Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G.は、DFG共同研究センターSFB1129(Projektnummer 240245660)およびTRR179(Projektnummer 272983813)を通じたドイツ研究財団(DFG)、ならびにドイツ感染研究センター(DZIF、BMBF;TTU-HIV 04.819)。

1. AAV2ランダム7量体ペプチドディスプレイライブラリーの調製
注:AAV2ランダムペプチドディスプレイライブラリの調製では、縮重オリゴヌクレオチドを一本鎖DNAとして合成し、それを二本鎖DNAに変換し、消化し、アクセプタープラスミドにライゲートし、エレクトロポレートします。
<ol><li>縮重オリゴヌクレオチドの設計<ol><li>縮重オリゴヌクレオチドを注?...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. 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このプロトコルでは、ペプチドディスプレイAAVキャプシドエンジニアリングとバーコードAAVライブラリスクリーニング、およびライブラリ組成とキャプシド性能のバイオインフォマティクス分析に必要な手順が概説されています。このプロトコルは、ほとんどのウイルス学研究所が分子生物学技術の習熟度に匹敵するプログラミングスキルに遅れをとっているため、これらのタイプのライブ?...

遺伝子導入療法は、細胞に遺伝物質を導入して、細胞の遺伝物質を修復、置換、または変更して、病気を予防、治療、治癒、または改善することです。遺伝子導入は、インビボとエクスビボの両方で、非ウイルス性とウイルス性の異なる送達システムに依存しています。ウイルスは、標的細胞を効率的に形質導入するために自然に進化しており、送達ベクターとして使用できます。遺伝子治療に使用されるさまざまな種類のウイルスベクターの中で、アデノ随伴ウイルスは、病原性の欠如、安全性、免疫原性の低下、そして最も重要なことに、長期の非組み込み型発現を維持する能力のためにますます使用されています1,2,3。AAV遺伝子治療は、過去10年間でかなりの成果を上げてきました。3つの治療法が、欧州医薬品庁と米国食品医薬品局によってヒトでの使用が承認されています3,4。他の場所でレビューされているように、血友病、筋肉、心臓、神経疾患などのさまざまな疾患を治療するためのいくつかの臨床試験も進行中です3。何十年にもわたる進歩にもかかわらず、遺伝子治療の分野は近年一連の挫折を経験しており4、最も重要なのは、特に筋肉などの巨大な組織、または脳などの到達が困難な組織の場合、用量制限毒性のために保留された臨床試験5での死亡6です。
現在臨床試験で使用されているAAVベクターは、いくつかの例外を除いて天然血清型に属しています1。AAVエンジニアリングは、優れた臓器または細胞特異性と効率を備えたベクターを開発する機会を提供します。過去20年間で、ペプチドディスプレイ、ループスワップ、カプシドDNAシャッフリング、エラー発生型PCR、ターゲットデザインなど、いくつかのアプローチが成功裏に適用され、多様な特性を持つ個々のAAVバリアントまたはそのライブラリが生成されました7。次に、これらは、他の場所でレビューされているように、目的の特性を持つバリアントを選択するために、指向性進化の複数のラウンドにかけられます1,3。すべてのカプシド進化戦略の中で、ペプチドディスプレイAAVライブラリは、比較的簡単に生成でき、高い多様性とハイスループットシーケンシングを達成できるため、進化を追跡できるといういくつかのユニークな特性により、最も広く使用されています。
最初に成功したペプチド挿入AAVライブラリは、ほぼ20年前に記述されました。最初の1つでは、Peraboら8 は、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドのプールが、カプシドから突き出た3倍軸のVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸587に対応する位置のプラスミドに挿入された修飾AAV2キャプシドのライブラリを構築しました。アデノウイルスの共感染を用いて、AAVライブラリーを複数回の選択を通じて進化させ、最終的な再標的変異体は、親のAAV28に難治性の細胞株を形質導入できることが示された。その後まもなく、Müllerら9 はライブラリ作成のための2段階システムを導入し、プロトコルを大幅に改善しました。最初に、プラスミドライブラリは、アデノウイルスヘルパープラスミドとともに、キメラカプシドを含むAAVライブラリを生成するために使用されます。このAAVシャトルライブラリは、細胞ごとに1つのウイルスゲノムを導入することを目的として、感染多重度(MOI)の低い細胞に感染するために使用されます。アデノウイルスとの同時感染により、ゲノムとキャプシド9が一致するAAVの産生が保証されます。約10年後、ダルカラ10 は in vivo 指向進化を使用して7m8バリアントを作成しました。この変異体は、10アミノ酸挿入(LALGETTRPA)を有し、そのうち3つはリンカーとして作用し、硝子体内注射後の外網膜を効率的に標的とする10。このエンジニアリングキャプシドは、これまでにクリニックにたどり着いた数少ないエンジニアリングキャプシドの1つであるため、並外れたサクセスストーリーです11。
