Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. sætter stor pris på støtte fra German Research Foundation (DFG) gennem DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) og TRR179 (Projektnummer 272983813) samt fra det tyske center for infektionsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

1. AAV2 tilfældig 7-mer peptid display bibliotek forberedelse
BEMÆRK: Til fremstilling af et AAV2 tilfældigt peptiddisplaybibliotek syntetiseres de degenererede oligonukleotider som enkeltstrenget DNA, konverteres til dobbeltstrenget DNA, fordøjes, ligeres til acceptorplasmidet og elektroporat.
<ol><li>Design af degenererede oligonukleotider<ol><li>Bestil de degenererede oligonukleotider og undgå codonbias. I oligonukleotid 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCC...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy.">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues,+as+pipeline+matures.">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+at+the+crossroads.">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).</li><li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification,+Rational+Design+and+Machine+Learning.">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756 (2022).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy.">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li><li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing.">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075 (2014).</li><li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing.">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 2, 15041 (2015).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries.">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types.">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li><li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression.">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li><li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning.">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species.">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li><li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism.">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li><li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors.">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li><li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design.">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li><li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system.">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li><li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants.">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).</li><li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone.">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li><li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening.">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li><li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling.">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).</li><li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li><li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens.">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries.">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li><li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo.">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li><li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses.">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy.">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li><li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing.">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).</li><li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNABarcodes:+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags.">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq.">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).</li><li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors.">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li><li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+design:+A+Goldilocks+challenge.">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li><li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing.">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).</li></ol>

I denne protokol er de trin, der er nødvendige for peptidvisning AAV capsid engineering og for stregkodet AAV bibliotek screening, samt for bioinformatisk analyse af bibliotekets sammensætning og capsid ydeevne, skitseres. Denne protokol fokuserer på de trin, der letter bioinformatisk analyse af disse typer biblioteker, fordi de fleste virologilaboratorier halter i programmeringsfærdigheder for at matche deres færdigheder i molekylærbiologiske teknikker. Begge typer biblioteker er blevet grundigt beskrevet i litter...

Genoverførselsterapi er introduktion af genetisk materiale i celler for at reparere, erstatte eller ændre det cellulære genetiske materiale for at forebygge, behandle, helbrede eller forbedre sygdom. Genoverførsel, både in vivo og ex vivo, er afhængig af forskellige leveringssystemer, ikke-virale og virale. Virus har udviklet sig naturligt til effektivt at transducere deres målceller og kan bruges som leveringsvektorer. Blandt de forskellige typer virale vektorer, der anvendes i genterapi, er adenoassocierede vira i stigende grad blevet anvendt på grund af deres manglende patogenicitet, sikkerhed, lave immunogenicitet og vigtigst af alt deres evne til at opretholde langsigtet, ikke-integrerende ekspression 1,2,3. AAV-genterapi har givet betydelige resultater i løbet af det sidste årti; tre behandlinger er blevet godkendt af Det Europæiske Lægemiddelagentur og US Food and Drug Administration til brug hos mennesker 3,4. Flere kliniske forsøg er også i gang til behandling af en række sygdomme, såsom hæmofili, muskel-, hjerte- og neurologiske sygdomme, som gennemgået andetsteds3. På trods af årtiers fremskridt har området for genterapi oplevet en række tilbageslag i de senere år4, vigtigst dødsfald i kliniske forsøg5, der er blevet sat i bero på grund af dosisbegrænsende toksiciteter, især for væv, der er massive, såsom muskler eller vanskelige at nå, såsom hjerne6.
AAV-vektorerne, der i øjeblikket anvendes i kliniske forsøg, tilhører de naturlige serotyper med nogle få undtagelser: 1. AAV-teknik giver mulighed for at udvikle vektorer med overlegen organ- eller cellespecificitet og effektivitet. I de sidste to årtier er flere tilgange blevet anvendt med succes, såsom peptidvisning, loop-swap, capsid-DNA-blanding, fejlbehæftet PCR og målrettet design til at generere individuelle AAV-varianter eller biblioteker deraf med forskellige egenskaber7. Disse udsættes derefter for flere runder af rettet evolution for at vælge varianterne i dem med de ønskede egenskaber, som gennemgået andetsteds 1,3. Af alle capsid-evolutionsstrategierne har peptiddisplay AAV-biblioteker været de mest anvendte på grund af nogle unikke egenskaber: de er relativt lette at generere, og de kan opnå høj mangfoldighed og high-throughput sekventering, hvilket gør det muligt at spore deres udvikling.
