאוטידים בודדים, או החדרת תג פפטיד קצר באמצעות אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים (ssODNs) כתורמי נוק-אין (KI)5. מצד שני, ה-KI של מקטעי דנ"א גדולים לתוך זיגוטים על ידי עריכת גנום נשאר ביעילות נמוכה בהשוואה לשינוי הדנ"א הקצר 6,7. בנוסף, קשה להשתמש בזני עכברים כמו BALB/c, שהוא זן חשוב לתחומי מחקר ספציפיים כמו אימונולוגיה, לעריכת גנום מבוססת זיגוטה מכיוון שהעוברים שלהם לפני ההשרשה רגישים למניפולציה במבחנה.
דרך נוספת לפתח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית היא להשתמש בטכניקת מיקוד תאי גזע עובריים (ESC) ואחריה הזרקת ESC לעובר טרום השרשה כדי לייצר כימרות 8,9,10, שעדיין משמשות באופן שגרתי כשיטה קונבנציונלית. למרות ששיעור הרכישה להשגת שיבוטים מדויקים של KI-ESC אינו גבוה במיוחד בשיטות מיקוד ESC קונבנציונליות, מיקוד ESC מציע כמה יתרונות בהשוואה לעריכת גנום של זיגוטה, במיוחד עבור KI DNA ארוך. לדוגמה, יעילות ה-KI של מקטעי דנ"א ארוכים (> כמה קילובייט) לתוך הגנום של הזיגוטה פחות ניכרת6,7, וזיגוטים רבים נדרשים כדי לפתח אפילו שורה אחת של עכבר KI, שאינה רצויה בפרספקטיבה הנוכחית של ניסויים בבעלי חיים. בניגוד לעריכת גנום של זיגוטה, דנ"א ארוך המכוון לתאי גזע עובריים ואחריו ייצור כימרה זקוק למספר קטן יותר של עוברים מאשר עריכת גנום של זיגוטה. יתר על כן, למרות שהעוברים טרום ההשרשה מ- BALB/c רגישים למניפולציה במבחנה, ניתן לשמור ולטפל ב- ESCs שלהם במבחנה 11 כ- ESCs מוסמכים אחרים של 129 או F1, ולכן ישימים להפקות כימרה. עם זאת, למרות שווקטור מיקוד מכיל זרועות הומולוגיות של 5' ו-3' וקלטות גנים של עמידות לתרופות לבחירה חיובית או שלילית, יעילות ה-KI הקונבנציונלית של תאי גזע עובריים בדרך כלל אינה מספקת, בגלל התדירות הגבוהה של אינטגרציה גנומית אקראית 8,10, לפיכך, נדרשת שיטה משופרת עם יעילות מיקוד ESC מדויקת. לאחרונה, דיווחנו על שיטת ESC KI מכוונת המשתמשת בעריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 כדי להשיג יעילות KI גבוהה יותר משיטות מיקודקונבנציונליות 11. השיטה שאנו מתארים כאן מבוססת על הליך זה המאפשר דנ"א ארוך (> כמה עד 10 קילובייט) KI לתאי גזע עובריים ביעילות מקובלת לעבודות שגרתיות ללא בחירת תרופות; לפיכך, הליך בניית הווקטור יהיה הרבה יותר קל ויצטרך תקופה קצרה יותר, או שגם תקופת תרבית התאים תהיה קצרה משמעותית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/c ESC</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>ESC developed from BALB/c strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>CS-02-001</td>
			<td>Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>Section 3.2 and elsewhere.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CreERT gene fragment</td>
			<td>GeneWiz</td>
			<td></td>
			<td>Section 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPR-Cas9 crisprRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1072534</td>
			<td>tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>MEF medium. Section 2.3 and elsewhere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1072534</td>
			<td>RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastGene Gel/PCR Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Section 1.1 and 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutatime substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>ASKA Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Section 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD Cloning Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639648</td>
