Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. מעריכה מאוד את תמיכתה של קרן המחקר הגרמנית (DFG) באמצעות מרכזי המחקר השיתופיים של DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) ו-TRR179 (Projektnummer 272983813), כמו גם על ידי המרכז הגרמני לחקר זיהומים (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

1. הכנת ספריית תצוגה פפטידית אקראית AAV2 7-mer
הערה: להכנת ספריית תצוגה של פפטידים אקראיים AAV2, סנתז את האוליגונוקלאוטידים המנוונים כדנ"א חד-גדילי, המר אותו לדנ"א דו-גדילי, עכל, קשר לפלסמיד המקבל ואלקטרופורט.
<ol><li>תכנון אוליגונוקלאוטידים מנוונים<ol><li>סדרו את האוליגונוקלא?...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy.">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues,+as+pipeline+matures.">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+at+the+crossroads.">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).</li><li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification,+Rational+Design+and+Machine+Learning.">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756 (2022).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy.">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li><li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing.">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075 (2014).</li><li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing.">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 2, 15041 (2015).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries.">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types.">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li><li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression.">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li><li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning.">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species.">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li><li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism.">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li><li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors.">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li><li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design.">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li><li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system.">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li><li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants.">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).</li><li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone.">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li><li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening.">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li><li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling.">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).</li><li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li><li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens.">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries.">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li><li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo.">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li><li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses.">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy.">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li><li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing.">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).</li><li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNABarcodes:+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags.">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq.">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).</li><li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors.">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li><li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+design:+A+Goldilocks+challenge.">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li><li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing.">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).</li></ol>

בפרוטוקול זה, מתוארים השלבים הדרושים להנדסת קפסיד AAV של תצוגת פפטיד ולהקרנת ספריית AAV עם ברקוד, כמו גם לניתוח ביואינפורמטי של הרכב הספרייה וביצועי הקפסיד. פרוטוקול זה מתמקד בצעדים המאפשרים ניתוח ביואינפורמטי של ספריות מסוג זה, מכיוון שרוב מעבדות הווירולוגיה מפגרות בכישורי תכנות כדי להתאי...

