Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. apprécie grandement le soutien de la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par l’intermédiaire des centres de recherche collaborative DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) et TRR179 (Projektnummer 272983813), ainsi que du Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF, BMBF; TTU-VIH 04.819).

1. Préparation de la bibliothèque d’affichage de peptides 7-mer aléatoires AAV2
REMARQUE: Pour la préparation d’une bibliothèque d’affichage peptidique aléatoire AAV2, synthétisez les oligonucléotides dégénérés sous forme d’ADN simple brin, convertissez-le en ADN double brin, digérez, ligaturez le plasmide accepteur et électroporate.
<ol><li>Conception d’oligonucléotides dégénérés<ol><li>Ordonner les oligonucléotides dégénérés et éviter le ...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy.">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues,+as+pipeline+matures.">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+at+the+crossroads.">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).</li><li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification,+Rational+Design+and+Machine+Learning.">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756 (2022).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Sahel, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types.">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li><li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression.">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li><li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning.">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species.">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li><li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism.">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li><li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors.">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li><li>Ogden, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design.">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li><li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system.">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li><li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants.">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).</li><li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone.">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li><li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening.">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li><li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling.">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses.">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy.">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li><li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing.">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).</li><li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNABarcodes:+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags.">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq.">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).</li><li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors.">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li><li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+design:+A+Goldilocks+challenge.">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li><li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing.">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).</li></ol>

Dans ce protocole, les étapes nécessaires à l’ingénierie de la capside AAV d’affichage peptidique et au criblage de bibliothèques AAV à code-barres, ainsi qu’à l’analyse bioinformatique de la composition de la bibliothèque et des performances de la capside, sont décrites. Ce protocole se concentre sur les étapes qui facilitent l’analyse bioinformatique de ces types de bibliothèques, car la plupart des laboratoires de virologie accusent un retard dans les compétences en programmation correspondant à...

