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August 24th, 2022
DOI :
August 24th, 2022
•1:06
Gene Targeting of Embryonic Stem Cells (ESCs)
4:16
PCR Genotyping of Targeted ESCs
7:02
Preparation of Eight-Cell Stage Embryo and Microinjection of ESCs
9:49
Results: Screening of Targeted ESC Clones
10:10
Conclusion
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Introduction
Transcript
आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उत्पादन करना और उनके फेनोटाइप का विश्लेषण करना हमें विवो में विशिष्ट जीन कार्यों को विस्तार से समझने में सक्षम बनाता है। जीन-संशोधित पशु मॉडल का उपयोग करके कई महत्वपूर्ण निष्कर्षों को उजागर किया गया है। यहां हम जिस विधि का वर्णन करते हैं, वह लंबे डीएनए को दवा चयन के बिना स्वीकार्य दक्षता के साथ स्टेम कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने में सक्षम बनाता है।
तकनीक न केवल बुनियादी जीवन विज्ञान के लिए फायदेमंद है, बल्कि निष्कर्षों को चिकित्सा विज्ञान और पशु विज्ञान जैसे लागू विज्ञानों में भी लागू किया जाएगा। प्रक्रिया का प्रदर्शन एक सहायक प्रोफेसर डॉ चिहिरो एमोरी और मेरी प्रयोगशाला के एक एसोसिएट प्रोफेसर डॉ मनाबू ओजावा करेंगे। माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट तैयार करने के बाद, पांडुलिपि में वर्णित जिलेटिन-लेपित सेल कल्चर डिश तैयार करें और इसे आर्द्र इनक्यूबेटर में दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
जिलेटिन समाधान को हटा दें, पकवान को पीबीएस के साथ दो बार धोएं, और उपयोग होने तक इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें। एक मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टेम्पर्ड वाटर बाथ का उपयोग करके माइटोटिक रूप से निष्क्रिय जमे हुए एमईएफ स्टॉक को पिघलाएं। ईएससी सीडिंग से एक दिन पहले, एमईएफ को जिलेटिन-लेपित 60-मिलीमीटर डिश पर रखें।
पहले दिखाए गए अनुसार एक जमे हुए ईएससी स्टॉक ट्यूब को पिघलाएं और पूर्व-बीज वाले एमईएफ युक्त 60 मिलीमीटर डिश पर 10 से पांचवें ईएससी को एक बार रखें। फिर, ईएससी संस्कृति माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें और डिश को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि ईएससी 50 से 70% कन्फ्लुएंसी तक न पहुंच जाए। सुसंस्कृत ईएससी को चार मिलीलीटर पीबीएस से धोने के बाद, उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन ईडीटीए समाधान के 800 माइक्रोलीटर के साथ पचाएं।
एक बार ट्रिप्सिन को ईएससीएम के एक मिलीलीटर के साथ निष्क्रिय कर दिया जाता है, तो कोशिकाओं में एक मिलीलीटर ताजा ईएससीएम जोड़ें, माध्यम को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें, और पांच मिनट के लिए 280 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को पेलेट करें। ताजा ईएससीएम के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के बाद, ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें। पांचवें ईएससी को एक नए 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में एक बार 10 बार स्थानांतरित करने और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, ईएससी गोली को कैस 9 आरएनपी डीएनए मिश्रण के 12 माइक्रोलीटर में फिर से निलंबित करें और बुदबुदाने से बचने के लिए कोमल पिपेटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