טיפול בהעברת גנים הוא החדרת חומר גנטי לתאים כדי לתקן, להחליף או לשנות את החומר הגנטי התאי כדי למנוע, לטפל, לרפא או לשפר מחלות. העברת גנים, הן in vivo והן ex vivo, מסתמכת על מערכות העברה שונות, לא ויראליות וויראליות. וירוסים התפתחו באופן טבעי כדי להתמיר ביעילות את תאי המטרה שלהם ויכולים לשמש כווקטורי מסירה. בין הסוגים השונים של וקטורים נגיפיים המשמשים בריפוי גנטי, וירוסים הקשורים באדנו נמצאים בשימוש הולך וגובר, בשל חוסר הפתוגניות שלהם, בטיחותם, אימונוגניות נמוכה, והכי חשוב יכולתם לקיים ביטוי ארוך טווח, לא משלב 1,2,3. הטיפול הגנטי AAV הניב הישגים ניכרים בעשור האחרון; שלושה טיפולים אושרו על ידי סוכנות התרופות האירופית ומנהל המזון והתרופות האמריקאי לשימוש בבני אדם 3,4. כמו כן, נערכים מספר ניסויים קליניים לטיפול במגוון מחלות, כגון המופיליה, מחלות שרירים, לב ונוירולוגיה, כפי שנסקר במקום אחר3. למרות עשרות שנים של התקדמות, תחום הריפוי הגנטי חווה בשנים האחרונות שורה של כישלונות4, ובראשם מקרי מוות בניסויים קליניים5 שהוקפאו עקב רעילות המגבילה מינון, במיוחד עבור רקמות מסיביות, כגון שריר, או קשות להשגה, כגון מוח6.
וקטורי AAV הנמצאים כיום בשימוש בניסויים קליניים שייכים לסרוטיפים הטבעיים עם כמה יוצאים מן הכלל1. הנדסת AAV מציעה את ההזדמנות לפתח וקטורים עם ספציפיות ויעילות מעולה של איברים או תאים. בשני העשורים האחרונים, מספר גישות יושמו בהצלחה, כגון תצוגת פפטידים, החלפת לולאה, ערבוב DNA קפסיד, PCR נוטה לשגיאות ועיצוב ממוקד, כדי ליצור גרסאות AAV בודדות או ספריות שלהם עם תכונות מגוונות7. לאחר מכן הם נתונים לסבבים מרובים של אבולוציה מכוונת כדי לבחור את הווריאנטים בתוכם עם התכונות הרצויות, כפי שנסקר במקומות אחרים 1,3. מכל אסטרטגיות האבולוציה של הקפסיד, ספריות AAV לתצוגת פפטידים, היו בשימוש הנרחב ביותר, בשל כמה תכונות ייחודיות: קל יחסית ליצור אותן, והן יכולות להשיג מגוון גבוה ורצף בתפוקה גבוהה, המאפשר לעקוב אחר האבולוציה שלהן.
ספריות ה-AAV הראשונות להחדרת פפטיד בהצלחה תוארו לפני כמעט 20 שנה. באחד הראשונים, Perabo et al.8 בנו ספרייה של קפסידים AAV2 מותאמים, שבה מאגר של אוליגונוקלאוטידים שנוצרו באופן אקראי הוכנס לפלסמיד במיקום המתאים לחומצת אמינו 587 של חלבון הקפסיד VP1, בציר המשולש הבולט מהקפסיד. באמצעות זיהום משותף של אדנו-וירוס, ספריית AAV התפתחה באמצעות סבבי בחירה מרובים, והווריאנטים הסופיים הממוקדים מחדש הוכחו כמסוגלים להמיר קווי תאים עמידים ל-AAV28 ההורי. זמן קצר לאחר מכן, Müller et al.9 הציגו את המערכת הדו-שלבית לייצור ספריות, שיפור משמעותי לפרוטוקול. בתחילה, ספריית הפלסמיד, יחד עם פלסמיד עוזר אדנו-ויראלי, משמשים לייצור ספריית AAV המכילה קפסידים כימריים. ספריית מעבורת AAV זו משמשת להדבקת תאים בריבוי נמוך של זיהום (MOI), במטרה להציג גנום נגיפי אחד לכל תא. זיהום משותף עם אדנווירוס מבטיח את הייצור של AAVs עם גנום תואם קפסיד9. כעשור לאחר מכן, דלקארה10 השתמש באבולוציה מכוונת in vivo כדי ליצור את גרסת 7m8. גרסה זו כוללת החדרת 10 חומצות אמינו (LALGETTRPA), שלוש מהן פועלות כמקשרות, ומכוונות ביעילות לרשתית החיצונית לאחר הזרקה תוך ויטריאלית10. קפסיד מהונדס זה הוא סיפור הצלחה יוצא דופן, שכן הוא אחד הקפסידים המהונדסים הבודדים שהגיעו למרפאה עד כה11.