			<td>DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JM8.A3 ESC</td>
			<td>EuMMCR</td>
			<td>-</td>
			<td>ESC developed from C57BL/6N strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock-out DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-121-D</td>
			<td>Section 6.3 and 6.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>125-05603</td>
			<td>Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Electroporation system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid Transfection-grade</td>
			<td>Takara</td>
			<td>U0490B</td>
			<td>Section 1.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>162-25291</td>
			<td>Section 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>ASKA Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Section 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail lysis buffer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>06169-95</td>
			<td>Section 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32777-15</td>
			<td>Section 2.2 and elsewhere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V6.5 ESC</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>ESC developed from B6J-129 F1 strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiation device</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>MBR-1618R-BE</td>
			<td>Section 2.6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9-mediated highly efficient gene targeting in embryonic stem cells for developing gene-manipulated mouse models

מערכת CRISPR/Cas9 אפשרה לפתח עכברים מהונדסים גנטית על ידי עריכת גנום ישירה באמצעות זיגוטים מופרים. עם זאת, אף על פי שהיעילות בפיתוח עכברי נוקאאוט גנים על ידי גרימת מוטציה קטנה של אינדל תספיק, היעילות של עריכת גנום העובר ליצירת דנ"א בגודל גדול (KI) עדיין נמוכה. לכן, בניגוד לשיטת KI הישירה בעוברים, מיקוד גנים באמצעות תאי גזע עובריים (ESCs) ולאחר מכן הזרקת עוברים לפיתוח עכברי כימרה עדיין יש מספר יתרונות (למשל, מיקוד תפוקה גבוהה במבחנה, מניפולציה מרובת אללים, ומניפולציה של גנים Cre ו - flox יכולה להתבצע בתקופה קצרה). בנוסף, זנים עם עוברים קשים לטיפול במבחנה, כגון BALB/c, יכולים לשמש גם למיקוד ESC. פרוטוקול זה מתאר את השיטה הממוטבת עבור דנ"א בגודל גדול (מספר קילובייט) KI בתאי גזע עובריים על ידי יישום עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 ולאחר מכן ייצור עכברי כימרה לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית.

התמקדנו בגנים ספציפיים ב-ESC ולאחר מכן בייצור כימרה כדי לפתח ייצור עכברים שעברו מניפולציה גנטית על פי כתב היד הקודם שלנו11. גנוטיפ ESC (המתואר בסעיף 4) מתבצע באופן שגרתי על ידי PCR באמצעות פריימרים. הפריימרים מתוכננים על רצפים גנומיים מחוץ לזרועות ההומולוגיות ועל הרצפים הספציפיים במקטע הדנ"א של KI (איור 2A). במקרה זה, אף אלל מסוג בר אינו מוגבר, בעוד שאמפליקון PCR בגודל מסוים מזוהה רק כאשר הדנ"א האקסוגני הממוקד הוא KI במוקד המטרה. תוצאות PCR מייצגות של גנוטיפ מוצגות באיור 2B. תשעה מתוך 22 שיבוטים (40.9%) הראו להקה ספציפית ל-KI במקרה זה. שלוש תוצאות מיקוד מייצגות, כולל התוצאה המוצגת באיור 2, מוצגות בטבלה 1. תוצאות אלה מצביעות על כך שהשיטה המוצגת כאן יעילה וניתנת לשחזור עבור KI גן ללא כל בחירות תרופות.