この分野は、次世代シーケンシング(NGS)技術の導入により、2番目の後押しを経験しました。2014年のAdachi et al.12と2015年のMarsic et al.13の2つの出版物は、バーコード化されたAAVキャプシドライブラリの分布を高精度で追跡するNGSの力を紹介しました。数年後、バーコード領域のNGSは、カプシドの進化に従うようにペプチド挿入領域に適応されました。Körbelinら14は、肺を標的とするAAV2ベースのキャプシドを同定するためにNGSガイド下スクリーニングを実施した。NGS分析は、選択ラウンド間の濃縮スコア、組織特異性を決定するための一般的な特異性スコア、そして最後に合計スコア14の3つの評価スコアを計算するのに役立ちました。Gradinaruラボ15は、細胞タイプ特異的な選択を容易にするCre組換えベースのAAVターゲット進化(CREATE)システムを同年に発表しました。このシステムでは、ポリA信号が2つのloxPサイトに隣接しているため、カプシドライブラリはCre反転可能スイッチを備えています。次に、AAVライブラリをCreマウスに注入し、ポリAシグナルがCre+細胞でのみ反転し、リバースPCRプライマーとキャプシド遺伝子内のフォワードプライマーを結合させるためのテンプレートを提供します。この非常に特異的なPCRレスキューにより、AAV-PHPの同定が可能になりました。血液脳関門15を通過できるB変異体。このシステムはさらにM-CREATE(Multiplexed-CREATE)に進化し、NGSと合成ライブラリ生成がパイプライン16に統合されました。
マグワイアラボ17のこのシステムの改良されたRNAベースのバージョンであるiTransduceは、細胞を機能的に形質導入し、そのゲノムを発現するカプシドのDNAレベルでの選択を可能にします。ペプチドディスプレイライブラリーのウイルスゲノムは、ユビキタスプロモーターの制御下にあるCre遺伝子と、p41プロモーターの制御下にあるカプシド遺伝子とを含む。このライブラリーは、tdTomatoの上流にloxP-STOP-loxPカセットを有するマウスに注入される。ウイルスゲノムを発現し、したがってCreがtdTomatoを発現するAAV変異体で形質導入された細胞は、細胞マーカーと組み合わせて、選別および選択することができる17。同様に、Nonnenmacher et al.18およびTabebordbarら19は、カプシド遺伝子ライブラリーを組織特異的プロモーターの制御下に置いた。異なる動物モデルに注射した後、ウイルスRNAを使用してカプシド変異体を単離した。
別の方法は、バーコードを使用してcapsidライブラリにタグを付けることです。ビョルクルンドラボ20 は、このアプローチを使用してペプチド挿入キャプシドライブラリをバーコード化し、バーコード化された合理的なAAVベクトル進化(BRAVE)を開発しました。1つのプラスミドでは、Rep2Capカセットを、倒立末端リピート(ITR)に隣接する黄色蛍光タンパク質(YFP)発現、バーコードタグ付き導入遺伝子の隣にクローニングします。 キャップ の端とバーコードの先頭の間のloxPサイトを使用して、 in vitro Cre組換えにより、NGSに十分小さいフラグメントが生成され、それによってペプチド挿入と固有のバーコード(ルックアップテーブル、LUT)との関連付けが可能になります。AAV産生はプラスミドライブラリを用いて行われ、mRNAで発現されたバーコードは、 in vivo 適用後に再びNGS20でスクリーニングされる。カプシドライブラリがキャプシド遺伝子全体のバリアント(すなわち、シャッフルされたライブラリ)を含む場合、ロングリードシーケンシングを使用する必要があります。いくつかのグループは、バーコードを使用してこれらの多様なライブラリにタグを付け、より高い読み取り深度でNGSを可能にしています。Kay lab21 は、 キャップ ポリA信号の下流にバーコードを使用して、非常に多様なキャプシドシャッフルライブラリにタグを付けました。最初のステップでは、バーコード化されたプラスミドライブラリが生成され、シャッフルされたカプシド遺伝子ライブラリがその中にクローニングされました。次に、MiSeq(ショートリード、より高い読み取り深度)とPacBio(ロングリード、より低い読み取り深度)のNGSとサンガーシーケンシングの組み合わせを使用して、LUT21を生成しました。2019年、チャーチラボ22 のオグデンと同僚は、すべての位置に一点変異、挿入、欠失を持つライブラリを使用して、複数の機能に対するAAV2キャプシド適合性を描写し、最終的に機械誘導設計を可能にしました。ライブラリの生成のために、カプシド遺伝子のより小さな断片を合成し、バーコードでタグ付けし、次世代配列を決定し、次に完全なカプシド遺伝子にクローニングしました。NGSデータはLUTを生成するために使用されました。次に、バーコードとショートリードシーケンスのみを使用してライブラリをスクリーニングし、より高い読み取り深度22を可能にしました。