התחום חווה דחיפה שנייה עם כניסתן של טכניקות ריצוף מהדור הבא (NGS). שני פרסומים של Adachi et al.12 בשנת 2014 ומ- Marsic et al.13 בשנת 2015, הראו את כוחה של NGS לעקוב אחר התפלגות ספריות קפסיד AAV ברקודיות בדיוק גבוה. כמה שנים לאחר מכן, ה-NGS של אזורים מקודדים הותאם לאזור החדרת הפפטיד כדי לעקוב אחר התפתחות הקפסיד. Körbelin et al.14 ביצעו סריקה מונחית NGS כדי לזהות קפסיד מבוסס AAV2 ממוקד ריאות. ניתוח NGS סייע לחשב שלושה ציוני דירוג: ציון ההעשרה בין סבבי הבחירה, ציון הספציפיות הכללי לקביעת ספציפיות הרקמות, ולבסוף הציון המשולב14. מעבדת Gradinaru15 פרסמה באותה שנה את מערכת האבולוציה הממוקדת AAV (CREATE) מבוססת Cre-recombination, המאפשרת בחירה ספציפית לסוג התא. במערכת זו, ספריית הקפסיד נושאת מתג Cre-inversible, מכיוון שהאות polyA מוקף בשני אתרי loxP. ספריית AAV מוזרקת לאחר מכן בעכברי Cre, שם אות ה- polyA הפוך רק בתאי Cre+, ומספק את התבנית לקשירה של פריימר PCR הפוך עם הפריימר הקדמי בתוך גן הקפסיד. הצלת PCR ספציפית מאוד זו אפשרה את זיהוי ה- AAV-PHP. גרסת B שיכולה לחצות את מחסום הדם-מוח15. מערכת זו התפתחה בהמשך ל-M-CREATE (Multiplexed-CREATE), שבה שולבו NGS וייצור ספריות סינתטיות בצנרת16.
גרסה משופרת מבוססת RNA של מערכת זו ממעבדת מגווייר17, iTransduce, מאפשרת סלקציה ברמת הדנ"א של קפסידים המתמרים תאים באופן פונקציונלי ומבטאים את הגנום שלהם. הגנום הנגיפי של ספריית התצוגה הפפטידית מורכב מגן Cre תחת שליטתו של מקדם הנמצא בכל מקום וגן קפסיד תחת שליטתו של מקדם p41. הספרייה מוזרקת לעכברים שיש להם קלטת loxP-STOP-loxP במעלה הזרם של tdTomato. תאים שהותמרו עם גרסאות AAV המבטאות את הגנום הנגיפי ולכן Cre מבטאים tdTomato, ובשילוב עם סמני תאים, ניתן למיין ולבחור17. באופן דומה, Nonnenmacher et al.18 ו- Tabebordbar et al.19 הציבו את ספריית הגנים של הקפסיד תחת שליטתם של מקדמים ספציפיים לרקמות. לאחר הזרקה במודלים שונים של בעלי חיים, נעשה שימוש ב-RNA נגיפי כדי לבודד את גרסאות הקפסיד.
גישה חלופית היא להשתמש בברקוד כדי לתייג ספריות capsid. מעבדת Björklund20 השתמשה בגישה זו לספריות קפסיד החדרת פפטידי ברקוד ופיתחה את האבולוציה הווקטורית AAV רציונלית ברקודית (BRAVE). בפלסמיד אחד, קלטת Rep2Cap משובטת לצד טרנסגן מבטא טרמינלי הפוך (ITR), חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) המבטא ברקוד. באמצעות שימוש באתרי loxP בין סוף המכסה לתחילת הברקוד, רקומבינציה של In vitro Cre יוצרת מקטע קטן מספיק עבור NGS, ובכך מאפשרת שיוך של החדרת פפטיד עם הברקוד