ESC נאסף בפיפטה בהזרקה, ואז נוצר חור בזונה פלוצ'ידה באמצעות פלוס פיאזואלקטרי, וה-ESC משתחרר בין התאים העובריים (איור 3). מבחינה טכנית, פרוטוקול זה להזרקת ESC לעובר בן שמונה תאים או שלב מורולה דומה לפרוטוקול להזרקת ESC לבלסטוציסט הנפוץ במתקני עכברים רבים. עכברים כימריים מייצגים מוצגים באיור 4. לצורך הערכת צבע הפרווה של כימריזם, העובר מזן ה-ICR (לבקנים, שיער לבן) שימש כמקבל B6 או B6-129 F1 ESC, ועוברי B6 שימשו כמקבלי BALB/c ESCs (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig01.jpg"> איור 1: שרטוט של שילוב פלסמיד מעגלי בתיווך CRISPR/Cas9 ריבונוקלאופרוטאין (RNP) לתוך המוקד הספציפי של גנום ESC. אלקטרופורציה מציגה פלסמיד מעגלי כווקטור מיקוד לתוך תאי גזע עובריים עם Cas9-RNP. קיצורים: GOI = גן של עניין, HA = זרוע הומולוגיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig02.jpg"> איור 2: ניתוחי PCR גנומיים לבדיקת KI של שיבוטים ממוקדים של ESC. (A) פריימרים ספציפיים ל-PCR של KI מתוכננים על רצפים גנומיים מחוץ לזרועות ההומולוגיות (קדימה) וברצפים הספציפיים במקטע הדנ"א של KI (הפוך). (B) תוצאות PCR של גנוטיפ מייצג. גנום מסוג בר שימש כבקרה שלילית. קיצורים: GOI = גן של עניין, HA = זרוע הומולוגיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig03.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות של הזרקת עובר בשלב שמונה תאים. (A) עבור מיקרו-הזרקה, שלושה כפילים של תאי גזע עובריים (שישה תאים, ראשי חץ) נאספים. (B) חור בזונה פלוצ'ידה נוצר עם פולס פיאזואלקטרי, ותאי גזע עובריים מגורשים בין כל בלסטומר. סרגל קנה המידה המוצג הוא 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig04.jpg"> איור 4: תמונות מייצגות של עכברי כימרה. (A,B) ה-ESC נגזר מ-C57BL/6N (JM8). A3, שיער אגוטי; A) או B6-129 F1 (שיער אגוטי; B) מוזרקים לעוברי ICR (לבקנים, שיער לבן), ולאחר מכן מעבירים את העוברים לפונדקאיות האם. (C) ה-ESC שמקורו ב-BALB/c (לבקנים, שיער לבן) מוזרק לעוברי C57BL/6J (שיער שחור), ולאחר מכן מעביר את העוברים לפונדקאיות אם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מזהה פרויקט</td>
			<td>כורומוזום</td>
			<td>אורך 5'HA (bp)</td>
			<td>אורך 3'HA (bp)</td>
			<td>הוספת גודל (bp)</td>
			<td>מספר השיבוטים שנותחו</td>
			<td>מספר שיבוטים של KI</td>
			<td>יעילות (%)</td>
			<td>הערות</td>
		</tr><tr><td>R26-CC*</td>
			<td>Chr6</td>
			<td>965</td>
			<td>1006</td>
			<td>5321</td>
			<td>23</td>
			<td>2</td>
			<td>8.7%</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>₪10-03*</td>
			<td>Chr8</td>
			<td>1000</td>
			<td>997</td>
			<td>3070</td>
			<td>22</td>
			<td>6</td>
			<td>27.3%</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>P4-01*</td>
			<td>Chr15</td>
			<td>1000</td>
			<td>1000</td>
			<td>2569</td>
			<td>22</td>
			<td>9</td>
			<td>40.9%</td>
			<td>מוצג באיור 2</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: יעילות KI בשלושה מוקדים גנומיים עצמאיים ב-ESC. *פרויקטים אלה לא פורסמו עד כה. שמם של גנים אלה ייחשף בכתבי יד עצמאיים בעתיד.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models at JoVE.com

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