La thérapie par transfert de gènes est l’introduction de matériel génétique dans les cellules pour réparer, remplacer ou modifier le matériel génétique cellulaire afin de prévenir, traiter, guérir ou améliorer la maladie. Le transfert de gènes, à la fois in vivo et ex vivo, repose sur différents systèmes d’administration, non viraux et viraux. Les virus ont évolué naturellement pour transduire efficacement leurs cellules cibles et peuvent être utilisés comme vecteurs de livraison. Parmi les différents types de vecteurs viraux utilisés en thérapie génique, les virus adéno-associés ont été de plus en plus utilisés, en raison de leur absence de pathogénicité, de leur innocuité, de leur faible immunogénicité et, surtout, de leur capacité à maintenir une expression non intégratrice à long terme 1,2,3. La thérapie génique AAV a donné lieu à des réalisations considérables au cours de la dernière décennie; trois thérapies ont été approuvées par l’Agence européenne des médicaments et la Food and Drug Administration des États-Unis pour une utilisation chez l’homme 3,4. Plusieurs essais cliniques sont également en cours pour traiter diverses maladies, comme l’hémophilie, les maladies musculaires, cardiaques et neurologiques, comme on l’a vu ailleurs3. Malgré des décennies de progrès, le domaine de la thérapie génique a connu une série de revers ces dernières années4, surtout des décès dans les essais cliniques5 qui ont été suspendus en raison de toxicités limitant la dose, en particulier pour les tissus massifs, tels que les muscles, ou difficiles à atteindre, tels que le cerveau6.
Les vecteurs AAV actuellement utilisés dans les essais cliniques appartiennent aux sérotypes naturels à quelques exceptionsprès 1. L’ingénierie AAV offre la possibilité de développer des vecteurs avec une spécificité et une efficacité supérieures pour les organes ou les cellules. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs approches ont été appliquées avec succès, telles que l’affichage peptidique, l’échange de boucles, le brassage de l’ADN de la capside, la PCR sujette aux erreurs et la conception ciblée, pour générer des variantes AAV individuelles ou des bibliothèques de celles-ci avec diverses propriétés7. Ceux-ci sont ensuite soumis à de multiples cycles d’évolution dirigée pour sélectionner les variantes en leur sein avec les propriétés souhaitées, comme examiné ailleurs 1,3. De toutes les stratégies d’évolution de la capside, les bibliothèques AAV d’affichage peptidique ont été les plus largement utilisées, en raison de certaines propriétés uniques: elles sont relativement faciles à générer et peuvent atteindre une grande diversité et un séquençage à haut débit, ce qui permet de suivre leur évolution.
Les premières bibliothèques AAV d’insertion de peptides réussies ont été décrites il y a près de 20 ans. Dans l’un des premiers, Perabo et al.8 ont construit une bibliothèque de capsides AAV2 modifiées, dans laquelle un pool d’oligonucléotides générés aléatoirement a été inséré dans un plasmide à une position qui correspond à l’acide aminé 587 de la protéine de capside VP1, dans le triple axe dépassant de la capside. En utilisant la co-infection par l’adénovirus, la bibliothèque AAV a été développée à travers plusieurs cycles de sélection, et les variantes finales reciblées se sont révélées capables de transduire des lignées cellulaires réfractaires à l’AAV2parental 8. Peu de temps après, Müller et al.9 ont introduit le système en deux étapes pour la production en bibliothèque, une amélioration significative du protocole. Initialement, la bibliothèque plasmidique, ainsi qu’un plasmide auxiliaire adénoviral, sont utilisés pour produire une bibliothèque AAV qui contient des capsides chimériques. Cette bibliothèque de navettes AAV est utilisée pour infecter des cellules à faible multiplicité d’infection (MOI), dans le but d’introduire un génome viral par cellule. La co-infection par l’adénovirus assure la production d’AAV avec un génome et une capside9 correspondants. Environ une décennie plus tard, Dalkara10 a utilisé l’évolution dirigée in vivo pour créer la variante 7m8. Cette variante a une insertion de 10 acides aminés (LALGETTRPA), dont trois agissent comme des agents de liaison, et cible efficacement la rétine externe après injection intravitréenne10. Cette capside artificielle est une réussite exceptionnelle, car c’est l’une des rares capsides modifiées à se rendre à la clinique jusqu’àprésent11.
Le domaine a connu un deuxième coup de pouce avec l’introduction de techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS). Deux publications d’Adachi et al.12 en 2014 et de Marsic et al.13 en 2015, ont montré la puissance du NGS pour suivre la distribution des bibliothèques de capsides AAV à code-barres avec une grande précision. Quelques années plus tard, le NGS des régions à code-barres a été adapté à la région d’insertion peptidique pour suivre l’évolution de la capside. Körbelin et coll.14 ont effectué un dépistage guidé par NGS pour identifier une capside pulmonaire ciblée basée sur AAV2. L’analyse NGS a permis de calculer trois scores de notation : le score d’enrichissement entre les tours de sélection, le score de spécificité générale pour déterminer la spécificité tissulaire, et enfin le score combiné14. Le laboratoire Gradinaru15 a publié le système d’évolution ciblée AAV basé sur la recombinaison Cre (CREATE) la même année, qui facilite une sélection spécifique au type cellulaire. Dans ce système, la bibliothèque de capsides porte un commutateur Cre-inversible, car le signal polyA est flanqué de deux sites loxP. La bibliothèque AAV est ensuite injectée chez les souris Cre, où le signal polyA est inversé uniquement dans les cellules Cre+, fournissant le modèle pour la liaison d’une amorce de PCR inverse avec l’amorce directe dans le gène de la capside. Ce sauvetage PCR très spécifique a permis l’identification de l’AAV-PHP. Variante B qui peut traverser la barrière hémato-encéphalique15. Ce système a ensuite évolué pour devenir M-CREATE (Multiplexed-CREATE), dans lequel NGS et la génération de bibliothèques synthétiques ont été intégrées dans le pipeline16.