फिर, इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए निलंबित ईएससी की सेवा करें। इसके बाद, इलेक्ट्रोपोरेट किए गए ईएससी को 60 मिलीमीटर के पकवान में कल्चर करें जिसमें चार मिलीलीटर ईसीएसएम होता है, जिसमें माइटोटिक रूप से निष्क्रिय एमईएफ होता है और दैनिक माध्यम बदलते रहते हैं। इलेक्ट्रोपोरेशन के तीन से पांच दिन बाद, ईएससी को चार मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो लें, फिर उन्हें आर्द्र इनक्यूबेटर में 0.25% ट्रिप्सिन ईडीटीए और कल्चर के 800 माइक्रोलीटर के साथ पचाएं।
बाद में, ट्रिप्सिन पाचन को रोकने के लिए ईएससीएम के दो मिलीलीटर जोड़ें। एक बार सेल मिश्रण को छर्रेट करने के बाद, गोली को ताजा ईएससीएम के एक मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें और ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें। ईएससी को प्रति 60 मिलीमीटर डिश में तीसरी कोशिकाओं में एक बार 10 गुना पारित करें जिसमें ईएससीएम और फीडर एमईएफ शामिल हैं।
कॉलोनी के जोर पकड़ने तक माध्यम बदलना सुनिश्चित करें। पहले मार्ग के पांच से सात दिन बाद, एक बार जब ईएससीएम को ईएससी संस्कृति डिश से एस्पिरेटेड किया जाता है, तो पीबीएस के चार मिलीलीटर जोड़ें। 20-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पीबीएस के पांच माइक्रोलीटर के साथ एकल ईएससी कॉलोनियों को उठाएं।
अलग-अलग कॉलोनियों को गोल-नीचे 96-वेल प्लेट के एक कुएं में रखें जिसमें 0.25% ट्रिप्सिन ईडीटीए समाधान के 15 माइक्रोलीटर हों। 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद, ईएससीएम के 80 माइक्रोलीटर जोड़कर ट्रिप्सिन पाचन को रोकें और पाइपिंग द्वारा ईएससी कॉलोनियों को एकल कोशिकाओं में अलग करें। पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए, ईएससी निलंबन के 40 माइक्रोलीटर को जिलेटिन-लेपित, फीडर-मुक्त, 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें प्रति ईएससीएम के 50 माइक्रोलीटर हों।
जमे हुए ईएससी स्टॉक को बनाने के लिए, ईएससी निलंबन के शेष 60 माइक्रोलीटर को जिलेटिन-लेपित 24-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें ईएससीएम और फीडर एमईएफ के 500 माइक्रोलीटर हों। स्टॉक व्यक्तिगत ईएससी क्लोन 24-वेल प्लेट में सुसंस्कृत होते हैं जब तक कि वे 60 से 80% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाते हैं और ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा व्यक्तिगत ईएससी क्लोन को पुनर्प्राप्त करते हैं, जैसा कि पहले दिखाया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल पेलेट प्राप्त करने के बाद, कोशिकाओं को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करने के लिए सेल फ्रीजिंग माध्यम के 500 माइक्रोलीटर को फिर से निलंबित करें।
पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए, ईएससी क्लोन को कल्चर करें जैसा कि पहले दिखाया गया था और पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोने से पहले आकांक्षा द्वारा प्रत्येक कुएं से ईएससीएम को हटा दें। पीबीएस को एस्पिरेटेड करने के बाद, प्रोटीन के युक्त लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। अब ईएससी लाइसेट को एक नए 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे कम से कम एक घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी कक्ष में रखें।
एक बार जब जीनोमिक डीएनए डीएनए को डीनेस-मुक्त पानी के 20 माइक्रोलीटर में भंग कर दिया जाता है, तो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए की शुद्धता और एकाग्रता निर्धारित करें। लक्ष्य क्षेत्र को बढ़ाने के लिए लोकस-विशिष्ट प्राइमर सेट का उपयोग करके जीनोमिक पीसीआर करने के बाद, अनुक्रम की जांच करें और वांछित नॉक-इन अनुक्रमों के साथ ईएससी क्लोन चुनें। हार्मोन ने आईसीआर पुरुषों के साथ महिलाओं का इलाज करने और डिंबवाहिनी को इकट्ठा करने के बाद, एकत्र किए गए डिंबवाहिनी को एफएचएम बूंदों में रखें और दो-सेल या चार-सेल चरण भ्रूण को एफएचएम के साथ फ्लश करके इनफंडिबुलम में डाली गई फ्लशिंग सुई का उपयोग करके ओविडक्ट को ठीक करें।