ייצור עכברים מהונדסים גנטית וניתוח הפנוטיפ שלהם מאפשרים לנו להבין פונקציות גנטיות ספציפיות בפירוט, in vivo. ממצאים חשובים רבים נחשפו באמצעות מודלים של בעלי חיים שעברו שינוי גנטי. השיטה שאנו מתארים כאן מאפשרת לדנ"א ארוך להשתיל תאי גזע ביעילות מקובלת ללא בחירת תרופות.הטכניקה מועילה לא רק למדעי החיים הבסיסיים, אלא שהממצאים ייושמו גם במדעים יישומיים כמו מדע הרפואה ומדעי בעלי החיים. מי שידגימו את ההליך יהיו ד"ר צ'יהירו אמורי, פרופסור עוזר, וד"ר מנאבו אוזאווה, פרופסור חבר מהמעבדה שלי. לאחר הכנת הפיברובלסט העוברי של העכבר, מכינים את צלחת תרבית התאים המצופה בג'לטין כמתואר בכתב היד ודוגרים אותה במשך שעתיים באינקובטור לח.הסר את תמיסת הג'לטין, לשטוף את המנה פעמיים עם PBS, ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר עד לשימוש. הפשרת מלאי MEF קפוא ללא פעילות מיטוטית באמצעות אמבט מים ממוזג בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. יום אחד לפני זריעת ESC, הניחו את ה-MEF על צלחת מצופה ג'לטין בקוטר 60 מילימטרים.הפשירו שפופרת מלאי ESC קפואה כפי שהוצג קודם לכן והניחו פעם אחת 10 לתאי ה-ESC החמישים על צלחת בקוטר 60 מילימטרים המכילה MEF שנזרע מראש. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של תרבית ESC מדיום ודגרה על המנה עד שה-ESC מגיע ל-50 עד 70% מפגש. לאחר שטיפת ESC מתורבת עם ארבעה מיליליטר של PBS, לעכל אותם עם 800 microliters של 0.25% טריפסין EDTA פתרון במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר שהטריפסין מושתק עם מיליליטר אחד של ESCM, מוסיפים מיליליטר אחד של ESCM טרי לתאים, מעבירים את המדיום לצינור, ופולטים את התאים על ידי צנטריפוגה ב-280 גרם למשך חמש דקות. לאחר החייאת התאים במיליליטר אחד של ESCM טרי, ספרו את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים עם כתם כחול טריפאן. לאחר העברת פעם אחת 10 לתאי הגזע העובריים החמישי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ושטיפתם שלוש פעמים עם PBS על ידי צנטריפוגה, יש להשעות את גלולת ה-ESC ב-12 מיקרוליטרים של תערובת דנ"א Cas9 RNP ולערבב היטב על ידי פיפטינג עדין כדי למנוע מבעבע.לאחר מכן, לשרת את ESC מושעה עבור אלקטרופורציה. לאחר מכן, תרבו את תאי הגזע העובריים האלקטרופולטיביים בצלחת של 60 מילימטר המכילה ארבעה מיליליטרים של ECSM עם MEF שאינו פעיל מיטוטית והמשיכו לשנות את המדיום מדי יום. שלושה עד חמישה ימים לאחר האלקטרופורציה, לשטוף את תאי גזע עובריים עם ארבעה מיליליטר של PBS ואז לעכל אותם עם 800 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA ותרבית באינקובטור לח.לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של ESCM כדי להפסיק את עיכול טריפסין. לאחר שתערובת התאים מתרוקנת, יש לתלות את הכדור במיליליטר אחד של ESCM טרי ולספור את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים עם כתם כחול טריפאן. מעבירים את תאי הגזע העובריים באופן חד פעמי 10 לתאים השלישיים לכל צלחת של 60 מילימטר המכילה ESCM ו-MEF מזין.הקפידו להחליף את המדיום עד שהמושבה תתרומם. חמישה עד שבעה ימים לאחר המעבר הראשון, ברגע שה-ESCM שואף מצלחת התרבית של ESC, הוסיפו ארבעה מיליליטר של PBS. באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר, לאסוף מושבות ESC בודדות עם חמישה מיקרוליטרים של PBS תחת סטריאומיקרוסקופ.מניחים את המושבות הבודדות בבאר של צלחת 96 באר בעלת תחתית עגולה המכילה 15 מיקרוליטרים של תמיסת EDTA של 0.25% טריפסין. לאחר דגירה של צלחת 96 באר, להפסיק את העיכול טריפסין על ידי הוספת 80 microliters של ESCM וניתוק מושבות ESC לתוך תאים בודדים על ידי פיפט. עבור גנוטיפ PCR, העבר 40 מיקרוליטרים של תרחיף ESC לצלחת מצופה ג'לטין, ללא מזין, 96 באר המכילה 50 מיקרוליטר של ESCM לכל באר.