Une version améliorée à base d’ARN de ce système du laboratoire Maguire17, iTransduce, permet de sélectionner au niveau de l’ADN des capsides qui transduisent fonctionnellement les cellules et expriment leurs génomes. Le génome viral de la bibliothèque d’affichage peptidique comprend un gène Cre sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire et le gène de la capside sous le contrôle du promoteur p41. La bibliothèque est injectée chez des souris qui ont une cassette loxP-STOP-loxP en amont de tdTomato. Les cellules transduites avec des variantes AAV qui expriment le génome viral et donc Cre expriment tdTomato et, en combinaison avec des marqueurs cellulaires, peuvent être triées et sélectionnées17. De même, Nonnenmacher et al.18 et Tabebordbar et al.19 ont placé la bibliothèque de gènes de la capside sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux tissus. Après injection dans différents modèles animaux, l’ARN viral a été utilisé pour isoler les variantes de capside.
Une autre approche consiste à utiliser le code-barres pour baliser les bibliothèques de capsides. Le laboratoire Björklund20 a utilisé cette approche pour les bibliothèques de capsides d’insertion de peptides à code-barres et a développé l’évolution rationnelle du vecteur AAV à code-barres (BRAVE). Dans un plasmide, la cassette Rep2Cap est clonée à côté d’un transgène à code-barres à répétitions terminales inversées (ITR) exprimant une protéine fluorescente jaune (YFP). En utilisant des sites loxP entre la fin du bouchon et le début du code-barres, une recombinaison Cre in vitro génère un fragment suffisamment petit pour le NGS, permettant ainsi l’association de l’insertion peptidique avec le code-barres unique (table de consultation, LUT). La production d’AAV est réalisée à l’aide de la bibliothèque plasmidique et les codes-barres exprimés dans l’ARNm sont criblés après application in vivo , toujours avec NGS20. Lorsque les bibliothèques de capsides comprennent des variantes de l’ensemble du gène de la capside (c.-à-d. bibliothèques mélangées), le séquençage à lecture longue doit être utilisé. Plusieurs groupes ont utilisé des codes-barres pour étiqueter ces diverses bibliothèques, ce qui permet à NGS d’avoir une profondeur de lecture plus élevée. Le laboratoire Kay21 a étiqueté des bibliothèques mélangées de capsides très diverses avec des codes-barres en aval du signal polyA du capuchon . Dans un premier temps, une bibliothèque de plasmides à code-barres a été générée et la bibliothèque de gènes de capside mélangée y a été clonée. Ensuite, une combinaison de MiSeq (lecture courte, profondeur de lecture plus élevée) et PacBio (lecture longue, profondeur de lecture inférieure) NGS ainsi que le séquençage Sanger a été utilisée pour générer leur LUT21. En 2019, Ogden et ses collègues du laboratoireChurch 22 ont délimité l’aptitude de la capside AAV2 à plusieurs fonctions à l’aide de bibliothèques comportant des mutations, des insertions et des suppressions ponctuelles dans chaque position, ce qui a finalement permis une conception guidée par machine. Pour la génération de la bibliothèque, des fragments plus petits du gène de la capside ont été synthétisés, marqués avec un code-barres, séquencés de nouvelle génération, puis clonés dans le gène complet de la capside. Les données NGS ont été utilisées pour générer une LUT. La bibliothèque a ensuite été examinée à l’aide uniquement des codes-barres et du séquençage de lecture courte, ce qui permet une profondeur de lecture plus élevée22.
Les bibliothèques à code-barres ont été principalement utilisées pour examiner un pool de variantes connues, naturelles et artificielles après plusieurs cycles de sélection de bibliothèques de capsides ou indépendamment d’une étude de l’évolution de la capside. L’avantage de ces bibliothèques est la possibilité de cribler plusieurs capsides, tout en réduisant le nombre d’animaux et en minimisant les variations entre les animaux. Les premières études qui ont introduit cette technologie dans le domaine de l’AAV ont été publiées il y a près de dix ans. Le laboratoire Nakai 12 a marqué 191 mutants doubles alanine couvrant les acides aminés 356 à 736 sur le VP1 de AAV9 avec une paire de codes-barres12 nucléotides. À l’aide de NGS, la bibliothèque a été examinée in vivo pour la liaison au galactose et d’autres propriétés12. Marsic et ses collègues ont délimité la biodistribution des variantes AAV en utilisant également une analyse à double barcordée 1 an plus tard13. Une étude plus récente chez des primates non humains a comparé la biodistribution dans le système nerveux central de 29 capsides en utilisant différentes voies d’administration23. Notre laboratoire a récemment publié des criblages de bibliothèque AAV à code-barres de 183 variantes comprenant des AAV naturels et artificiels. Ces criblages au niveau de l’ADN et de l’ARN ont conduit à l’identification d’une variante AAV24 hautement myotrope chez la souris ainsi que d’autres présentant une spécificité de type cellulaire élevée dans le cerveau de souris25.
Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée dans ce travail et l’élargissons pour inclure le criblage des bibliothèques d’affichage de peptides AAV. Cela comprend la génération de bibliothèques d’affichage de peptides AAV2, une méthode de PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) pour la quantification, et enfin un pipeline NGS pour analyser les variantes AAV, basé en partie sur les travaux de Weinmann et ses collègues24. Enfin, une description de la génération de bibliothèques AAV à code-barres et du pipeline NGS utilisé dans la même publication est fournie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

