Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. apprezza molto il sostegno della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) attraverso i centri di ricerca collaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) e TRR179 (Projektnummer 272983813), nonché del Centro tedesco per la ricerca sulle infezioni (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

1. Preparazione della libreria di visualizzazione del peptide casuale 7-mer AAV2
NOTA: Per la preparazione di una libreria di visualizzazione di peptidi casuali AAV2, sintetizzare gli oligonucleotidi degenerati come DNA a singolo filamento, convertirlo in DNA a doppio filamento, digerire, ligate al plasmide accettore ed elettromerato.
<ol><li>Progettazione di oligonucleotidi degenerati<ol><li>Ordinare gli oligonucleotidi degeneri ed evitare la distorsione del codone. Nell'ol...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy.">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues,+as+pipeline+matures.">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+at+the+crossroads.">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).</li><li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification,+Rational+Design+and+Machine+Learning.">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756 (2022).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy.">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li><li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing.">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075 (2014).</li><li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing.">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 2, 15041 (2015).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries.">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types.">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li><li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression.">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li><li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning.">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species.">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li><li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism.">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li><li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors.">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li><li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design.">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li><li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system.">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li><li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants.">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).</li><li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone.">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li><li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening.">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li><li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling.">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).</li><li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li><li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens.">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries.">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li><li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo.">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li><li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses.">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy.">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li><li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing.">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).</li><li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNABarcodes:+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags.">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq.">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).</li><li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors.">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li><li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+design:+A+Goldilocks+challenge.">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li><li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing.">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).</li></ol>

In questo protocollo, vengono delineati i passaggi necessari per l'ingegneria del capside AAV di visualizzazione del peptide e per lo screening della libreria AAV con codice a barre, nonché per l'analisi bioinformatica della composizione della libreria e delle prestazioni del capside. Questo protocollo si concentra sui passaggi che facilitano l'analisi bioinformatica di questi tipi di librerie, perché la maggior parte dei laboratori di virologia sono in ritardo nelle capacità di programmazione per abbinare la loro com...

La terapia di trasferimento genico è l'introduzione di materiale genetico nelle cellule per riparare, sostituire o alterare il materiale genetico cellulare per prevenire, trattare, curare o migliorare la malattia. Il trasferimento genico, sia in vivo che ex vivo, si basa su diversi sistemi di veicola, non virali e virali. I virus si sono evoluti naturalmente per trasdurre in modo efficiente le loro cellule bersaglio e possono essere utilizzati come vettori di consegna. Tra i diversi tipi di vettori virali impiegati nella terapia genica, i virus adeno-associati sono stati sempre più utilizzati, a causa della loro mancanza di patogenicità, sicurezza, bassa immunogenicità e, soprattutto, la loro capacità di sostenere l'espressione a lungo termine e non integrante 1,2,3. La terapia genica AAV ha prodotto risultati considerevoli negli ultimi dieci anni; tre terapie sono state approvate dall'Agenzia europea per i medicinali e dalla Food and Drug Administration statunitense per l'uso nell'uomo 3,4. Diversi studi clinici sono anche in corso per trattare una varietà di malattie, come l'emofilia, le malattie muscolari, cardiache e neurologiche, come esaminato altrove3. Nonostante decenni di progressi, il campo della terapia genica ha subito una serie di battute d'arresto negli ultimi anni4, soprattutto decessi negli studi clinici5 che sono stati sospesi a causa di tossicità dose-limitanti, in particolare per i tessuti che sono massicci, come i muscoli, o difficili da raggiungere, come il cervello6.
I vettori AAV attualmente utilizzati negli studi clinici appartengono ai sierotipi naturali con poche eccezioni1. L'ingegneria AAV offre l'opportunità di sviluppare vettori con specificità ed efficienza superiori per organi o cellule. Negli ultimi due decenni, diversi approcci sono stati applicati con successo, come la visualizzazione del peptide, il loop-swap, il rimescolamento del DNA del capside, la PCR soggetta a errori e la progettazione mirata, per generare singole varianti AAV o librerie di esse con proprietà diverse7. Questi sono poi sottoposti a più cicli di evoluzione diretta per selezionare le varianti al loro interno con le proprietà desiderate, come esaminato altrove 1,3. Di tutte le strategie di evoluzione del capside, le librerie AAV di visualizzazione dei peptidi sono state le più utilizzate, a causa di alcune proprietà uniche: sono relativamente facili da generare e possono raggiungere un'elevata diversità e un sequenziamento ad alto rendimento, che consente di seguire la loro evoluzione.