הייחודי (טבלת חיפוש, LUT). ייצור AAV מתבצע באמצעות ספריית פלסמיד והברקודים המבוטאים ב-mRNA מוקרנים לאחר יישום in vivo , שוב עם NGS20. כאשר ספריות הקפסיד מורכבות מווריאנטים של גן הקפסיד כולו (כלומר, ספריות ערבוב), יש להשתמש בריצוף קריאה ארוכה. מספר קבוצות השתמשו בברקודים כדי לתייג ספריות מגוונות אלה, מה שמאפשר NGS עם עומק קריאה גבוה יותר. מעבדת קיי21 תייגה ספריות ערבוב קפסיד מגוונות ביותר עם ברקודים במורד הזרם של אות cap polyA. בשלב ראשון נוצרה ספריית פלסמיד מקודדת, וספריית הגנים של הקפסיד המעורבב שוכפלה לתוכה. לאחר מכן נעשה שימוש בשילוב של MiSeq (קריאה קצרה, עומק קריאה גבוה יותר) ו- PacBio (קריאה ארוכה, עומק קריאה נמוך יותר) NGS כמו גם ריצוף Sanger כדי ליצור את LUT21 שלהם. ב-2019, אוגדן ועמיתיו ממעבדת צ'רץ'22 תיארו את כשירות הקפסיד AAV2 עבור פונקציות מרובות באמצעות ספריות שהיו להן מוטציות, הוספות ומחיקות נקודתיות בודדות בכל מיקום, מה שאיפשר בסופו של דבר תכנון מונחה מכונה. עבור יצירת הספרייה, מקטעים קטנים יותר של גן הקפסיד סונתזו, תויגו בברקוד, רוצפו מהדור הבא, ולאחר מכן שובטו לגן הקפסיד המלא. נתוני NGS שימשו ליצירת LUT. לאחר מכן הוקרנה הספרייה באמצעות ברקודים בלבד ורצף קריאה קצר, אשר בתורו מאפשר עומק קריאה גבוה יותר22.
ספריות ברקודיות שימשו בעיקר לסינון מאגר של וריאנטים ידועים, טבעיים ומהונדסים לאחר מספר סבבי בחירה של ספריות קפסיד או ללא תלות במחקר אבולוציה של קפסיד. היתרון של ספריות כאלה הוא ההזדמנות לסנן קפסידים מרובים, תוך צמצום מספר בעלי החיים ומזעור השונות בין בעלי חיים. המחקרים הראשונים שהכניסו טכנולוגיה זו לתחום ה-AAV פורסמו לפני כמעט עשור. מעבדת נקאי 12 תייגה 191 מוטנטים כפולים באלנין המכסים חומצות אמינו 356 עד 736 על VP1 מ-AAV9 עם זוג ברקודים של12 נוקלאוטידים. באמצעות NGS, הספרייה הוקרנה in vivo עבור כריכת גלקטוז ותכונות אחרות12. מרסיק ועמיתיו תיארו את ההתפלגות הביולוגית של גרסאות AAV באמצעות ניתוח דו-קני שנה לאחר מכן13. מחקר עדכני יותר שנערך בקרב פרימטים לא אנושיים השווה את ההתפלגות הביולוגית במערכת העצבים המרכזית של 29 קפסידים באמצעות נתיבי מסירה שונים23. המעבדה שלנו פרסמה לאחרונה מסכי ספריית AAV מקודדים של 183 גרסאות שכללו AAV טבעיים ומהונדסים . מסכים אלה ברמת הדנ"א והרנ"א הובילו לזיהוי של וריאנט AAV מיוטרופימאוד 24 בעכברים, כמו גם אחרים המציגים ספציפיות גבוהה מסוג תא במוח העכבר25.
כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה המשמשת בעבודה זו ומרחיבים אותה כדי לכלול סינון של ספריות תצוגה פפטידים AAV. זה כולל את הדור של ספריות תצוגה פפטידי AAV2, שיטת PCR טיפתית דיגיטלית (dd-PCR) לכימות ולבסוף צינור NGS לניתוח גרסאות AAV, המבוסס בחלקו על עבודתם של Weinmann ועמיתיו24. לבסוף, תיאור של הדור של ספריות AAV ברקוד ואת צינור NGS המשמש באותו פרסום מסופק.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