एकत्र किए गए भ्रूण को मुंह के पिपेट का उपयोग करके कई ताजा एफएचएम बूंदों में ले जाकर धोएं। केएसओएम के 50 माइक्रोलीटर में भ्रूण खनिज तेल से ढके 35-मिलीमीटर सेल कल्चर डिश पर गिरता है जैसा कि आठ-सेल या मोरुला चरण तक पहुंचने तक एक दिन के लिए पहले प्रदर्शित किया गया था। पुलर और माइक्रोफोर्ज का उपयोग करके भ्रूण और ईएससी इंजेक्शन को पकड़ने के लिए ग्लास पिपेट तैयार करें।
एफएचएम युक्त होल्डिंग पिपेट को माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े केशिका धारक में एकीकृत करने के बाद, इसे माइक्रोमैनिपुलेटर के बाईं ओर स्थापित करें। एक इंजेक्शन पिपेट को दूसरे माइक्रोइंजेक्टर से कनेक्ट करें और इसे दाईं ओर सेट करें। माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में सीधे दो पिपेट संरेखित करें।
60 मिलीमीटर डिश के एक ही ढक्कन पर 12% पॉलीविनाइल पाइरोलिडोन की पांच-माइक्रोलीटर बूंदें और एफएचएम की पांच-माइक्रोलीटर बूंदें बनाएं। बूंदों को खनिज तेल से ढक दें। भ्रूण को एफएचएम ड्रॉप के पांच माइक्रोलीटर में स्थानांतरित करें और भ्रूण युक्त एफएचएम ड्रॉप में ईएससी निलंबन के एक से पांच माइक्रोलीटर जोड़ें।
एक बार जब इंजेक्शन पिपेट को पॉलीविनाइल पाइरोलिडोन के साथ धोया जाता है, तो इंजेक्शन पिपेट को भ्रूण और ईएससी युक्त बूंद पर ले जाएं। तीन अलग-अलग ईएससी डबल्स चुनें जिन्होंने इंजेक्शन पिपेट में अपना सेल डिवीजन समाप्त कर दिया है। होल्डिंग पिपेट का उपयोग करके, एक आठ-सेल या मोरुला चरण भ्रूण को पकड़ें जिसने आकांक्षा द्वारा संघनन पूरा कर लिया है और पीजोइलेक्ट्रिक पल्स के साथ ज़ोना पेलुसीडा में एक छेद करें।
ज़ोना पेलुसीडा के अंदर छह-कोशिका वाले ईएससी को निष्कासित करें और पिपेट को भ्रूण से बाहर निकालें। ईएससी-इंजेक्शन वाले भ्रूण को कई केएसओएम बूंदों के साथ मुंह के पिपेट का उपयोग करके धीरे से धोएं और उन्हें खनिज तेल से ढके एक नए 50-माइक्रोलीटर केएसओएम ड्रॉप में इनक्यूबेट करें, जैसा कि पहले दिखाया गया था, जब तक कि भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट चरण में विकसित न हो जाए। नॉक-इन लक्ष्य के लिए विशिष्ट आकार का एक पीसीआर एम्प्लिकॉन प्राप्त किया जाता है और 22 क्लोनों में से 9 ने नॉक-इन-विशिष्ट बैंड दिखाया।
ये परिणाम किसी भी दवा चयन के बिना जीन नॉक-इन के लिए कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं। ईएससी कॉलोनियों के इष्टतम आकार को उठाना इस प्रक्रिया के लिए काफी महत्वपूर्ण है। उन कॉलोनियों का चयन करने से बचें जो बहुत बड़ी या बहुत छोटी हैं।
CRISPR Cas9-मध्यस्थता प्रत्यक्ष जीनोम संपादन एक युग्मनज का उपयोग करके सरल जीन नॉकआउट चूहों को बनाने के लिए लागू होगा। यह CRISPR Cas9-मध्यस्थता ईएससी जीन लक्ष्यीकरण प्रोटोकॉल जीवन विज्ञान में भविष्य के विश्लेषण के लिए विभिन्न आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उत्पादन की सुविधा प्रदान करता है।
यहां हम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, खासकर बड़े डीएनए नॉक-इन (केआई) के लिए। इस प्रोटोकॉल को CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके ट्यून किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक समरूप पुनर्संयोजन-मध्यस्थता रैखिक डीएनए लक्ष्यीकरण विधि की तुलना में केआई दक्षता में काफी सुधार हुआ है।
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