Le prime librerie AAV di successo per l'inserimento di peptidi sono state descritte quasi 20 anni fa. In uno dei primi, Perabo et al.8 hanno costruito una libreria di capsidi AAV2 modificati, in cui un pool di oligonucleotidi generati casualmente è stato inserito in un plasmide in una posizione corrispondente all'amminoacido 587 della proteina del capside VP1, nel triplice asse che sporge dal capside. Utilizzando la co-infezione da adenovirus, la libreria AAV è stata evoluta attraverso più cicli di selezione e le varianti finali re-mirate hanno dimostrato di essere in grado di trasdurre linee cellulari refrattarie all'AAV2 8 parentale. Poco dopo, Müller et al.9 introdussero il sistema in due fasi per la produzione di biblioteche, un miglioramento significativo del protocollo. Inizialmente, la libreria plasmidica, insieme a un plasmide aiutante adenovirale, viene utilizzata per produrre una libreria AAV che contiene capsidi chimerici. Questa libreria navetta AAV viene utilizzata per infettare le cellule a bassa molteplicità di infezione (MOI), con l'obiettivo di introdurre un genoma virale per cellula. La co-infezione con adenovirus garantisce la produzione di AAV con un genoma e un capside 9corrispondenti. Circa un decennio dopo, Dalkara10 ha utilizzato l'evoluzione diretta in vivo per creare la variante 7m8. Questa variante ha un'inserzione di 10 aminoacidi (LALGETTRPA), tre dei quali agiscono come linker, e colpisce efficacemente la retina esterna dopo l'iniezione intravitreale10. Questo capside ingegnerizzato è una storia di successo eccezionale, in quanto è uno dei pochi capsidi ingegnerizzati ad arrivare alla clinica finora11.
Il campo ha registrato un secondo impulso con l'introduzione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Due pubblicazioni di Adachi et al.12 nel 2014 e di Marsic et al.13 nel 2015, hanno mostrato la potenza di NGS per tracciare la distribuzione di librerie di capsidi AAV con codice a barre con elevata precisione. Alcuni anni dopo, l'NGS delle regioni con codice a barre è stato adattato alla regione di inserzione del peptide per seguire l'evoluzione del capside. Körbelin et al.14 hanno eseguito uno screening guidato da NGS per identificare un capside basato su AAV2 mirato ai polmoni. L'analisi NGS ha aiutato a calcolare tre punteggi di valutazione: il punteggio di arricchimento tra i turni di selezione, il punteggio di specificità generale per determinare la specificità del tessuto e infine il punteggio combinato14. Il laboratorio Gradinaru15 ha pubblicato nello stesso anno il sistema di evoluzione mirata AAV basato sulla ricombinazione Cre, che facilita una selezione specifica del tipo di cellula. In questo sistema, la libreria capside trasporta uno switch Cre-invertibile, poiché il segnale polyA è affiancato da due siti loxP. La libreria AAV viene quindi iniettata nei topi Cre, dove il segnale polyA viene invertito solo nelle cellule Cre+, fornendo il modello per il legame di un primer PCR inverso con il primer forward all'interno del gene del capside. Questo salvataggio PCR altamente specifico ha permesso l'identificazione dell'AAV-PHP. Variante B che può attraversare la barriera emato-encefalica15. Questo sistema è stato ulteriormente evoluto in M-CREATE (Multiplexed-CREATE), in cui NGS e generazione di librerie sintetiche sono stati integrati nella pipeline16.