Les vecteurs de livraison de gènes dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont l’un des outils les plus prometteurs pour le traitement des maladies génétiques, comme en témoignent les données cliniques encourageantes et l’approbation de plusieurs thérapies géniques AAV. Deux raisons majeures du succès des vecteurs AAV sont (i) l’isolement préalable de divers sérotypes viraux naturels ayant des propriétés distinctes, et (ii) la mise en place ultérieure de technologies puissantes pour leur ingénierie moléculaire et leur réutilisation à haut débit. Le potentiel de ces techniques est récemment mis en œuvre pour coder à barres des capsides AAV sélectionnées au niveau de l’ADN et de l’ARN, permettant leur stratification in vivo complète et parallèle dans tous les principaux organes et types de cellules d’un seul animal. Ici, nous présentons un pipeline de base englobant cet ensemble de voies complémentaires, en utilisant l’affichage peptidique AAV pour représenter l’arsenal diversifié de technologies d’ingénierie de capside disponibles. En conséquence, nous décrivons d’abord les étapes cruciales de la génération d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV pour la sélection in vivo de candidats ayant les propriétés souhaitées, suivie d’une démonstration de la façon de coder à barres les variantes de capside les plus intéressantes pour le criblage secondaire in vivo. Ensuite, nous illustrons la méthodologie de création de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris l’amplification de codes-barres et la ligature d’adaptateurs, avant de conclure par un aperçu des étapes les plus critiques de l’analyse des données NGS. Comme les protocoles rapportés ici sont polyvalents et adaptables, les chercheurs peuvent facilement les exploiter pour enrichir les variantes optimales de capside AAV dans leur modèle de maladie préféré et pour des applications de thérapie génique.

