3.2K Views
•
10:57 min
•
August 24th, 2022
DOI :
August 24th, 2022
•1:06
Gene Targeting of Embryonic Stem Cells (ESCs)
4:16
PCR Genotyping of Targeted ESCs
7:02
Preparation of Eight-Cell Stage Embryo and Microinjection of ESCs
9:49
Results: Screening of Targeted ESC Clones
10:10
Conclusion
0:04
Introduction
Transcript
Å produsere genmodifiserte mus og analysere deres fenotype gjør det mulig for oss å forstå spesifikke genfunksjoner i detalj, in vivo. Mange viktige funn har blitt avdekket ved hjelp av genmodifiserte dyremodeller. Metoden vi beskriver her gjør det mulig for langt DNA å implantere stamceller med akseptabel effektivitet for uten legemiddelvalg.
Teknikken er gunstig ikke bare for grunnleggende livsvitenskap, men funnene vil også bli implementert i anvendt vitenskap som medisinsk vitenskap og dyrevitenskap. Demonstrere prosedyren vil være Dr.Chihiro Emori, en assisterende professor, og Dr.Manabu Ozawa, en lektor fra laboratoriet mitt. Etter å ha forberedt musens embryonale fibroblast, tilbered den gelatinbelagte cellekulturskålen som beskrevet i manuskriptet og inkuber den i to timer i en fuktig inkubator.
Fjern gelatinoppløsningen, vask oppvasken to ganger med PBS, og oppbevar den ved romtemperatur til bruk. Tine mitotisk inaktivert frossen MEF-lager ved hjelp av et vannbad temperert ved 37 grader Celsius i ett minutt. En dag før ESC-såing, legg MEF på en gelatinbelagt 60 millimeter tallerken.
Tine et frosset ESC-lagerrør som vist tidligere, og plasser en gang 10 til femte ESC på en 60 millimeter tallerken som inneholder forhåndsfrøet MEF. Tilsett deretter fire milliliter ESC-kulturmedium og inkuber parabolen til ESC når 50 til 70% sammenløp. Etter å ha vasket den dyrkede ESC med fire milliliter PBS, fordøye dem med 800 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-løsning i fem minutter ved 37 grader Celsius.
Når trypsinet er inaktivert med en milliliter ESCM, tilsett en milliliter fersk ESCM til cellene, overfør mediet til et rør og pellet cellene ved sentrifugering ved 280 G i fem minutter. Etter å ha resuspendert cellene i en milliliter fersk ESCM, teller du cellekonsentrasjonen ved hjelp av en celleteller med trypanblå farging. Etter å ha overført en gang 10 til den femte ESC-en til et nytt 1,5 milliliter rør og vasket dem tre ganger med PBS ved sentrifugering, resuspender ESC-pelleten i 12 mikroliter Cas9 RNP DNA-blanding og bland godt ved forsiktig pipettering for å unngå bobler.
Server deretter den suspenderte ESC for elektroporering. Deretter dyrker du de elektroporerte ESC-ene i en 60 millimeter tallerken som inneholder fire milliliter ECSM med mitotisk inaktivert MEF og fortsetter å bytte medium daglig. Tre til fem dager etter elektroporeringen, vask ESC-ene med fire milliliter PBS og fordøy dem deretter med 800 mikroliter 0,25% trypsin EDTA og kultur i en fuktig inkubator.
Etterpå legger du til to milliliter ESCM for å stoppe trypsinfordøyelsen. Når celleblandingen er pelletert, resuspenderer pelleten i en milliliter fersk ESCM og teller cellekonsentrasjonen ved hjelp av en celleteller med trypanblå farging. Passasje ESC-ene på en gang 10 til de tredje cellene per 60 millimeter tallerken som inneholder ESCM og mater MEF.
Sørg for å bytte medium til kolonien tar seg opp. Fem til syv dager etter den første passasjen, når ESCM er aspirert fra ESC-kulturskålen, tilsett fire milliliter PBS. Bruk en 20-mikroliter pipette, plukk opp enkle ESC-kolonier med fem mikroliter PBS under et stereomikroskop.
Plasser de enkelte koloniene i en brønn med en rundbunnet 96-brønnplate som inneholder 15 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-løsning. Etter å ha inkubert 96-brønnsplaten, stopp trypsinfordøyelsen ved å tilsette 80 mikroliter ESCM og dissosiere ESC-kolonier i enkeltceller ved pipettering. For PCR-genotyping, overfør 40 mikroliter ESC-suspensjon til en gelatinbelagt, materfri, 96-brønnplate som inneholder 50 mikroliter ESCM per brønn.