Una versione migliorata basata sull'RNA di questo sistema dal laboratorio Maguire17, iTransduce, consente la selezione a livello del DNA dei capsidi che trasducono funzionalmente le cellule ed esprimono i loro genomi. Il genoma virale della libreria di visualizzazione del peptide comprende un gene Cre sotto il controllo di un promotore ubiquitario e il gene del capside sotto il controllo del promotore p41. La libreria viene iniettata in topi che hanno una cassetta loxP-STOP-loxP a monte di tdTomato. Le cellule trasdotte con varianti AAV che esprimono il genoma virale e quindi Cre esprimono tdTomato e, in combinazione con marcatori cellulari, possono essere selezionatee selezionate 17. Allo stesso modo, Nonnenmacher et al.18 e Tabebordbar et al.19 hanno posto la libreria genica del capside sotto il controllo di promotori tessuto-specifici. Dopo l'iniezione in diversi modelli animali, l'RNA virale è stato utilizzato per isolare le varianti del capside.
Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare il codice a barre per contrassegnare le librerie di capside. Il laboratorio Björklund20 ha utilizzato questo approccio alle librerie di capsidi di inserzione di peptidi con codice a barre e ha sviluppato l'evoluzione razionale del vettore AAV con codice a barre (BRAVE). In un plasmide, la cassetta Rep2Cap viene clonata accanto a un transgene con codice a barre che esprime una proteina fluorescente gialla (YFP) con ripetizioni terminali invertite (ITR). Utilizzando siti loxP tra la fine del tappo e l'inizio del codice a barre, una ricombinazione Cre in vitro genera un frammento abbastanza piccolo per NGS, consentendo così l'associazione dell'inserimento del peptide con il codice a barre univoco (look-up table, LUT). La produzione di AAV viene eseguita utilizzando la libreria plasmidica e i codici a barre espressi nell'mRNA vengono sottoposti a screening dopo l'applicazione in vivo , sempre con NGS20. Quando le librerie del capside comprendono varianti dell'intero gene del capside (cioè librerie mescolate), è necessario utilizzare il sequenziamento a lunga lettura. Diversi gruppi hanno utilizzato codici a barre per etichettare queste diverse librerie, il che consente a NGS una maggiore profondità di lettura. Il laboratorio Kay21 ha etichettato librerie mescolate di capside molto diverse con codici a barre a valle del segnale polyA del cappuccio . In una prima fase, è stata generata una libreria di plasmidi con codice a barre e la libreria del gene del capside mescolato è stata clonata in essa. Quindi è stata utilizzata una combinazione di MiSeq (lettura breve, profondità di lettura più elevata) e PacBio (lettura lunga, profondità di lettura inferiore) NGS e sequenziamento Sanger per generare la loro LUT21. Nel 2019, Ogden e colleghi del laboratorio Church22 hanno delineato l'idoneità del capside AAV2 per più funzioni utilizzando librerie che avevano mutazioni a singolo punto, inserzioni e delezioni in ogni posizione, che alla fine hanno permesso la progettazione guidata dalla macchina. Per la generazione della libreria, frammenti più piccoli del gene del capside sono stati sintetizzati, etichettati con un codice a barre, sequenziati di nuova generazione e quindi clonati nel gene del capside completo. I dati NGS sono stati utilizzati per generare una LUT. La libreria è stata quindi vagliata utilizzando solo i codici a barre e il sequenziamento a lettura breve, che a sua volta consente una profondità di lettura più elevata22.
Le librerie con codice a barre sono state utilizzate prevalentemente per vagliare un pool di varianti note, naturali e ingegnerizzate a seguito di diversi cicli di selezione delle librerie di capsidi o indipendentemente da uno studio sull'evoluzione del capside. Il vantaggio di tali librerie è l'opportunità di esaminare più capsidi, riducendo al contempo il numero di animali e minimizzando le variazioni tra gli animali. I primi studi che hanno introdotto questa tecnologia nel campo AAV sono stati pubblicati quasi un decennio fa. Il laboratorio Nakai 12 ha etichettato 191 mutanti doppi dell'alanina che coprono gli amminoacidi da 356 a 736 sul VP1 da AAV9 con una coppia di codici a barre a12 nucleotidi. Utilizzando NGS, la libreria è stata esaminata in vivo per il legame con il galattosio e altre proprietà12. Marsic e colleghi hanno delineato la biodistribuzione delle varianti AAV utilizzando anche un'analisi a doppia barra 1 anno dopo13. Uno studio più recente su primati non umani ha confrontato la biodistribuzione nel sistema nervoso centrale di 29 capsidi utilizzando diverse vie di consegna23. Il nostro laboratorio ha recentemente pubblicato schermi di librerie AAV con codice a barre di 183 varianti che includevano AAV naturali e ingegnerizzati. Questi screening a livello di DNA e RNA hanno portato all'identificazione di una variante AAV altamente miotropica24 nei topi e in altri che mostrano un'elevata specificità di tipo cellulare nel cervello del topo25.