De første vellykkede AAV-biblioteker til peptidindsættelse blev beskrevet for næsten 20 år siden. I en af de første konstruerede Perabo et al.8 et bibliotek af modificerede AAV2-kapsider, hvor en pulje af tilfældigt genererede oligonukleotider blev indsat i et plasmid i en position, der svarer til aminosyre 587 af VP1-capsidproteinet i den tredobbelte akse, der stikker ud fra kapsiden. Ved hjælp af adenovirus-co-infektion blev AAV-biblioteket udviklet gennem flere udvælgelsesrunder, og de endelige re-målrettede varianter viste sig at være i stand til at transducere cellelinjer, der var ildfaste over for forældrenes AAV28. Kort tid efter introducerede Müller et al.9 totrinssystemet til biblioteksproduktion, en betydelig forbedring af protokollen. Indledningsvis bruges plasmidbiblioteket sammen med et adenoviralt hjælperplasmid til at producere et AAV-bibliotek, der indeholder kimære kapsider. Dette AAV-shuttlebibliotek bruges til at inficere celler ved lav infektionsmultiplicitet (MOI) med det formål at introducere et viralt genom pr. Celle. Co-infektion med adenovirus sikrer produktion af AAV'er med et matchende genom og kapsid9. Omkring et årti senere brugte Dalkara10 in vivo-styret evolution til at skabe 7m8-varianten. Denne variant har en 10 aminosyreindsættelse (LALGETTRPA), hvoraf tre fungerer som linkere, og effektivt retter sig mod den ydre nethinden efter intravitreal injektion10. Dette konstruerede capsid er en enestående succeshistorie, da det er en af de få konstruerede kapsider, der hidtil har nået klinikken11.
Feltet oplevede et andet løft med introduktionen af næste generations sekventeringsteknikker (NGS). To publikationer fra Adachi et al.12 i 2014 og fra Marsic et al.13 i 2015 viste NGS's magt til at spore distributionen af stregkodede AAV capsid-biblioteker med høj nøjagtighed. Et par år senere blev NGS af stregkodede regioner tilpasset peptidindsættelsesregionen for at følge kapsidudviklingen. Körbelin et al.14 udførte en NGS-guidet screening for at identificere et lungemålrettet AAV2-baseret kapsid. NGS-analysen hjalp med at beregne tre ratingscorer: berigelsesscoren mellem udvælgelsesrunder, den generelle specificitetsscore for at bestemme vævsspecificitet og endelig den kombinerede score14. Gradinaru lab15 offentliggjorde det Cre-rekombinationsbaserede AAV målrettede evolution (CREATE) system i samme år, hvilket letter en celletype-specifik udvælgelse. I dette system bærer capsidbiblioteket en Cre-invertibel switch, da polyA-signalet flankeres af to loxP-steder. AAV-biblioteket injiceres derefter i Cre-mus, hvor polyA-signalet kun inverteres i Cre+-celler, hvilket giver skabelonen til binding af en omvendt PCR-primer med den fremadgående primer i capsid-genet. Denne meget specifikke PCR-redning gjorde det muligt at identificere AAV-PHP. B-variant, der kan krydse blod-hjerne-barrieren15. Dette system blev videreudviklet til M-CREATE (Multiplexed-CREATE), hvor NGS og syntetisk biblioteksgenerering blev integreret i pipelinen16.
En forbedret RNA-baseret version af dette system fra Maguire lab17, iTransduce, tillader selektion på DNA-niveau af kapsider, der funktionelt transducerer celler og udtrykker deres genomer. Det virale genom i peptiddisplaybiblioteket omfatter et Cre-gen under kontrol af en allestedsnærværende promotor og capsid-genet under kontrol af p41-promotoren. Biblioteket injiceres i mus, der har en loxP-STOP-loxP-kassette opstrøms for tdTomato. Celler transduceret med AAV-varianter, der udtrykker det virale genom og derfor Cre udtrykker tdTomat og i kombination med cellemarkører kan sorteres og vælges17. Tilsvarende placerede Nonnenmacher et al.18 og Tabebordbar et al.19 capsid-genbiblioteket under kontrol af vævsspecifikke promotorer. Efter injektion i forskellige dyremodeller blev viralt RNA anvendt til at isolere kapsidvarianterne.
En alternativ tilgang er at bruge stregkoder til at mærke capsidbiblioteker. Björklund lab20 brugte denne tilgang til stregkodepeptidindsættelseskapsidbiblioteker og udviklede den stregkodede rationelle AAV-vektorevolution (BRAVE). I et plasmid klones Rep2Cap-kassetten ved siden af et inverteret terminalgentagelser (ITR) -flankeret, gult fluorescerende protein (YFP) -udtrykkende, stregkodemærket transgen. Ved hjælp af loxP-steder mellem enden af hætten og begyndelsen af stregkoden genererer en in vitro Cre-rekombination et fragment, der er lille nok til NGS, hvilket muliggør associering af peptidindsættelse med den unikke stregkode (opslagstabel, LUT). AAV-produktion udføres ved hjælp af plasmidbiblioteket, og stregkoderne udtrykt i mRNA'et screenes efter in vivo-applikation , igen med NGS20. Når capsidbibliotekerne omfatter varianter af hele capsid-genet (dvs. blandede biblioteker), skal der anvendes langlæst sekventering. Flere grupper har brugt stregkoder til at tagge disse forskellige biblioteker, hvilket muliggør NGS med højere læsedybde. Kay-laboratoriet21 mærkede meget forskellige capsid-blandede biblioteker med stregkoder nedstrøms for cap polyA-signalet. I et første trin blev der genereret et stregkodet plasmidbibliotek, og det blandede capsid-genbibliotek blev klonet ind i det. Derefter blev en kombination af MiSeq (kort læsning, højere læsedybde) og PacBio (lang læsning, lavere læsedybde) NGS samt Sanger-sekventering brugt til at generere deres LUT21. I 2019 afgrænsede Ogden og kolleger fra Kirkens laboratorium22 AAV2-kapsidegnetheden til flere funktioner ved hjælp af biblioteker, der havde enkeltpunktsmutationer, indsættelser og sletninger i hver position, hvilket i sidste ende muliggjorde maskinstyret design. Til generering af biblioteket blev mindre fragmenter af capsid-genet syntetiseret, mærket med en stregkode, næste generations sekventeret og derefter klonet ind i det fulde capsid-gen. NGS-dataene blev brugt til at generere en LUT. Biblioteket blev derefter screenet ved hjælp af kun stregkoder og kortlæsningsekventering, hvilket igen tillader højere læsedybde22.
Stregkodede biblioteker er overvejende blevet brugt til at screene en pulje af kendte, naturlige og konstruerede varianter efter flere runder med udvælgelse af capsidbiblioteker eller uafhængigt af en capsid-evolutionsundersøgelse. Fordelen ved sådanne biblioteker er muligheden for at screene flere kapsider, samtidig med at antallet af dyr reduceres og variationen mellem dyr minimeres. De første undersøgelser, der introducerede denne teknologi til AAV-feltet, blev offentliggjort for næsten et årti siden. Nakai lab 12 mærkede 191 dobbelte alaninmutanter, der dækker aminosyrerne 356 til 736 på VP1 fra AAV9 med et par 12-nukleotidstregkoder. Ved hjælp af NGS blev biblioteket screenet in vivo for galactosebinding og andre egenskaber12. Marsic og kolleger afgrænsede biodistributionen af AAV-varianter ved hjælp af også en dobbelt-barcorded analyse 1 år senere13. En nyere undersøgelse af ikke-menneskelige primater sammenlignede biofordelingen i centralnervesystemet af 29 kapsider ved hjælp af forskellige leveringsveje23. Vores laboratorium har for nylig offentliggjort stregkodede AAV-biblioteksskærme med 183 varianter, der omfattede naturlige og konstruerede AAV'er. Disse screeninger på DNA- og RNA-niveau førte til identifikation af en meget myotrop AAV-variant24 hos mus såvel som andre, der viste en høj celletypespecificitet i musehjernen25.
Her beskriver vi den metode, der anvendes i dette arbejde, og udvider den til at omfatte screening af AAV-peptiddisplaybiblioteker. Dette omfatter generering af AAV2-peptiddisplaybiblioteker, en digital dråbe-PCR (dd-PCR) metode til kvantificering og endelig en NGS-pipeline til analyse af AAV-varianterne, delvist baseret på Weinmanns og kollegers arbejde24. Endelig gives en beskrivelse af genereringen af stregkodede AAV-biblioteker og NGS-pipelinen, der anvendes i samme publikation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

Genleveringsvektorer afledt af adenoassocieret virus (AAV) er et af de mest lovende værktøjer til behandling af genetiske sygdomme, hvilket fremgår af tilskyndelse til kliniske data og godkendelse af flere AAV-genterapier. To hovedårsager til AAV-vektorers succes er (i) den forudgående isolering af forskellige naturligt forekommende virale serotyper med forskellige egenskaber og (ii) den efterfølgende etablering af kraftfulde teknologier til deres molekylære teknik og genanvendelse i høj gennemstrømning. Yderligere styrkelse af potentialet i disse teknikker er nyligt implementerede strategier til stregkodning af udvalgte AAV-kapsider på DNA- og RNA-niveau, hvilket muliggør deres omfattende og parallelle in vivo-stratificering i alle større organer og celletyper i et enkelt dyr. Her præsenterer vi en grundlæggende pipeline, der omfatter dette sæt komplementære veje, ved hjælp af AAV-peptiddisplay til at repræsentere det mangfoldige arsenal af tilgængelige capsid-tekniske teknologier. Derfor beskriver vi først de afgørende trin for genereringen af et AAV-peptiddisplaybibliotek til in vivo-udvælgelse af kandidater med ønskede egenskaber, efterfulgt af en demonstration af, hvordan man stregkoder de mest interessante capsid-varianter til sekundær in vivo-screening. Dernæst eksemplificerer vi metoden til oprettelse af biblioteker til næste generations sekventering (NGS), herunder stregkodeforstærkning og adapterligering, inden vi slutter med en oversigt over de mest kritiske trin under NGS-dataanalyse. Da de protokoller, der rapporteres her, er alsidige og tilpasningsdygtige, kan forskere let udnytte dem til at berige de optimale AAV-capsidvarianter i deres foretrukne sygdomsmodel og til genterapiapplikationer.

Generering af et AAV2-peptiddisplaybibliotek. Som et første skridt mod udvælgelsen af konstruerede AAV'er beskrives genereringen af et plasmidbibliotek. Peptidindsatsen fremstilles ved anvendelse af degenererede primere. At reducere kombinationen af kodoner i dem fra 64 til 20 har fordelene ved at eliminere stopkodoner og lette NGS-analyse ved at reducere biblioteksdiversiteten på DNA'et, men ikke proteinniveauet. Oligonukleotidindsatsen købes som enkeltstrenget DNA (figur 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Generering af AAV-peptiddisplaybibliotek og efterfølgende validering gennem stregkode af kandidater med nye egenskaber til oprettelse af næste generations AAV'er.

Isolering af næste generations genterapivektorer gennem teknik, stregkodning og screening af adeno-associeret virus (AAV) capsidvarianter

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Denne protokol lukker et betydeligt hul mellem naturlig udvikling af vira og deres anvendelse som rekombinante vektorer til human genterapi ved at muliggøre deres teknik, diversificering og stratificering. Denne teknik giver mulighed for parallel screening med høj kapacitet for nye, isolerede eller konstruerede adeno-associerede virus, kort sagt AAV-varianter, hvorved der spares på dyreantal, arbejde, omkostninger og tid. De identificerede AVV capsid varianter kan øge effekten og specificiteten af AAV-baseret levering af terapeutiske transgener, derved reducere den krævede virale dosis.Dette kunne forbedre sikkerheden og anvendeligheden af genterapi. Den samme tilgang kunne også bruges til capsid eller promoter engineering af andre genleveringskøretøjer, hvilket forbedrer vores forståelse af deres biologi og deres anvendelse i genterapi. Med til at demonstrere proceduren vil være ph.d.-studerende Jonas Becker og Jixin Liu, postdoc Joanna Szumska og Margarita Zayas, samt forskningsassistenter Emma Gerstmann og Ellen Widtke fra mit laboratorium.Begynd med at analysere NGS-sekventeringsdataene med Python 3 og Biopython. NGS-analysen består af to trin. I det første trin skal du søge i sekvensfilerne efter sekvenser, der opfylder specifikke kriterier såsom flankerende sekvenser, længde og placering ved hjælp af script et og en konfigurationsfil, der indeholder de nødvendige oplysninger.I det andet trin skal du oversætte de udtrukne sekvenser, der starter ved AGWGGC-sekvensen, ved hjælp af script nummer to og konfigurationen og zuordnung. txt-filer, der indeholder de nødvendige oplysninger. Forbered to mapper:script og data.Kopier de Gzip-komprimerede filer, der er resultatet af sekventeringen, til datamappen. Kopier derefter Python- og konfigurationsfilerne til scriptmappen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Før du kører scripts, skal du åbne zuordnung.txt-fil og tilføj to faneseparerede kolonner. Indtast navnene på Gzip-filerne i kolonne et og det ønskede endelige navn i kolonne to. Rediger variablerne i konfigurationsfilen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Brug den specifikke kommando til at starte variantsekvensdetektering og ekstraktion. Outputtet vil være TXT-filer med de ekstraherede DNA-sekvenser og deres antal læsninger. Overskriften på denne fil indeholder statistiske data, og disse data overføres til følgende filer.Disse TXT-data vil være inputfilen til script nummer to, hvor DNA-sekvenserne oversættes, rangeres og analyseres. Brug den specifikke kommando til at starte PV-oversættelse og analyse af tekstoutputfilerne i script et som beskrevet i tekstmanuskriptet. Outputfilerne i script nummer to navngives ved hjælp af den anden kolonne i opslagstabellen i zuordnung.TXT med udvidelser baseret på analysetypen. Sørg for, at de tre outputfiler indeholder statistiske data i de første rækker og en første kolonne med indekset for hver DNA-sekvens fra inputtekstfilerne. De resterende kolonner skal bestå af DNA-sekvensen, antallet af aflæsninger, fremad- eller omvendt læsning og oversat peptidsekvens.De ugyldige sekvenser skal have NA og ikke være gyldige i de sidste to kolonner. Visualiser outputfilerne ved hjælp af tilgængelig software baseret på brugerens behov. For at udføre analysen af NGS-sekventeringsdataene ved hjælp af brugerdefineret kode i Python 3 omfatter arbejdsgangen påvisning af stregkodesekvenser styret af flankerende sekvenser, deres længde og placering samt analyse af stregkodeberigelse og distribution over vævssættet.Forbered to mapper:script og data. Kopier de Gzip-komprimerede filer, der er resultatet af sekventeringen, til datamappen. Kopier derefter python- og konfigurationsfilerne til scriptmappen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Før du udfører scriptet, skal du oprette to tabulatorseparerede tekstfiler: capsidvariansen. txt-fil med stregkodesekvenserne tildelt AAV capsid-variantnavne og forureningen. txt-fil med stregkodesekvenser, der kommer fra mulig forurening.Til sidst skal du redigere konfigurationsfilen for at inkludere oplysningerne om stien til mappen med sekventeringsdata, sekvens af flankerende regioner i stregkoderne, deres position og vinduesstørrelse til stregkoderegistrering. Udfør stregkodedetekteringsscriptet med de angivne stier og konfigurationsfiler ved hjælp af den respektive kommando. Outputtet af denne kommandoudførelse vil være TXT-filer med genoptællinger pr. capsid-variant og det samlede antal læsninger, der gendannes fra rådataene.At evaluere fordelingen af stregkodet AAV capsid blandt væv eller organer i zuordnung. txt-fil, skal du tildele navnet på hver tekstfil, der er opnået fra stregkodedetekteringen, til et vævs- eller organnavn. Tilføj navnene på tekstfiler i den første kolonne og tilsvarende vævs- eller organnavne i den tabulatorseparerede tildeling.Opret et organ. txt-fil med listen over navne til on- og off-target-organer, som svarer til navnene i opgaven Zuordnung. txt-fil.Opret derefter normalization_organ. txt og normalization_variant. TXT Tab afgrænsede tekstfiler med normaliserede værdier for alle capsidvarianter og alle organer og væv.I den første kolonne med normalization_organ. txt-fil, skriv navnene på hvert organ og den anden kolonne med normaliseringsværdier for det tilsvarende væv. Udfyld den første kolonne i normalization_variant.txt-fil med listen over capsidnavne og den anden kolonne med de normaliserede værdier for læsetællingerne for hvert capsid i det samlede bibliotek. Rediger konfigurationsfilen ved at angive de fulde stier til alle yderligere filer, og udfør stregkodeanalysescriptet ved hjælp af denne specifikke kommando. Stregkodeanalysescriptet udsender flere filer, såsom tekstfiler med relativ koncentration eller RC-værdier for capsidfordeling i forskellige væv baseret på flere normaliseringstrin beskrevet tidligere, og regnearksfilen, der kombinerer tekstfildata i fusionerede matrixdata.Visualiser dataene og udfør klyngeanalyse af matrixdataene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Scriptet vil indtaste den relative koncentration. XLS-filer og generere to plots af hierarkisk klyngevarmekort og hovedkomponentanalyse.For at ændre plots eller PNG-parametre skal du åbne R-scriptet og følge instruktionerne i kommentarfeltet. De kvantificerede regioner af AAV2 rep-genet viste, at 99,2% var positive for ITR, hvilket tyder på, at AAV-kapsiderne indeholdt hele virale genomer. I alle tre sæt repræsenterede de udtrukne læsninger baseret på signatursekvenser, der var specifikke for biblioteket, ca. 94% af de samlede læsninger, hvilket indikerer god kvalitet.Af disse var mere end 99% gyldige PV-læsninger, og over 99% af de gyldige PV-læsninger var unikke, hvilket tyder på, at biblioteket var afbalanceret med høj intern mangfoldighed. De to hovedgrene af varmekorthierarkiet afspejlede forskellen i transduktionseffektiviteten af capsidvarianter. Den venstre gren med størstedelen af capsidvarianterne omfattede alle kapsiderne, som viste en høj relativ koncentrationsværdi på tværs af de fleste væv.Bortset fra slående høj leverspecificitet udviste tre andre kapsider specificitet i membranen, skeletmuskulaturen, biceps og hjernen. Den højre gren af den hierarkiske klyngedannelse omfattede kapsidvarianterne med den samlede lavere transduktionseffektivitet, der var mest tydelig i tolvfingertarmen og bugspytkirtlen. Hovedkomponentanalysen for den oprindelige delmængde danner klyngen af capsidvarianter med høj leverspecificitet og skitserer VAR60 capsid fremragende muskeltropisme.Når du forsøger denne protokol, skal du være opmærksom på skrivefejl. Syntaksen er også anderledes, hvis du bruger Windows-kommandoprompten sammenlignet med Linux. Efter identifikation af nye AAV-varianter skal det terapeutiske og translationelle potentiale verificeres i en afdød eller større dyremodel.Denne teknik muliggør en direkte sammenligning side om side af AAV-varianter under identiske forhold og er ekstremt alsidig, hvilket baner vejen for dens oversættelse hos store dyr eller endda hos mennesker.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic force mikroskopi Based Biopanning til isolering af Morfologi Specifikke reagenser mod TDP-43 varianter i amyotrofisk lateral sklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System for Funktionel Inddrivelse af hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolering af murine fedtvæv-afledte mikrovaskulær Fragmenter som Vaskularisering Enheder til Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Forudsigelse af gensvulmning gennem spatiotemporal kontrol af siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues for injicerbare regenerativ terapi og høj overførselshastighed stof Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Undersøgelse Cavitation Forbedret Terapi

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Pålideligt at konstruere og kontrollere stabile optogenetiske genkredsløb i pattedyrceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Fotodegradable Hydrogel-grænseflader til bakteriescreening, udvælgelse og isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...