Génération d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV2. Comme première étape vers la sélection d’AAV techniques, la génération d’une bibliothèque de plasmides est décrite. L’insert peptidique est produit à l’aide d’amorces dégénérées. Réduire la combinaison de codons chez ceux de 64 à 20 a l’avantage d’éliminer les codons stop et de faciliter l’analyse NGS, en réduisant la diversité des bibliothèques sur l’ADN mais pas au niveau de la protéine. L’insert ...

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Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Génération de bibliothèque d’affichage de peptides AAV et validation ultérieure par le codage à barres de candidats ayant de nouvelles propriétés pour la création d’AAV de nouvelle génération.

Isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Ce protocole comble un écart important entre l’évolution naturelle des virus et leur utilisation comme vecteurs recombinants pour la thérapie génique humaine en permettant leur ingénierie, leur diversification et leur stratification. Cette technique permet le criblage parallèle à haut débit de virus adéno-associés nouveaux, isolés ou modifiés, en abrégé AAV, ce qui permet d’économiser sur le nombre d’animaux, le travail, les coûts et le temps. Les variantes de capside du VHA identifiées peuvent augmenter l’efficacité et la spécificité de l’administration de transgènes thérapeutiques à base d’AAV, réduisant ainsi la dose virale requise.Cela pourrait améliorer la sécurité et l’applicabilité de la thérapie génique. La même approche pourrait également être utilisée pour l’ingénierie de la capside ou du promoteur d’autres véhicules de livraison de gènes, ce qui améliore notre compréhension de leur biologie et de leur utilisation en thérapie génique. Les doctorants Jonas Becker et Jixin Liu, la post-doctorante Joanna Szumska et Margarita Zayas, ainsi que les assistantes de recherche Emma Gerstmann et Ellen Widtke de mon laboratoire aideront à démontrer la procédure.Commencez par analyser les données de séquençage NGS avec Python 3 et Biopython. L’analyse NGS est composée de deux étapes. Pour la première étape, recherchez dans les fichiers de séquence des séquences qui répondent à des critères spécifiques tels que les séquences latérales, la longueur et l’emplacement à l’aide du script un, ainsi qu’un fichier de configuration qui fournit les informations nécessaires.Pour la deuxième étape, traduisez les séquences extraites à partir de la séquence AGWGGC en utilisant le script numéro deux et la configuration et zuordnung. txt qui fournit les informations nécessaires. Préparez deux dossiers : script et données.Copiez les fichiers compressés Gzip résultant du séquençage dans le dossier de données. Copiez ensuite les fichiers Python et de configuration dans le dossier de script comme décrit dans le manuscrit texte. Avant d’exécuter les scripts, ouvrez le zuordnung.TXT et ajoutez deux colonnes séparées par des tabulations. Entrez les noms des fichiers Gzip dans la première colonne et le nom final souhaité dans la deuxième colonne. Modifiez les variables dans le fichier de configuration comme décrit dans le manuscrit texte.À l’aide de la commande spécifique, lancez la détection et l’extraction de la séquence de variantes. La sortie sera des fichiers TXT avec les séquences d’ADN extraites et leur nombre de lectures. L’en-tête de ce fichier contient des données statistiques et ces données seront transférées dans les fichiers suivants.Ces données TXT seront le fichier d’entrée du script numéro deux dans lequel les séquences d’ADN sont traduites, classées et analysées. À l’aide de la commande spécifique, lancez la traduction PV et l’analyse des fichiers de sortie texte du script un, comme décrit dans le manuscrit du texte. Les fichiers de sortie du script numéro deux seront nommés à l’aide de la deuxième colonne de la table de choix dans zuordnung.TXT avec extensions basées sur le type d’analyse. Assurez-vous que les trois fichiers de sortie contiennent des données statistiques dans les premières lignes et une première colonne avec l’index de chaque séquence d’ADN des fichiers texte d’entrée. Les colonnes restantes doivent comprendre la séquence d’ADN, le nombre de lectures, la lecture directe ou inverse et la séquence peptidique traduite.Les séquences non valides doivent avoir NA et ne pas être valides dans les deux dernières colonnes. Visualisez les fichiers de sortie à l’aide des logiciels disponibles en fonction des besoins de l’utilisateur. Pour effectuer l’analyse des données de séquençage NGS à l’aide de code personnalisé dans Python 3, le flux de travail comprend la détection de séquences de codes-barres guidées par les séquences latérales, leur longueur et leur emplacement, ainsi que l’analyse de l’enrichissement et de la distribution des codes-barres sur l’ensemble des tissus.Préparez deux dossiers : script et données. Copiez les fichiers compressés Gzip résultant du séquençage dans le dossier de données. Copiez ensuite le python et les fichiers de configuration dans le dossier de script comme décrit dans le manuscrit texte.Avant d’exécuter le script, créez deux fichiers texte délimités par des tabulations :capsidvariance. txt avec les séquences de codes-barres attribuées aux noms de variantes de capside AAV et la contamination. TXT avec des séquences de codes-barres provenant d’une contamination possible.Enfin, modifiez le fichier de configuration pour inclure les informations du chemin d’accès au dossier avec les données de séquencement, la séquence des régions flanquantes des codes-barres, leur position et la taille de la fenêtre pour la détection des codes-barres. Exécutez le script de détection de code-barres avec les chemins d’accès et les fichiers de configuration fournis à l’aide de la commande correspondante. La sortie de l’exécution de cette commande sera des fichiers TXT avec des recomptages par variante de capside et le nombre total de lectures récupérées à partir des données brutes.Évaluer la distribution de la capside AAV à code-barres parmi les tissus ou les organes, dans la zuordnung. TXT, attribuez le nom de chaque fichier texte obtenu à partir de l’exécution de détection de code-barres à un nom de tissu ou d’organe. Ajoutez les noms des fichiers texte dans la première colonne et les noms de tissus ou d’organes correspondants dans l’affectation délimitée par des onglets.Créez un organe. TXT avec la liste des noms des organes sur et hors cible, qui correspondent aux noms donnés dans l’affectation Zuordnung. TXT.Ensuite, créez normalization_organ. txt et normalization_variant. Fichiers texte délimités par la tabulation TXT avec des valeurs normalisées pour toutes les variantes de capside et tous les organes et tissus.Dans la première colonne avec le normalization_organ. txt, écrivez les noms donnés pour chaque organe et la deuxième colonne avec les valeurs de normalisation du tissu correspondant. Renseignez la première colonne de la normalization_variant.TXT avec la liste des noms de capside et la deuxième colonne avec les valeurs normalisées du nombre de lectures pour chaque capside dans la bibliothèque regroupée. Modifiez le fichier de configuration en spécifiant les chemins d’accès complets à tous les fichiers supplémentaires et exécutez le script d’analyse de code-barres à l’aide de cette commande spécifique. Le script d’analyse de code-barres génère plusieurs fichiers tels que les fichiers texte avec la concentration relative ou les valeurs RC de la distribution de la capside dans différents tissus en fonction de plusieurs étapes de normalisation décrites précédemment, et le fichier de feuille de calcul qui combine les données du fichier texte dans les données matricielles fusionnées.Visualisez les données et effectuez une analyse groupée des données matricielles comme décrit dans le manuscrit texte. Le script saisira la concentration relative. xls et générer deux tracés de carte thermique de cluster hiérarchique et d’analyse en composantes principales.Pour modifier des tracés ou des paramètres PNG, ouvrez le script R et suivez les instructions de la section des commentaires. Les régions quantifiées du gène AAV2 rep ont montré que 99,2% étaient positives pour ITR, ce qui suggère que les capsides AAV contenaient l’intégralité des génomes viraux. Dans les trois ensembles, les lectures extraites basées sur des séquences de signatures spécifiques à la bibliothèque représentaient environ 94% du total des lectures, ce qui indique une bonne qualité.Parmi ceux-ci, plus de 99 % étaient des lectures PV valides et plus de 99 % des lectures PV valides étaient uniques, ce qui suggère que la bibliothèque était équilibrée avec une grande diversité interne. Les deux principales branches de la hiérarchie de la carte thermique reflétaient la différence d’efficacité de transduction des variantes de capside. La branche gauche avec la majorité des variantes de capside comprenait toutes les capsides qui montraient une valeur de concentration relative élevée dans la plupart des tissus.Outre une spécificité hépatique étonnamment élevée, trois autres capsides présentaient une spécificité dans le diaphragme, le muscle squelettique, les biceps et le cerveau. La branche droite du regroupement hiérarchique comprenait les variantes de capside avec une efficacité de transduction globale plus faible plus évidente dans le duodénum et le pancréas. L’analyse en composantes principales pour le sous-ensemble original forme le groupe de variantes de capside avec une spécificité hépatique élevée et décrit le tropisme musculaire exceptionnel de la capside VAR60.Lorsque vous essayez ce protocole, vous devez faire attention aux erreurs de frappe. La syntaxe est également différente si vous utilisez l’invite de commande Windows par rapport à Linux. Après l’identification de nouvelles variantes d’AAV, le potentiel thérapeutique et translationnel doit être vérifié dans un modèle animal décédé ou plus grand.Cette technique permet une comparaison directe côte à côte des variantes AAV dans des conditions identiques et est extrêmement polyvalente, ouvrant la voie à sa traduction chez les grands animaux, voire chez l’homme.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Système de thérapie robotique Miroir pour la récupération fonctionnelle des bras hémiplégique

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolement des murins dérivés tissu adipeux microvasculaire fragments comme Vascularization unités pour l&#39;ingénierie tissulaire

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Prévoir le silencieux des gènes grâce au contrôle spatiotemporel de la libération de siRNA de Nanocarriers polymériques adaptés à la photo

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Étude de la thérapie améliorée par cavitation

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Interfaces d’hydrogel photodégradables pour le dépistage, la sélection et l’isolement des bactéries

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...