Qui, descriviamo la metodologia utilizzata in questo lavoro e la espandiamo per includere lo screening delle librerie di visualizzazione dei peptidi AAV. Ciò comprende la generazione di librerie di visualizzazione dei peptidi AAV2, un metodo di PCR digitale a goccia (dd-PCR) per la quantificazione e, infine, una pipeline NGS per analizzare le varianti AAV, basata in parte sul lavoro di Weinmann e colleghi24. Infine, viene fornita una descrizione della generazione di librerie AAV con codice a barre e della pipeline NGS utilizzata nella stessa pubblicazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

I vettori di rilascio genico derivati dal virus adeno-associato (AAV) sono uno degli strumenti più promettenti per il trattamento delle malattie genetiche, evidenziato da dati clinici incoraggianti e dall'approvazione di diverse terapie geniche AAV. Due ragioni principali per il successo dei vettori AAV sono (i) il precedente isolamento di vari sierotipi virali naturali con proprietà distinte e (ii) la successiva creazione di potenti tecnologie per la loro ingegneria molecolare e il loro riutilizzo ad alto rendimento. A rafforzare ulteriormente il potenziale di queste tecniche sono state recentemente implementate strategie per la codifica a barre di capsidi AAV selezionati a livello di DNA e RNA, consentendo la loro stratificazione completa e parallela in vivo in tutti i principali organi e tipi di cellule in un singolo animale. Qui, presentiamo una pipeline di base che comprende questo insieme di strade complementari, utilizzando la visualizzazione del peptide AAV per rappresentare il variegato arsenale di tecnologie di ingegneria del capside disponibili. Di conseguenza, descriviamo prima i passaggi cruciali per la generazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV per la selezione in vivo di candidati con proprietà desiderate, seguita da una dimostrazione di come codificare a barre le varianti di capside più interessanti per lo screening secondario in vivo. Successivamente, esemplificamo la metodologia per la creazione di librerie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS), tra cui l'amplificazione dei codici a barre e la legatura degli adattatori, prima di concludere con una panoramica dei passaggi più critici durante l'analisi dei dati NGS. Poiché i protocolli qui riportati sono versatili e adattabili, i ricercatori possono facilmente sfruttarli per arricchire le varianti ottimali di capside AAV nel loro modello di malattia preferito e per applicazioni di terapia genica.

Generazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV2. Come primo passo verso la selezione di AAV ingegnerizzati, viene descritta la generazione di una libreria di plasmidi. L'inserto peptidico viene prodotto utilizzando primer degenerati. Ridurre la combinazione di codoni in quelli da 64 a 20 ha il vantaggio di eliminare i codoni di stop e facilitare l'analisi NGS, riducendo la diversità della libreria sul DNA ma non il livello proteico. L'inserto oligonucleotidico viene acquistato come DNA ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Generazione della libreria di visualizzazione dei peptidi AAV e successiva validazione attraverso il codice a barre di candidati con nuove proprietà per la creazione di AAV di nuova generazione.

