遺伝子改変マウスを作製し、その表現型を解析することで、生体内で特定の遺伝子機能を詳細に理解することができます。遺伝子改変動物モデルを用いて、数多くの重要な知見が明らかにされている。ここで説明する方法は、長いDNAが薬物選択なしで許容可能な効率で幹細胞を移植することを可能にする。
この手法は、基礎生命科学だけでなく、医学や動物科学などの応用科学にも実装されます。手順のデモンストレーションは、助教の江森千尋先生と、私の研究室の小澤学准教授です。マウス胚性線維芽細胞を調製した後、原稿に記載されているようにゼラチンコート細胞培養皿を調製し、湿潤インキュベーター内で2時間インキュベートする。
ゼラチン溶液を取り出し、PBSで皿を2回洗浄し、使用するまで室温で保存します。有糸分裂的に不活性化された凍結MEFストックを、摂氏37度で1分間焼き戻した水浴を使用して解凍します。ESCシードの1日前に、ゼラチンでコーティングされた60ミリメートルの皿にMEFを置きます。
前に示したように冷凍ESCストックチューブを解凍し、事前にシードされたMEFを含む60ミリメートルの皿に10〜5番目のESCを1回置きます。次に、4ミリリットルのESC培養培地を追加し、ESCが50〜70%コンフルエンシーに達するまでディッシュをインキュベートします。培養したESCを4ミリリットルのPBSで洗浄した後、800マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液で摂氏37度で5分間消化します。
トリプシンが1ミリリットルのESCMで不活性化されたら、1ミリリットルの新鮮なESCMを細胞に加え、培地をチューブに移し、280Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。細胞を1ミリリットルの新鮮なESCMに再懸濁した後、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを用いて細胞濃度を計数する。10〜5番目のESCを新しい1.5ミリリットルのチューブに1回移し、遠心分離によってPBSで3回洗浄した後、ESCペレットを12マイクロリットルのCas9 RNP DNA混合物に再懸濁し、泡立ちを避けるために穏やかなピペッティングでよく混合します。
次に、懸濁したESCをエレクトロポレーションに提供します。次に、有糸分裂不活化MEFを含む4ミリリットルのECSMを含む60ミリメートルディッシュでエレクトロポレーションされたESCを培養し、培地を毎日交換し続けます。エレクトロポレーションの3〜5日後に、ESCを4ミリリットルのPBSで洗浄し、800マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTAで消化し、湿度の高いインキュベーターで培養します。
その後、2ミリリットルのESCMを加えてトリプシン消化を停止します。細胞混合物がペレット化されたら、ペレットを1ミリリットルの新鮮なESCMに再懸濁し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを使用して細胞濃度をカウントします。ESCMおよびフィーダーMEFを含むディッシュ10個あたり60ミリメートルディッシュにつき10個目にESCを継代する。
コロニーが回復するまで、必ず培地を交換してください。最初の継代から5〜7日後、ESCMをESC培養皿から吸引したら、4ミリリットルのPBSを追加します。20マイクロリットルのピペットを使用して、実体顕微鏡下で5マイクロリットルのPBSを含む単一のESCコロニーをピックアップします。
個々のコロニーを、15マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液を含む丸底96ウェルプレートのウェルに入れます。96ウェルプレートをインキュベートした後、80マイクロリットルのESCMを添加し、ピペッティングによってESCコロニーを単一細胞に解離させることで、トリプシン消化を停止します。PCRジェノタイピングでは、40マイクロリットルのESC懸濁液を、ウェルあたり50マイクロリットルのESCMを含むゼラチンコーティングされたフィーダーフリーの96ウェルプレートに移します。
凍結ESCストックを作るには、残りの60マイクロリットルのESC懸濁液を、500マイクロリットルのESCMとフィーダーMEFを含むゼラチンコーティングされた24ウェルプレートのウェルに移します。24ウェルプレートで培養した個々のESCクローンを60〜80%のコンフルエンシーに達するまでストックし、前述のようにトリプシン処理によって個々のESCクローンを回収します。遠心分離により細胞ペレットを得た後、500マイクロリットルの細胞凍結培地に再懸濁し、マイナス80°Cで細胞を凍結させた。
PCRジェノタイピングでは、前述のようにESCクローンを培養し、吸引によって各ウェルからESCMを除去してから、100マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。PBSを吸引した後、プロテイナーゼKを含む溶解バッファー100マイクロリットルを加えてよく混合します。次に、ESCライセートを新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏65度のヒートチャンバーに少なくとも1時間保管します。
ゲノムDNAを20マイクロリットルのDNaseフリー水に溶解したら、分光光度計を使用してDNAの純度と濃度を決定します。遺伝子座特異的プライマーセットを使用してゲノムPCRを実行して標的領域を増幅した後、配列を確認し、目的のノックイン配列を持つESCクローンを選択します。ホルモン処理された雌とICR雄を交配させ、卵管を採取した後、採取した卵管をFHMドロップに入れ、眼底に挿入されたフラッシング針を用いてFHMで卵管を洗い流すことで、2細胞または4細胞期の胚を回収します。
収集した胚をマウスピペットを使用していくつかの新鮮なFHMドロップに移して洗浄します。50マイクロリットルのKSOMドロップで胚を、8細胞または桑実胚期に達するまで1日間、鉱油で覆われた35ミリメートルの細胞培養皿で培養します。胚を保持するためのガラスピペットを準備し、プーラーとマイクロフォージを使用してESC注射を行います。
マイクロインジェクターに接続されたキャピラリーホルダーにFHMを含む保持ピペットを組み込んだ後、マイクロマニピュレーターの左側に設置します。インジェクションピペットを別のマイクロインジェクターに接続し、右側に設置します。2つのピペットを顕微鏡の視野にまっすぐ合わせます。
5マイクロリットルの12%ポリビニルピロリドンと5マイクロリットルのFHMの滴を60ミリメートルの皿の同じ蓋に並べて作ります。滴を鉱油で覆います。胚を5マイクロリットルのFHMドロップに移し、1〜5マイクロリットルのESC懸濁液を胚含有FHMドロップに加える。
インジェクションピペットをポリビニルピロリドンで洗浄したら、インジェクションピペットを胚とESCを含むドロップに移動します。インジェクションピペットで細胞分裂を終えたばかりの3つのESCダブレットを選びます。保持ピペットを使用して、吸引による締固めが完了した8細胞または桑実胚を保持し、圧電パルスで透明帯に穴を開けます。
透明帯内の6細胞ESCを排出し、ピペットを胚から引き出します。ESCを注入した胚をマウスピペットを使用して数個のKSOMドロップで穏やかに洗浄し、前述のように、胚が胚盤胞段階に発達するまで、鉱油で覆われた新しい50マイクロリットルのKSOMドロップでインキュベートします。ノックインターゲットに特異的なサイズのPCRアンプリコンが得られ、22クローン中9クローンがノックイン特異的バンドを示した。
これらの結果は、薬物選択なしで遺伝子ノックインに対して効率的かつ再現性があります。ESCコロニーの最適なサイズを拾うことは、この手順にとって非常に重要です。大きすぎたり小さすぎたりするコロニーの選択は避けてください。
接合子を用いたCRISPR Cas9を介した直接ゲノム編集は、単純な遺伝子ノックアウトマウスの作製に適用可能である。このCRISPR Cas9を介したESC遺伝子ターゲティングプロトコルは、ライフサイエンスにおける将来の解析のために、さまざまな遺伝子改変マウスの作製を容易にします。