וקטורי העברת גנים הנגזרים מווירוס הקשור לאדנו (AAV) הם אחד הכלים המבטיחים ביותר לטיפול במחלות גנטיות, עדות לכך היא עידוד נתונים קליניים ואישור של מספר טיפולים גנטיים AAV. שתי סיבות עיקריות להצלחה של וקטורי AAV הן: (i) בידוד מוקדם של סרוטיפים נגיפיים טבעיים שונים בעלי תכונות ייחודיות, ו-(ii) הקמתן של טכנולוגיות רבות עוצמה להנדסה המולקולרית שלהם וייעוד מחדש בתפוקה גבוהה. חיזוק נוסף לפוטנציאל של טכניקות אלה מיושמות לאחרונה אסטרטגיות לברקוד קפסידים AAV נבחרים ברמת ה- DNA וה- RNA, המאפשרים ריבוד מקיף ומקביל שלהם in vivo בכל האיברים העיקריים וסוגי התאים בחיה אחת. כאן, אנו מציגים צינור בסיסי המקיף קבוצה זו של דרכים משלימות, תוך שימוש בתצוגת פפטיד AAV כדי לייצג את הארסנל המגוון של טכנולוגיות הנדסת קפסיד זמינות. בהתאם לכך, אנו מתארים תחילה את השלבים המרכזיים ליצירת ספריית תצוגה פפטידית AAV לבחירת in vivo של מועמדים בעלי תכונות רצויות, ולאחר מכן הדגמה כיצד לברקוד את גרסאות הקפסיד המעניינות ביותר לסינון משני in vivo. לאחר מכן, אנו מדגימים את המתודולוגיה ליצירת ספריות לריצוף הדור הבא (NGS), כולל הגברת ברקוד וקשירת מתאמים, לפני שנסיים בסקירה כללית של השלבים הקריטיים ביותר במהלך ניתוח נתוני NGS. מכיוון שהפרוטוקולים המדווחים כאן הם רב-תכליתיים וניתנים להתאמה, חוקרים יכולים לרתום אותם בקלות להעשרת גרסאות הקפסיד AAV האופטימליות במודל המחלה המועדף עליהם וליישומי ריפוי גנטי.