Isolamento dei vettori di terapia genica di prossima generazione attraverso l'ingegneria, il codice a barre e lo screening delle varianti del capside del virus adeno-associato (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Questo protocollo colma un divario significativo tra l'evoluzione naturale dei virus e il loro uso come vettori ricombinanti per la terapia genica umana, consentendo la loro ingegnerizzazione, diversificazione e stratificazione. Questa tecnica consente lo screening parallelo ad alto rendimento per virus adeno-associati nuovi, isolati o ingegnerizzati, in breve varianti AAV, risparmiando così sul numero di animali, sul lavoro, sui costi e sul tempo. Le varianti di capside AVV identificate possono aumentare l'efficacia e la specificità della somministrazione basata su AAV di transgeni terapeutici, riducendo così la dose virale richiesta.Ciò potrebbe migliorare la sicurezza e l'applicabilità della terapia genica. Lo stesso approccio potrebbe essere utilizzato anche per l'ingegneria del capside o del promotore di altri veicoli di consegna genica che migliora la nostra comprensione della loro biologia e del loro uso nella terapia genica. Ad aiutare a dimostrare la procedura saranno gli studenti di dottorato Jonas Becker e Jixin Liu, il post-doc Joanna Szumska e Margarita Zayas, così come gli assistenti di ricerca Emma Gerstmann ed Ellen Widtke del mio laboratorio.Inizia analizzando i dati di sequenziamento NGS con Python 3 e Biopython. L'analisi NGS è composta da due fasi. Per il primo passaggio, cercare nei file di sequenza le sequenze che soddisfano criteri specifici quali sequenze laterali, lunghezza e posizione utilizzando lo script uno e un file di configurazione che fornisce le informazioni necessarie.Per la seconda fase, tradurre le sequenze estratte a partire dalla sequenza AGWGGC utilizzando lo script numero due e la configurazione e zuordnung. txt che fornisce le informazioni necessarie. Preparare due cartelle:script e dati.Copiare i file compressi Gzip risultanti dalla sequenza nella cartella dati. Quindi copiare Python e i file di configurazione nella cartella dello script come descritto nel manoscritto di testo. Prima di eseguire gli script, aprire la zuordnung.txt e aggiungere due colonne separate da tabulazioni. Immettere i nomi dei file Gzip nella prima colonna e il nome finale desiderato nella seconda colonna. Modificare le variabili nel file di configurazione come descritto nel testo manuscritto.Utilizzando il comando specifico, avviare il rilevamento e l'estrazione della sequenza di varianti. L'output saranno file TXT con le sequenze di DNA estratte e il loro numero di letture. L'intestazione di questo file contiene dati statistici e questi dati verranno trasferiti ai seguenti file.Questi dati TXT saranno il file di input per lo script numero due in cui le sequenze di DNA vengono tradotte, classificate e analizzate. Utilizzando il comando specifico, avviare la traduzione PV e l'analisi dei file di output del testo dello script uno come descritto nel manoscritto di testo. I file di output dello script numero due verranno denominati utilizzando la seconda colonna della tabella di ricerca in zuordnung.txt con estensioni in base al tipo di analisi. Assicurarsi che i tre file di output contengano dati statistici nelle prime righe e una prima colonna con l'indice di ciascuna sequenza di DNA dai file di testo di input. Le colonne rimanenti dovrebbero essere costituite dalla sequenza del DNA, dal numero di letture, dalla lettura diretta o inversa e dalla sequenza peptidica tradotta.Le sequenze non valide devono avere NA e non sono valide nelle ultime due colonne. Visualizza i file di output utilizzando il software disponibile in base alle esigenze dell'utente. Per eseguire l'analisi dei dati di sequenziamento NGS utilizzando codice personalizzato in Python 3, il flusso di lavoro comprende il rilevamento di sequenze di codici a barre guidate da sequenze di fiancheggiamento, la loro lunghezza e posizione, nonché l'analisi dell'arricchimento e della distribuzione del codice a barre sul set di tessuti.Preparare due cartelle:script e dati. Copiare i file compressi Gzip risultanti dalla sequenza nella cartella dati. Quindi copiare python e i file di configurazione nella cartella dello script come descritto nel manoscritto di testo.Prima di eseguire lo script, creare due file di testo delimitati da tabulazioni:la variazione capsid. txt con le sequenze di codici a barre assegnate ai nomi delle varianti del capside AAV e la contaminazione. TXT con sequenze di codici a barre che provengono da possibili contaminazioni.Infine, modificare il file di configurazione per includere le informazioni del percorso della cartella con i dati di sequenziamento, la sequenza delle regioni laterali dei codici a barre, la loro posizione e le dimensioni della finestra per il rilevamento dei codici a barre. Eseguire lo script di rilevamento dei codici a barre con i percorsi e i file di configurazione