כדי להפוך את מלאי ה-ESC הקפוא, העבירו את 60 המיקרוליטרים הנותרים של מתלי ESC לבאר של צלחת 24 בארות מצופה ג'לטין המכילה 500 מיקרוליטרים של ESCM ו-MEF מזין. שיבוטים בודדים של ESC שגודלו בתרבית בצלחת של 24 בארות עד שהם מגיעים למפגש של 60% עד 80% ומשחזרים שיבוטים בודדים של ESC על ידי טריפסיניזציה, כפי שהוכח קודם לכן. לאחר קבלת כדור התא על ידי צנטריפוגה, להשעות את 500 microliters של מדיום הקפאת תאים כדי להקפיא את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס.עבור גנוטיפ PCR, תרבית ESC משתבטת כפי שהוכח קודם לכן ומסירה ESCM מכל באר על ידי שאיפה לפני שטיפתה עם 100 מיקרוליטרים של PBS פעמיים. לאחר שאיפת ה-PBS, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס המכיל פרוטאינאז K וערבבו היטב. כעת מעבירים את ה-ESC לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ושומרים אותו בתא חום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.לאחר שהדנ"א הגנומי מומס ב-20 מיקרוליטרים של מים נטולי DNase, קבע את הטוהר והריכוז של הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר ביצוע PCR גנומי באמצעות ערכות פריימרים ספציפיות ללוקוס כדי להגביר את אזור המטרה, בדוק את הרצף ובחר את שיבוטי ESC עם רצפי הדפיקה הרצויים. לאחר הזדווגות הנקבות שטופלו בהורמון עם זכרי ה- ICR ואיסוף האובידוקט, הנח את האובידוקט שנאסף בטיפות FHM ושחזר את העוברים בעלי שני התאים או ארבעת התאים על ידי שטיפת האובידוקט עם FHM באמצעות מחט שטיפה המוחדרת לאינפונדיבולום.שטפו את העוברים שנאספו על ידי העברתם למספר טיפות FHM טריות באמצעות פיפטה לפה. תרבית את העוברים ב-50 מיקרוליטרים של טיפות KSOM על צלחת תרבית תאים בקוטר 35 מילימטר מכוסה בשמן מינרלי כפי שהוכח קודם לכן במשך יום אחד עד להגעה לשלב שמונת התאים או המורולה. הכינו פיפטות זכוכית להחזקת העוברים והזרקת ESC באמצעות משיכה ומיקרופורג'.לאחר שילוב פיפטה החזקה המכילה FHM לתוך מחזיק נימי המחובר למיקרו-אינז'קטור, הניחו אותו בצד שמאל של המיקרומניפולטור. חבר פיפטה הזרקה למיקרו-אינז'קטור אחר והגדר אותו בצד ימין. יישרו את שתי הפיפטות ישר בשדה התצוגה של המיקרוסקופ.הכינו טיפות של חמישה מיקרוליטרים של 12% פוליוויניל פירולידון וטיפות של חמישה מיקרוליטרים של FHM על אותו מכסה של צלחת של 60 מילימטר, זו לצד זו. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי. העבירו את העוברים בחמישה מיקרוליטרים של טיפת FHM והוסיפו אחד עד חמישה מיקרוליטרים של מתלה ESC לטיפת ה-FHM המכילה את העובר.לאחר שטיפת פיפטה ההזרקה בפוליוויניל פירולידון, העבירו את פיפטה ההזרקה לטיפה המכילה את העוברים והמחלות העובריות. בחר שלושה כפילי ESC בודדים שזה עתה סיימו את חלוקת התאים שלהם בפיפטת ההזרקה. באמצעות פיפטה החזקה, להחזיק עובר בן שמונה תאים או שלב מורולה אשר השלים דחיסה על ידי שאיפה ולעשות חור ב zona pellucida עם פולס piezoelectric.לגרש את ה-ESC בעל ששת התאים בתוך הזונה פלוצ'ידה ולשלוף את הפיפטה מתוך העוברים. שטפו את העוברים המוזרקים על ידי ESC עם מספר טיפות KSOM בעדינות באמצעות פיפטה בפה ודגרו אותם בטיפת KSOM חדשה של 50 מיקרוליטר מכוסה בשמן מינרלי, כפי שהוכח קודם לכן, עד שהעוברים התפתחו לשלב הבלסטוציסט. מתקבל אמפליקון PCR בגודל ספציפי ליעד הדפיקה ו-9 מתוך 22 שיבוטים הראו פס ספציפי לדפיקה.תוצאות אלה יעילות וניתנות לשחזור עבור דפיקות גנים ללא כל בחירות של תרופות. איסוף הגודל האופטימלי של מושבות ESC הוא די חשוב עבור הליך זה. הימנעו מבחירת מושבות גדולות מדי או קטנות מדי.עריכת גנום ישירה בתיווך CRISPR Cas9 באמצעות זיגוטה תהיה ישימה ליצירת עכברי נוקאאוט גנים פשוטים. פרוטוקול מיקוד גנים ESC זה בתיווך CRISPR Cas9 מאפשר ייצור של עכברים מהונדסים גנטית שונים לניתוח עתידי במדעי החיים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...