יצירת ספריית תצוגה של פפטיד AAV2. כצעד ראשון לקראת הבחירה של AAV מהונדס, הדור של ספריית פלסמיד מתואר. תוספת הפפטיד מיוצרת באמצעות פריימרים מנוונים. להפחתת השילוב של קודונים באלה בין 64 ל -20 יש את היתרונות של חיסול קודוני עצירה והקלה על ניתוח NGS, על ידי הפחתת מגוון הספרייה על הדנ"א אך לא ע...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

יצירת ספריית תצוגה פפטידית AAV ותיקוף לאחר מכן באמצעות ברקוד של מועמדים עם תכונות חדשות ליצירת AAV מהדור הבא.

בידוד וקטורי ריפוי גנטי מהדור הבא באמצעות הנדסה, ברקוד וסינון של גרסאות קפסיד הקשורות לנגיף אדנו (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

פרוטוקול זה סוגר פער משמעותי בין האבולוציה הטבעית של נגיפים לבין השימוש בהם כווקטורים רקומביננטיים לטיפול גנטי אנושי בכך שהוא מאפשר את הנדסאתם, גיוון וריבודם. טכניקה זו מאפשרת סינון מקבילי בתפוקה גבוהה עבור וירוסים חדשניים, מבודדים או מהונדסים הקשורים לאדנו, בקיצור AAV, וריאנטים, ובכך חוסכת במספר בעלי חיים, עבודה, עלות וזמן. גרסאות הקפסיד AVV שזוהו יכולות להגביר את היעילות והספציפיות של העברה מבוססת AAV של טרנסגנים טיפוליים, ובכך להפחית את המינון הנגיפי הנדרש.זה יכול לשפר את הבטיחות ואת הישימות של ריפוי גנטי. אותה גישה יכולה לשמש גם להנדסה קפסידית או מקדמת של כלי העברת גנים אחרים, מה שמשפר את הבנתנו את הביולוגיה שלהם ואת השימוש בהם בריפוי גנטי. מי שיסייעו להדגים את ההליך יהיו הדוקטורנטים ג'ונאס בקר וג'ישין ליו, הפוסט-דוקטורנטיות ג'ואנה שומסקה ומרגריטה זיאס, כמו גם עוזרות המחקר אמה גרסטמן ואלן וידטקה מהמעבדה שלי.התחל בניתוח נתוני ריצוף NGS עם Python 3 ו- Biopython. ניתוח NGS מורכב משני שלבים. בשלב הראשון, חפש בקובצי הרצפים רצפים העונים על קריטריונים ספציפיים, כגון איגוף רצפים, אורך ומיקום באמצעות סקריפט אחד, וקובץ תצורה המספק את המידע הדרוש.עבור השלב השני, תרגם את הרצפים שחולצו החל מרצף AGWGGC באמצעות סקריפט מספר שתיים והתצורה ו- zuordnung. קובצי TXT המספקים את המידע הדרוש. הכן שתי תיקיות:סקריפט ונתונים.העתק את הקבצים הדחוסים של Gzip הנובעים מהרצף לתיקיית הנתונים. לאחר מכן העתק את Python ואת קבצי התצורה לתיקיית הסקריפט כמתואר בכתב היד של הטקסט. לפני הפעלת הסקריפטים, פתח את zuordnung.קובץ TXT והוספת שתי עמודות המופרדות באמצעות טאבים. הזן את שמות קובצי Gzip בעמודה הראשונה ואת השם הסופי הרצוי בעמודה השנייה. שנה את המשתנים בקובץ התצורה כמתואר בכתב היד של הטקסט.באמצעות הפקודה הספציפית, התחל את זיהוי רצף הווריאנטים וחילוץ. הפלט יהיה קבצי TXT עם רצפי הדנ"א שחולצו ומספר הקריאות שלהם. כותרת הקובץ מכילה נתונים סטטיסטיים ונתונים אלה יועברו לקבצים הבאים.נתוני TXT אלה יהיו קובץ הקלט עבור סקריפט מספר שתיים שבו רצפי הדנ"א מתורגמים, מדורגים ומנותחים. באמצעות הפקודה הספציפית, התחל תרגום PV וניתוח של קבצי פלט הטקסט של סקריפט אחד כמתואר בכתב היד של הטקסט. קבצי הפלט של סקריפט מספר שתיים ייקראו באמצעות העמודה השנייה של טבלת בדיקת המידע ב- zuordnung.TXT עם הרחבות המבוססות על סוג הניתוח. ודא ששלושת קובצי הפלט כוללים נתונים סטטיסטיים בשורות הראשונות ועמודה ראשונה עם האינדקס של כל רצף DNA מקובצי הטקסט שהוקלטו. שאר העמודות צריכות לכלול את רצף הדנ"א, מספר הקריאות, קריאה קדימה או אחורה ורצף פפטידי מתורגם.הרצפים הלא חוקיים צריכים לכלול NA ולא חוקיים בשתי העמודות האחרונות. הצג באופן חזותי את קבצי הפלט באמצעות תוכנה זמינה המבוססת על צרכי המשתמש. כדי לבצע את ניתוח נתוני רצף ה- NGS באמצעות קוד מותאם אישית בפייתון 3, זרימת העבודה כוללת זיהוי רצפי ברקוד מונחה על ידי רצפי איגוף, אורכם ומיקומם, כמו גם ניתוח העשרת ברקוד ופיזור על פני קבוצת הרקמות.הכן שתי תיקיות:סקריפט ונתונים. העתק את הקבצים הדחוסים של Gzip הנובעים מהרצף לתיקיית הנתונים. לאחר מכן העתק את קבצי הפיתון והתצורה לתיקיית הסקריפט כמתואר בכתב היד של הטקסט.לפני הפעלת הסקריפט, צור שני קובצי טקסט מופרדים בטאבים:capsidvariance. קובץ txt עם רצפי הברקוד שהוקצו לשמות וריאנטים של AAV capsid, והזיהום. קובץ TXT עם רצפי ברקוד שמקורם בזיהום אפשרי.