forniti utilizzando il rispettivo comando. L'output dell'esecuzione di questo comando sarà costituito da file TXT con riconteggi per variante di capside e il numero totale di letture recuperate dai dati grezzi.Valutare la distribuzione del capside AAV con codice a barre tra tessuti o organi, nella zuordnung. txt, assegna il nome di ciascun file di testo ottenuto dall'esecuzione di rilevamento del codice a barre al nome di un tessuto o di un organo. Aggiungi i nomi dei file di testo nella prima colonna e i nomi dei tessuti o degli organi corrispondenti nell'assegnazione delimitata da tabulazioni.Creare un organo. txt con l'elenco dei nomi per gli organi on e off-target, che corrispondono ai nomi indicati nell'assegnazione Zuordnung. Txt.Quindi creare normalization_organ. txt e normalization_variant. File di testo delimitati da tabulazioni TXT con valori normalizzati per tutte le varianti di capside e tutti gli organi e tessuti.Nella prima colonna con il normalization_organ. txt, scrivere i nomi dati per ciascun organo e la seconda colonna con i valori di normalizzazione per il tessuto corrispondente. Riempire la prima colonna del normalization_variant.TXT con l'elenco dei nomi delle capside e la seconda colonna con i valori normalizzati dei conteggi di lettura per ogni capside nella libreria in pool. Modificare il file di configurazione specificando i percorsi completi di tutti i file aggiuntivi ed eseguire lo script di analisi del codice a barre utilizzando questo comando specifico. Lo script di analisi dei codici a barre produce diversi file come i file di testo con valori di concentrazione relativa o RC della distribuzione del capside all'interno di diversi tessuti in base a più passaggi di normalizzazione descritti in precedenza e il file di foglio di calcolo che combina i dati del file di testo in dati di matrice uniti.Visualizzare i dati ed eseguire l'analisi cluster dei dati della matrice come descritto nel manoscritto di testo. Lo script inserirà la concentrazione relativa. XLS e generare due grafici di mappa di calore cluster gerarchica e analisi dei componenti principali.Per modificare i grafici o i parametri PNG, aprite lo script R e seguite le istruzioni nella sezione commenti. Le regioni quantificate del gene AAV2 rep hanno mostrato che il 99,2% era positivo per ITR, suggerendo che i capsidi AAV contenevano l'intero genoma virale. In tutti e tre i set, le letture estratte basate su sequenze di firma specifiche per la libreria rappresentavano circa il 94% delle letture totali, indicando una buona qualità.Di questi, oltre il 99% erano letture PV valide e oltre il 99% delle letture PV valide erano uniche, suggerendo che la libreria era bilanciata con un'elevata diversità interna. I due rami principali della gerarchia delle mappe di calore riflettevano la differenza nell'efficienza di trasduzione delle varianti del capside. Il ramo sinistro con la maggior parte delle varianti del capside includeva tutti i capsidi che mostravano un alto valore di concentrazione relativa nella maggior parte dei tessuti.Oltre alla specificità epatica sorprendentemente elevata, altri tre capsidi hanno mostrato specificità nel diaframma, nel muscolo scheletrico, nel bicipite e nel cervello. Il ramo destro del raggruppamento gerarchico comprendeva le varianti del capside con un'efficienza di trasduzione complessivamente inferiore più evidente nel duodeno e nel pancreas. L'analisi delle componenti principali per il sottogruppo originale forma il cluster di varianti del capside con elevata specificità epatica e delinea l'eccezionale trofismo muscolare del capside VAR60.Quando si tenta questo protocollo, è necessario prestare attenzione agli errori di digitazione. Anche la sintassi è diversa se si utilizza il prompt dei comandi di Windows rispetto a Linux. A seguito dell'identificazione di nuove varianti di AAV, il potenziale terapeutico e traslazionale deve essere verificato in un modello animale deceduto o più grande.Questa tecnica consente un confronto diretto fianco a fianco delle varianti di AAV in condizioni identiche ed è estremamente versatile, aprendo la strada alla sua traduzione in animali di grandi dimensioni o persino nell'uomo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Sistema di terapia robotica Specchio per il recupero funzionale di emiplegici Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

L&#39;isolamento di Murine adiposo derivate dal tessuto microvascolare Frammenti come vascolarizzazione Unità per Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Predizione del silenziamento del gene attraverso il controllo spatiotemporale della siRNA rilasciata da nanocarrier polimerici sensibili alla foto

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Studiare la terapia potenziata della cavitazione

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Interfacce idrogel fotodegradabili per lo screening, la selezione e l'isolamento dei batteri

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...