For å lage den frosne ESC-bestanden, overfør de resterende 60 mikroliterne ESC-suspensjon til en brønn av en gelatinbelagt 24-brønns plate som inneholder 500 mikroliter ESCM og mater MEF. Lager individuelle ESC-kloner dyrket i 24-brønnsplaten til de når 60 til 80% sammenløp og gjenoppretter individuelle ESC-kloner ved trypsinisering, som vist tidligere. Etter å ha oppnådd cellepelleten ved sentrifugering, resuspender i 500 mikroliter cellefrysemedium for å fryse cellene ved minus 80 grader Celsius.
For PCR-genotyping, kultur ESC-kloner som vist tidligere og fjern ESCM fra hver brønn ved aspirasjon før du vasker den med 100 mikroliter PBS to ganger. Etter å ha aspirert PBS, tilsett 100 mikroliter lysisbuffer som inneholder proteinase K og bland godt. Overfør nå ESC-lysatet til et nytt 1, 5 milliliter rør og hold det i et varmekammer ved 65 grader Celsius i minst en time.
Når det genomiske DNA er oppløst i 20 mikroliter DNase-fritt vann, bestemmer renheten og konsentrasjonen av DNA ved hjelp av et spektrofotometer. Etter å ha utført genomisk PCR ved hjelp av lokusspesifikke primersett for å forsterke målområdet, sjekk sekvensen og velg ESC-klonene med de ønskede knock-in-sekvensene. Etter å ha parret de hormonbehandlede hunnene med ICR-hannene og samlet ovidukten, plasser de oppsamlede oviduktene i FHM-dråper og gjenopprett tocellede eller firecellede embryoer ved å skylle ovidukten med FHM ved hjelp av en spylenål satt inn i infundibulumet.
Vask de innsamlede embryoene ved å flytte dem inn i flere friske FHM-dråper ved hjelp av en munnpipette. Kultur embryoene i 50 mikroliter KSOM faller på en 35 millimeter cellekulturskål dekket med mineralolje som demonstrert tidligere i en dag til åtte-celle- eller morula-scenen er nådd. Forbered glasspipetter for å holde embryoene og ESC-injeksjon ved hjelp av en avtrekker og mikroforge.
Etter å ha integrert en holdepipette som inneholder FHM i en kapillærholder koblet til en mikroinjektor, sett den opp på venstre side av mikromanipulatoren. Koble en injeksjonspipette til en annen mikroinjektor og sett den opp på høyre side. Juster de to pipettene rett i mikroskopets synsfelt.
Lag fem mikroliter dråper 12% polyvinylpyrrolidon og fem mikroliter dråper FHM på samme lokk på en 60 millimeter tallerken, side om side. Dekk dråpene med mineralolje. Overfør embryoene i fem mikroliter FHM-dråpe og tilsett en til fem mikroliter av ESC-suspensjonen til den embryoholdige FHM-dråpen.
Når injeksjonspipetten er vasket med polyvinylpyrrolidon, flytt injeksjonspipetten til dråpen som inneholder embryoene og ESC-ene. Velg tre individuelle ESC-dubletter som nettopp er ferdige med celledelingen i injeksjonspipetten. Ved hjelp av holdepipetten, hold et åttecellet eller morula-stadium embryo som har fullført komprimering ved aspirasjon og lag et hull i zona pellucida med en piezoelektrisk puls.
Utvis den sekscellede ESC inne i zona pellucida og trekk pipetten ut av embryoene. Vask de ESC-injiserte embryoene med flere KSOM-dråper forsiktig ved hjelp av en munnpipette og inkuber dem i en ny 50-mikroliter KSOM-dråpe dekket med mineralolje, som vist tidligere, til embryoene utviklet seg til blastocyststadiet. En PCR-amplikon av størrelse som er spesifikk for knock-in-målet oppnås, og 9 av 22 kloner viste et knock-in-spesifikt bånd.
Disse resultatene er effektive og reproduserbare for gen knock-in uten legemiddelvalg. Å plukke opp den optimale størrelsen på ESC-kolonier er ganske viktig for denne prosedyren. Unngå å velge kolonier som er for store eller for små.
CRISPR Cas9-mediert direkte genomredigering ved hjelp av en zygote ville være aktuelt for å lage enkle gen knockout-mus. Denne CRISPR Cas9-medierte ESC-genmålrettingsprotokollen letter produksjonen av ulike genmodifiserte mus for fremtidig analyse innen livsvitenskap.
Her presenterer vi en protokoll for utvikling av genmodifiserte musemodeller ved bruk av embryonale stamceller, spesielt for store DNA-knock-in (KI). Denne protokollen er innstilt ved hjelp av CRISPR / Cas9 genomredigering, noe som resulterer i betydelig forbedret KI-effektivitet sammenlignet med den konvensjonelle homologe rekombinasjonsmedierte lineariserte DNA-målrettingsmetoden.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved