Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. stelt de steun van de German Research Foundation (DFG) via de DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) en TRR179 (Projektnummer 272983813) zeer op prijs, evenals van het Duitse Centrum voor Infectieonderzoek (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

1. AAV2 willekeurige 7-mer peptide display bibliotheek voorbereiding
OPMERKING: Voor de voorbereiding van een AAV2 random peptide display library, synthetiseer de gedegenereerde oligonucleotiden als enkelstrengs DNA, zet het om in dubbelstrengs DNA, verteert, ligaat naar het acceptor plasmide en elektroporaat.
<ol><li>Ontwerp van gedegenereerde oligonucleotiden<ol><li>Ordenschik de gedegenereerde oligonucleotiden en vermijd codon bias. In het oligonucleotide 5' CAGTCGGCCAG A...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy.">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues,+as+pipeline+matures.">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+at+the+crossroads.">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).</li><li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification,+Rational+Design+and+Machine+Learning.">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756 (2022).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy.">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li><li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing.">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075 (2014).</li><li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing.">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 2, 15041 (2015).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries.">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types.">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li><li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression.">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li><li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning.">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species.">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li><li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism.">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li><li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors.">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li><li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design.">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li><li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system.">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li><li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants.">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).</li><li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone.">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li><li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening.">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li><li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling.">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).</li><li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li><li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens.">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries.">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li><li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo.">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li><li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses.">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy.">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li><li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing.">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).</li><li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNABarcodes:+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags.">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq.">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).</li><li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors.">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li><li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+design:+A+Goldilocks+challenge.">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li><li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing.">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).</li></ol>

In dit protocol worden de stappen beschreven die nodig zijn voor peptideweergave AAV capsid engineering en voor barcoded AAV-bibliotheekscreening, evenals voor bioinformatische analyse van bibliotheeksamenstelling en capsid-prestaties. Dit protocol richt zich op de stappen die de bioinformatische analyse van dit soort bibliotheken vergemakkelijken, omdat de meeste virologielaboratoria achterblijven in programmeervaardigheden om hun vaardigheid in moleculaire biologietechnieken te evenaren. Beide soorten bibliotheken zijn...

Genoverdrachtstherapie is de introductie van genetisch materiaal in cellen om het cellulaire genetische materiaal te repareren, te vervangen of te veranderen om ziekten te voorkomen, behandelen, genezen of verbeteren. Genoverdracht, zowel in vivo als ex vivo, is afhankelijk van verschillende toedieningssystemen, niet-viraal en viraal. Virussen zijn op natuurlijke wijze geëvolueerd om hun doelcellen efficiënt te transduceren en kunnen worden gebruikt als leveringsvectoren. Onder de verschillende soorten virale vectoren die bij gentherapie worden gebruikt, worden adeno-geassocieerde virussen in toenemende mate gebruikt, vanwege hun gebrek aan pathogeniciteit, veiligheid, lage immunogeniciteit en vooral hun vermogen om langdurige, niet-integrerende expressie te ondersteunen 1,2,3. AAV-gentherapie heeft het afgelopen decennium aanzienlijke resultaten opgeleverd; drie therapieën zijn goedgekeurd door het Europees Geneesmiddelenbureau en de Amerikaanse Food and Drug Administration voor gebruik bij mensen 3,4. Verschillende klinische onderzoeken zijn ook aan de gang om een verscheidenheid aan ziekten te behandelen, zoals hemofilie, spier-, hart- en neurologische aandoeningen, zoals elders besproken3. Ondanks tientallen jaren van vooruitgang heeft het gebied van gentherapie de afgelopen jaren een reeks tegenslagen ervaren4, vooral sterfgevallen in klinische onderzoeken5 die in de wacht zijn gezet vanwege dosisbeperkende toxiciteiten, met name voor weefsels die enorm zijn, zoals spieren, of moeilijk te bereiken, zoals hersenen6.
De AAV-vectoren die momenteel in klinische onderzoeken worden gebruikt, behoren tot de natuurlijke serotypen, op enkele uitzonderingenna 1. AAV-engineering biedt de mogelijkheid om vectoren te ontwikkelen met superieure orgaan- of celspecificiteit en efficiëntie. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende benaderingen met succes toegepast, zoals peptideweergave, loop-swap, capsid DNA-schuifelen, foutgevoelige PCR en gericht ontwerp, om individuele AAV-varianten of bibliotheken daarvan met verschillende eigenschappen te genereren7. Deze worden vervolgens onderworpen aan meerdere rondes van gerichte evolutie om de varianten erin te selecteren met de gewenste eigenschappen, zoals elders besproken 1,3. Van alle capsid-evolutiestrategieën zijn peptide-display AAV-bibliotheken het meest gebruikt, vanwege enkele unieke eigenschappen: ze zijn relatief eenvoudig te genereren en ze kunnen een hoge diversiteit en high-throughput sequencing bereiken, waardoor ze hun evolutie kunnen volgen.
De eerste succesvolle peptide insertie AAV-bibliotheken werden bijna 20 jaar geleden beschreven. In een van de eerste construeerden Perabo et al.8 een bibliotheek van gemodificeerde AAV2-capsiden, waarin een pool van willekeurig gegenereerde oligonucleotiden in een plasmide werd ingebracht op een positie die overeenkomt met aminozuur 587 van het VP1 capside-eiwit, in de drievoudige as die uit de capside steekt. Met behulp van adenovirus co-infectie werd de AAV-bibliotheek ontwikkeld door meerdere selectierondes en de uiteindelijke re-targeted varianten bleken in staat te zijn om cellijnen refractair te transduceren naar de ouderlijke AAV28. Kort daarna introduceerden Müller et al.9 het tweestappensysteem voor bibliotheekproductie, een aanzienlijke verbetering van het protocol. Aanvankelijk wordt de plasmidebibliotheek, samen met een adenoviraal helperplasmide, gebruikt om een AAV-bibliotheek te produceren die chimere capsiden bevat. Deze AAV-shuttlebibliotheek wordt gebruikt om cellen met een lage multipliciteit van infectie (MOI) te infecteren, met als doel één viraal genoom per cel te introduceren. Co-infectie met adenovirus zorgt voor de productie van AAV's met een bijpassend genoom en capsid9. Ongeveer een decennium later gebruikte Dalkara10 in vivo gerichte evolutie om de 7m8-variant te creëren. Deze variant heeft een 10 aminozuurinbrenging (LALGETTRPA), waarvan er drie fungeren als linkers, en richt zich efficiënt op het buitenste netvlies na intravitreale injectie10. Deze engineered capsid is een uitzonderlijk succesverhaal, omdat het een van de weinige engineered capsids is die tot nu toe de kliniek heeft bereikt11.
Het veld beleefde een tweede boost met de introductie van next-generation sequencing (NGS) technieken. Twee publicaties van Adachi et al.12 in 2014 en van Marsic et al.13 in 2015, toonden de kracht van NGS om de distributie van AAV-capsidbibliotheken met streepjescode met hoge nauwkeurigheid te volgen. Een paar jaar later werd de NGS van barcodegebieden aangepast aan het peptide-insertiegebied om de capside-evolutie te volgen. Körbelin et al.14 voerden een NGS-geleide screening uit om een pulmonaal gerichte AAV2-gebaseerde capsid te identificeren. De NGS-analyse hielp bij het berekenen van drie beoordelingsscores: de verrijkingsscore tussen selectierondes, de algemene specificiteitsscore om weefselspecificiteit te bepalen en ten slotte de gecombineerde score14. Het Gradinaru-lab15 publiceerde in hetzelfde jaar het op Cre-recombination gebaseerde AAV-gerichte evolutie (CREATE) -systeem, dat een celtypespecifieke selectie mogelijk maakt. In dit systeem draagt de capsid-bibliotheek een Cre-inverteerbare schakelaar, omdat het polyA-signaal wordt geflankeerd door twee loxP-sites. De AAV-bibliotheek wordt vervolgens geïnjecteerd in Cre-muizen, waar het polyA-signaal alleen in Cre + -cellen wordt omgekeerd, waardoor de sjabloon wordt geboden voor het binden van een omgekeerde PCR-primer met de voorwaartse primer in het capsid-gen. Deze zeer specifieke PCR-redding maakte de identificatie van de AAV-PHP mogelijk. B-variant die de bloed-hersenbarrière kan passeren15. Dit systeem werd verder ontwikkeld tot M-CREATE (Multiplexed-CREATE), waarbij NGS en synthetische bibliotheekgeneratie werden geïntegreerd in de pijplijn16.
Een verbeterde RNA-gebaseerde versie van dit systeem uit het Maguire-lab17, iTransduce, maakt selectie op DNA-niveau mogelijk van capsiden die functioneel cellen transduceren en hun genomen tot expressie brengen. Het virale genoom van de peptideweergavebibliotheek bestaat uit een Cre-gen onder controle van een alomtegenwoordige promotor en het capside-gen onder controle van de p41-promotor. De bibliotheek wordt geïnjecteerd bij muizen die een loxP-STOP-loxP-cassette hebben stroomopwaarts van tdTomato. Cellen getransduceerd met AAV-varianten die het virale genoom tot expressie brengen en dus Cre tdTomato tot expressie brengen en, in combinatie met celmarkers, kunnen worden gesorteerd en geselecteerd17. Evenzo plaatsten Nonnenmacher et al.18 en Tabebordbar et al.19 de capsid-genenbibliotheek onder controle van weefselspecifieke promotors. Na injectie in verschillende diermodellen werd viraal RNA gebruikt om de capsid-varianten te isoleren.
Een alternatieve benadering is om barcoding te gebruiken om capsid-bibliotheken te taggen. Het Björklund lab20 gebruikte deze benadering voor barcode peptide insertion capsid libraries en ontwikkelde de barcoded rational AAV vector evolution (BRAVE). In één plasmide wordt de Rep2Cap-cassette gekloond naast een inverted terminal repeats (ITR)-geflankeerd, geel fluorescerend eiwit (YFP)-expresserend, barcode-gelabeld transgen. Met behulp van loxP-sites tussen het einde van de dop en het begin van de streepjescode, genereert een in vitro Cre-recombinatie een fragment dat klein genoeg is voor NGS, waardoor de associatie van peptide-insertie met de unieke streepjescode (look-up table, LUT) mogelijk wordt. AAV-productie wordt uitgevoerd met behulp van de plasmidebibliotheek en de barcodes uitgedrukt in het mRNA worden gescreend na in vivo toepassing, opnieuw met NGS20. Wanneer de capsid-bibliotheken varianten van het hele capsid-gen bevatten (d.w.z. geschudde bibliotheken), moet long-read sequencing worden gebruikt. Verschillende groepen hebben barcodes gebruikt om deze diverse bibliotheken te taggen, waardoor NGS een hogere leesdiepte heeft. Het Kay lab21 tagde zeer diverse capsid shuffled bibliotheken met barcodes stroomafwaarts van het cap polyA signaal. In een eerste stap werd een plasmidebibliotheek met streepjescode gegenereerd en de geschudde capsid-genenbibliotheek werd erin gekloond. Vervolgens werd een combinatie van MiSeq (short read, hogere leesdiepte) en PacBio (long read, lagere leesdiepte) NGS en Sanger sequencing gebruikt om hun LUT21 te genereren. In 2019 hebben Ogden en collega's van het Church-lab22 de AAV2-capsid-geschiktheid voor meerdere functies afgebakend met behulp van bibliotheken met mutaties, inserties en deleties op één punt in elke positie, wat uiteindelijk machinegestuurd ontwerp mogelijk maakte. Voor de generatie van de bibliotheek werden kleinere fragmenten van het capsid-gen gesynthetiseerd, getagd met een barcode, de volgende generatie gesequenced en vervolgens gekloond in het volledige capsid-gen. De NGS-gegevens werden gebruikt om een LUT te genereren. De bibliotheek werd vervolgens gescreend met alleen de barcodes en short read sequencing, wat op zijn beurt een hogere leesdiepte22 mogelijk maakt.
Bibliotheken met streepjescodes zijn voornamelijk gebruikt om een pool van bekende, natuurlijke en technische varianten te screenen na verschillende selectierondes van capsid-bibliotheken of onafhankelijk van een capsid-evolutiestudie. Het voordeel van dergelijke bibliotheken is de mogelijkheid om meerdere capsiden te screenen, terwijl het aantal dieren wordt verminderd en de variatie tussen dieren wordt geminimaliseerd. De eerste studies die deze technologie introduceerden in het AAV-veld werden bijna tien jaar geleden gepubliceerd. Het Nakai-lab 12 tagde 191 dubbele alaninemutanten met aminozuren 356 tot 736 op de VP1 van AAV9 met een paar 12-nucleotide barcodes. Met behulp van NGS werd de bibliotheek in vivo gescreend op galactosebinding en andere eigenschappen12. Marsic en collega's bakenden de biodistributie van AAV-varianten af met behulp van ook een dubbele barcorded analyse 1 jaar later13. Een meer recente studie bij niet-menselijke primaten vergeleek de biodistributie in het centrale zenuwstelsel van 29 capsiden met behulp van verschillende toedieningsroutes23. Ons lab heeft onlangs AAV-bibliotheekschermen met streepjescode gepubliceerd van 183 varianten die natuurlijke en technische AAV's bevatten. Deze screenings op DNA- en RNA-niveau leidden tot de identificatie van een zeer myotrope AAV-variant24 bij muizen en andere met een hoge celtypespecificiteit in het muizenbrein25.
Hier beschrijven we de methodologie die in dit werk wordt gebruikt en breiden we deze uit met screening van AAV-peptideweergavebibliotheken. Dit omvat het genereren van AAV2-peptideweergavebibliotheken, een digitale druppel-PCR (dd-PCR) -methode voor kwantificering en ten slotte een NGS-pijplijn om de AAV-varianten te analyseren, deels gebaseerd op het werk van Weinmann en collega's24. Ten slotte wordt een beschrijving gegeven van het genereren van AAV-bibliotheken met streepjescode en de NGS-pijplijn die in dezelfde publicatie wordt gebruikt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

Genafgiftevectoren afgeleid van Adeno-geassocieerd virus (AAV) zijn een van de meest veelbelovende hulpmiddelen voor de behandeling van genetische ziekten, wat blijkt uit bemoedigende klinische gegevens en de goedkeuring van verschillende AAV-gentherapieën. Twee belangrijke redenen voor het succes van AAV-vectoren zijn (i) de voorafgaande isolatie van verschillende natuurlijk voorkomende virale serotypen met verschillende eigenschappen, en (ii) de daaropvolgende vestiging van krachtige technologieën voor hun moleculaire engineering en herbestemming in hoge doorvoer. Het potentieel van deze technieken wordt verder vergroot door recent geïmplementeerde strategieën voor het barcoderen van geselecteerde AAV-capsiden op DNA- en RNA-niveau, waardoor hun uitgebreide en parallelle in vivo stratificatie in alle belangrijke organen en celtypen in een enkel dier mogelijk wordt. Hier presenteren we een basispijplijn die deze reeks complementaire wegen omvat, met behulp van AAV-peptideweergave om het gevarieerde arsenaal aan beschikbare capsid-engineeringtechnologieën te vertegenwoordigen. Dienovereenkomstig beschrijven we eerst de cruciale stappen voor het genereren van een AAV-peptideweergavebibliotheek voor de in vivo selectie van kandidaten met gewenste eigenschappen, gevolgd door een demonstratie van hoe de meest interessante capside-varianten voor secundaire in vivo screening kunnen worden gebarcodeerd. Vervolgens illustreren we de methodologie voor het maken van bibliotheken voor next-generation sequencing (NGS), inclusief barcodeversterking en adapterligatie, voordat we afsluiten met een overzicht van de meest kritieke stappen tijdens NGS-gegevensanalyse. Omdat de hier gerapporteerde protocollen veelzijdig en aanpasbaar zijn, kunnen onderzoekers ze gemakkelijk gebruiken om de optimale AAV-capside-varianten in hun favoriete ziektemodel en voor gentherapietoepassingen te verrijken.

Genereren van een AAV2 peptide display library. Als eerste stap naar de selectie van technische AAV's wordt het genereren van een plasmidebibliotheek beschreven. De peptide insert wordt geproduceerd met behulp van gedegenereerde primers. Het verminderen van de combinatie van codons in die van 64 tot 20 heeft de voordelen van het elimineren van stopcodons en het vergemakkelijken van NGS-analyse, door de bibliotheekdiversiteit op het DNA te verminderen, maar niet op het eiwitniveau. De oligonucleotide-ins...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

AAV-peptideweergavebibliotheek generatie en daaropvolgende validatie door de barcodering van kandidaten met nieuwe eigenschappen voor het maken van AAV's van de volgende generatie.

Isolatie van gentherapievectoren van de volgende generatie door middel van engineering, barcoding en screening van adeno-geassocieerde virus (AAV) capsid-varianten

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Dit protocol dicht een aanzienlijke kloof tussen de natuurlijke evolutie van virussen en hun gebruik als recombinante vectoren voor menselijke gentherapie door hun engineering, diversificatie en stratificatie mogelijk te maken. Deze techniek maakt de high-throughput parallelle screening op nieuwe, geïsoleerde of gemanipuleerde adeno-geassocieerde virussen, kortweg AAV, varianten mogelijk, waardoor wordt bespaard op dieraantallen, werk, kosten en tijd. De geïdentificeerde AVV capsid varianten kunnen de werkzaamheid en specificiteit van AAV-gebaseerde toediening van therapeutische transgenen verhogen, waardoor de vereiste virale dosis wordt verlaagd.Dit zou de veiligheid en toepasbaarheid van gentherapie kunnen verbeteren. Dezelfde aanpak kan ook worden gebruikt voor capsid of promoter engineering van andere genafgiftevoertuigen die ons begrip van hun biologie en hun gebruik in gentherapie verbeteren. Promovendi Jonas Becker en Jixin Liu, postdoc Joanna Szumska en Margarita Zayas, maar ook onderzoeksassistenten Emma Gerstmann en Ellen Widtke van mijn laboratorium helpen de procedure te demonstreren.Begin met het analyseren van de NGS-sequencinggegevens met Python 3 en Biopython. De NGS-analyse bestaat uit twee stappen. Zoek voor de eerste stap in de sequentiebestanden naar reeksen die voldoen aan specifieke criteria, zoals flankerende reeksen, lengte en locatie met behulp van script één en een configuratiebestand dat de benodigde informatie biedt.Voor de tweede stap vertaalt u de geëxtraheerde sequenties vanaf de AGWGGC-reeks met behulp van script nummer twee en de configuratie en zuordnung. txt-bestanden die de benodigde informatie bieden. Bereid twee mappen voor:script en gegevens.Kopieer de gecomprimeerde Gzip-bestanden die het resultaat zijn van de sequencing naar de gegevensmap. Kopieer vervolgens de Python- en configuratiebestanden naar de scriptmap zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voordat u de scripts uitvoert, opent u de zuordnung.txt-bestand en voeg twee door tabs gescheiden kolommen toe. Voer de namen van de Gzip-bestanden in kolom één en de gewenste eindnaam in kolom twee in. Wijzig de variabelen in het configuratiebestand zoals beschreven in het tekstmanuscript.Start met de specifieke opdracht de detectie en extractie van de variantvolgorde. De uitvoer bestaat uit TXT-bestanden met de geëxtraheerde DNA-sequenties en hun aantal reads. De header van dit bestand bevat statistische gegevens en deze gegevens worden overgebracht naar de volgende bestanden.Deze TXT-gegevens zijn het invoerbestand voor script nummer twee waarin de DNA-sequenties worden vertaald, gerangschikt en geanalyseerd. Start met behulp van de specifieke opdracht PV-vertaling en analyse van de tekstuitvoerbestanden van script één zoals beschreven in het tekstmanuscript. De uitvoerbestanden van script nummer twee krijgen een naam met behulp van de tweede kolom van de opzoektabel in zuordnung.txt met extensies op basis van het type analyse. Zorg ervoor dat de drie uitvoerbestanden statistische gegevens bevatten in de eerste rijen en een eerste kolom met de index van elke DNA-sequentie uit de invoertekstbestanden. De overige kolommen moeten bestaan uit de DNA-sequentie, het aantal reads, forward of reverse read en de vertaalde peptidesequentie.De ongeldige reeksen moeten NA hebben en niet geldig zijn in de laatste twee kolommen. Visualiseer de uitvoerbestanden met behulp van beschikbare software op basis van de behoeften van de gebruiker. Om de analyse van de NGS-sequencinggegevens uit te voeren met behulp van aangepaste code in Python 3, omvat de workflow de detectie van barcodesequenties geleid door flankerende sequenties, hun lengte en locatie, evenals analyse van barcodeverrijking en -distributie over de set weefsels.Bereid twee mappen voor:script en gegevens. Kopieer de gecomprimeerde Gzip-bestanden die het resultaat zijn van de sequencing naar de gegevensmap. Kopieer vervolgens de python- en configuratiebestanden naar de scriptmap zoals beschreven in het tekstmanuscript.Voordat u het script uitvoert, maakt u twee door tabs gescheiden tekstbestanden:de capsidvariantie. txt-bestand met de streepjescodesequenties toegewezen aan AAV capsid-variantnamen en de verontreiniging. txt-bestand met barcodesequenties die afkomstig zijn van mogelijke besmetting.Bewerk ten slotte het configuratiebestand om de informatie van het pad naar de map met volgordegegevens, de volgorde van flankerende gebieden van de streepjescodes, hun positie en venstergrootte voor streepjescodedetectie op te nemen. Voer het streepjescodedetectiescript uit met de meegeleverde paden en configuratiebestanden met behulp van de respectieve opdracht. De uitvoer van deze opdrachtuitvoering zijn TXT-bestanden met hertellingen per capsid-variant en het totale aantal leesbewerkingen dat is hersteld van de onbewerkte gegevens.Om de verdeling van AAV-capsid met streepjescode tussen weefsels of organen in de zuordnung te evalueren. txt-bestand, wijs de naam van elk tekstbestand dat is verkregen uit de streepjescodedetectierun toe aan een weefsel- of orgaannaam. Voeg de namen van tekstbestanden in de eerste kolom en de bijbehorende weefsel- of orgaannamen toe in de door tabs gescheiden toewijzing.Maak een orgel. txt-bestand met de lijst met namen voor on- en off-target orgels, die overeenkomen met de namen in de opdracht Zuordnung. txt-bestand.Maak vervolgens normalization_organ. txt en normalization_variant. Txt-tabblad Tekstbestanden met genormaliseerde waarden voor alle Capsid-varianten en alle organen en weefsels.In de eerste kolom met de normalization_organ. txt-bestand, schrijf de namen die voor elk orgaan zijn gegeven en de tweede kolom met normalisatiewaarden voor het overeenkomstige weefsel. Vul de eerste kolom van de normalization_variant.txt-bestand met de lijst met capsid-namen en de tweede kolom met de genormaliseerde waarden van de gelezen tellingen voor elke capsid in de gegroepeerde bibliotheek. Bewerk het configuratiebestand door de volledige paden naar alle extra bestanden op te geven en voer het streepjescodeanalysescript uit met deze specifieke opdracht. Het barcode-analysescript voert verschillende bestanden uit, zoals de tekstbestanden met relatieve concentratie of RC-waarden van capsid-distributie binnen verschillende weefsels op basis van meerdere eerder beschreven normalisatiestappen, en het spreadsheetbestand dat tekstbestandsgegevens combineert tot samengevoegde matrixgegevens.Visualiseer de gegevens en voer clusteranalyse uit van de matrixgegevens zoals beschreven in het tekstmanuscript. Het script zal de relatieve concentratie invoeren. XLS-bestanden en genereer twee plots van hiërarchische clusterheatmap en hoofdcomponentanalyse.Als u plots of PNG-parameters wilt wijzigen, opent u het R-script en volgt u de instructies in de opmerkingensectie. De gekwantificeerde regio's van het AAV2-rep-gen toonden aan dat 99,2% positief was voor ITR, wat suggereert dat de AAV-capsiden het volledige virale genoom bevatten. In alle drie de sets vertegenwoordigden de geëxtraheerde reads op basis van handtekeningsequenties die specifiek zijn voor de bibliotheek ongeveer 94% van de totale reads, wat wijst op een goede kwaliteit.Hiervan waren meer dan 99% geldige PV-lezingen en meer dan 99% van de geldige PV-lezingen waren uniek, wat suggereert dat de bibliotheek in evenwicht was met een hoge interne diversiteit. De twee belangrijkste takken van de heatmaphiërarchie weerspiegelden het verschil in de transductie-efficiëntie van capside-varianten. De linkertak met de meerderheid van de capsid-varianten omvatte alle capsiden die een hoge relatieve concentratiewaarde vertoonden over de meeste weefsels.Afgezien van opvallend hoge leverspecificiteit, vertoonden drie andere capsiden specificiteit in het middenrif, skeletspieren, biceps en hersenen. De rechtertak van de hiërarchische clustering omvatte de capside-varianten met een algehele lagere transductie-efficiëntie die het meest zichtbaar was in de twaalfvingerige darm en de pancreas. De belangrijkste componentanalyse voor de oorspronkelijke subgroep vormt het cluster van capsidvarianten met hoge leverspecificiteit en schetst het VAR60 capsid outstanding muscle tropism.Wanneer u dit protocol probeert, moet u letten op typefouten. De syntaxis is ook anders als u de Windows-opdrachtprompt gebruikt in vergelijking met Linux. Na de identificatie van nieuwe AAV-varianten moet het therapeutische en translationele potentieel worden geverifieerd in een overleden of groter diermodel.Deze techniek maakt een directe zij-aan-zij vergelijking van AAV-varianten onder identieke omstandigheden mogelijk en is uiterst veelzijdig, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor de vertaling ervan bij grote dieren of zelfs bij mensen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System voor functioneel herstel van Hemiplegische Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Voorspellen van genstyling door middel van de spatiotemporale controle van siRNA-vrijgave van foto-responsieve polymere nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Cavitatie verbeterde therapie bestuderen

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...