לבסוף, ערוך את קובץ התצורה כך שיכלול את פרטי הנתיב לתיקייה עם נתוני רצף, רצף אזורי איגוף של הברקודים, מיקומם וגודל החלון לזיהוי ברקוד. הפעל את סקריפט זיהוי הברקוד עם הנתיבים וקבצי התצורה שסופקו באמצעות הפקודה המתאימה. הפלט של ביצוע פקודה זו יהיה קבצי TXT עם ספירות חוזרות לכל וריאנט capsid ואת המספר הכולל של קריאות ששוחזרו מהנתונים הגולמיים.כדי להעריך את ההתפלגות של קפסיד AAV ברקודי בין רקמות או איברים, ב zuordnung. קובץ TXT, הקצה את השם של כל קובץ טקסט המתקבל מהפעלת זיהוי הברקוד לשם רקמה או איבר. הוסף את שמות קובצי הטקסט בעמודה הראשונה ואת שמות הרקמות או האיברים המתאימים במשימה המופרדת באמצעות טאבים.צור איבר. קובץ TXT עם רשימת השמות עבור איברים מופעלים ומחוצה לו, המתאימים לשמות שניתנו בהקצאה Zuordnung. קובץ txt.לאחר מכן צרו normalization_organ. TXT ו- normalization_variant. קובצי טקסט מופרדים באמצעות כרטיסיות TXT עם ערכים מנורמלים עבור כל גרסאות Capsid וכל האיברים והרקמות.בעמודה הראשונה עם normalization_organ. קובץ txt, כתוב את השמות שניתנו עבור כל איבר, ואת העמודה השנייה עם ערכי נורמליזציה עבור הרקמה המתאימה. מלא את העמודה הראשונה של normalization_variant.קובץ TXT עם רשימת שמות Capsid, והעמודה השניה עם הערכים המנורמלים של ספירות הקריאה עבור כל Capsid בספריה המאוגמת. ערוך את קובץ התצורה על-ידי ציון הנתיבים המלאים לכל הקבצים הנוספים והפעל את סקריפט ניתוח הברקוד באמצעות פקודה ספציפית זו. סקריפט ניתוח הברקוד מפיק מספר קבצים, כגון קובצי טקסט עם ריכוז יחסי או ערכי RC של התפלגות קפסיד ברקמות שונות, בהתבסס על שלבי נורמליזציה מרובים שתוארו קודם לכן, וקובץ הגיליון האלקטרוני המשלב נתוני קובץ טקסט לנתוני מטריצה ממוזגים.הצג את הנתונים באופן חזותי ובצע ניתוח אשכולות של נתוני המטריצה כמתואר בכתב היד של הטקסט. התסריט יזין את הריכוז היחסי. XLS קבצים וליצור שתי חלקות של מפת חום אשכול היררכית וניתוח רכיבים עיקריים.כדי לשנות תרשימים או פרמטרים של PNG, פתח את הסקריפט R ופעל לפי ההוראות בסעיף ההערות. האזורים המכומתים של הגן AAV2 rep הראו כי 99.2% היו חיוביים עבור ITR, דבר המצביע על כך שהקפסידים של AAV הכילו את כל הגנום הנגיפי. בכל שלוש הקבוצות, הקריאות שחולצו בהתבסס על רצפי חתימות ספציפיים לספרייה ייצגו כ-94% מכלל הקריאות, מה שמצביע על איכות טובה.מתוכם, יותר מ-99% היו קריאות PV תקפות ויותר מ-99% מהקריאות הפוטו-וולטאיות התקפות היו ייחודיות, מה שמרמז על כך שהספרייה הייתה מאוזנת עם מגוון פנימי גבוה. שני הענפים העיקריים בהיררכיית מפת החום שיקפו את ההבדל ביעילות ההולכה של גרסאות קפסיד. הענף השמאלי עם רוב גרסאות הקפסיד כלל את כל הקפסידים שהראו ערך ריכוז יחסי גבוה ברוב הרקמות.מלבד סגוליות גבוהה להפליא של הכבד, שלושה קפסידים אחרים הפגינו ספציפיות בסרעפת, בשרירי השלד, בשרירי הזרוע ובמוח. הענף הימני של האשכולות ההיררכיים כלל את גרסאות הקפסיד עם יעילות התמרה נמוכה יותר, הניכרת ביותר בתריסריון ובלבלב. ניתוח המרכיבים העיקרי עבור תת-הקבוצה המקורית יוצר את אשכול גרסאות הקפסיד עם ספציפיות גבוהה של הכבד ומתאר את טרופיזם השרירים המצטיין של VAR60.בעת ניסיון פרוטוקול זה, עליך לשים לב לשגיאות הקלדה. התחביר שונה גם אם אתה משתמש בשורת הפקודה של Windows בהשוואה ל- Linux. לאחר זיהוי וריאנטים חדשים של AAV, יש לאמת את הפוטנציאל הטיפולי והתרגומי במודל של בעלי חיים שנפטרו או גדולים יותר.טכניקה זו מאפשרת השוואה ישירה זה לצד זה של גרסאות AAV בתנאים זהים והיא ורסטילית ביותר, וסוללת את הדרך לתרגומה בבעלי חיים גדולים, או אפילו בבני אדם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

תרפיה מערכת Mirror רובוטית עבור התאוששות תפקודית של Arms ומחוסר

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

חיזוי השתקת ג &#39;ין באמצעות שליטה Spatiotemporal של siRNA שחרור מ תגובה תגובה פולימרית פולימרית

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

לימוד טיפול משופר Cavitation

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...