バーコードライブラリは、カプシドライブラリを数回選択した後、またはカプシド進化研究とは無関係に、既知の天然および工学的バリアントのプールをスクリーニングするために主に使用されてきました。このようなライブラリの利点は、動物の数を減らし、動物間の変動を最小限に抑えながら、複数のカプシドをスクリーニングする機会です。この技術をAAV分野に導入した最初の研究は、ほぼ10年前に発表されました。中井研究室12は、AAV9のVP1上のアミノ酸356〜736をカバーする191個の二重アラニン変異体を12 ヌクレオチドのバーコードでタグ付けした。NGSを用いて、ライブラリーを、ガラクトース結合および他の特性について インビボ でスクリーニングした12。Marsicらは、1年後の二重バーコード分析も使用して、AAV変異体の生体分布を描写した13。非ヒト霊長類を対象としたより最近の研究では、異なる送達経路を使用して29個のカプシドの中枢神経系における生体分布を比較しました23。私たちの研究室は最近、天然および人工AAVを含む183のバリアントのバーコードAAVライブラリ画面を公開しました。DNAおよびRNAレベルでのこれらのスクリーニングは、マウスにおける高筋向性AAV変異体24ならびにマウス脳において高い細胞型特異性を示す他のもの25の同定につながった。
ここでは、この研究で使用された方法論について説明し、AAVペプチドディスプレイライブラリのスクリーニングを含むように拡張します。これには、AAV2ペプチドディスプレイライブラリの生成、定量のためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)法、そして最後にAAV変異体を分析するためのNGSパイプラインが含まれ、Weinmannらの研究に一部基づいています24。最後に、バーコードAAVライブラリの生成と、同じ出版物で使用されるNGSパイプラインの説明が提供されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する遺伝子送達ベクターは、遺伝病の治療のための最も有望なツールの1つであり、有望な臨床データといくつかのAAV遺伝子治療の承認によって証明されています。AAVベクターの成功の2つの主な理由は、(i)異なる特性を持つさまざまな天然に存在するウイルス血清型の事前分離、および(ii)その後の分子工学とハイスループットでの転用のための強力な技術の確立です。これらの技術の可能性をさらに高めるために、最近、選択されたAAVカプシドをDNAおよびRNAレベルでバーコード化するための戦略が実装され、単一の動物のすべての主要な臓器および細胞タイプで包括的かつ並行したin vivo層別化が可能になります。ここでは、AAVペプチドディスプレイを使用して、利用可能なカプシドエンジニアリング技術の多様な武器を表す、この一連の補完的な手段を網羅する基本的なパイプラインを紹介します。したがって、まず、所望の特性を有する候補のin vivo選択のためのAAVペプチドディスプレイライブラリを生成するための極めて重要なステップを説明し、続いて、二次in vivoスクリーニングのために最も興味深いカプシド変異体をバーコード化する方法のデモンストレーションを行います。次に、バーコード増幅やアダプターライゲーションを含む次世代シーケンシング(NGS)用のライブラリ作成の方法論を例示し、NGSデータ解析中の最も重要なステップの概要で締めくくります。ここで報告されているプロトコルは汎用性と適応性があるため、研究者はそれらを簡単に利用して、お気に入りの疾患モデルや遺伝子治療アプリケーションに最適なAAVキャプシドバリアントを濃縮できます。

AAV2ペプチドディスプレイライブラリの作製。 改変されたAAVの選択に向けた最初のステップとして、プラスミドライブラリの生成について説明します。ペプチドインサートは、縮重プライマーを使用して製造されます。コドンの組み合わせを64から20に減らすと、タンパク質レベルではなくDNAのライブラリの多様性を減らすことで、終止コドンを排除し、NGS分析を容易にするとい?...

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Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

次世代AAVの作成のための新規特性を持つ候補のバーコード化によるAAVペプチドディスプレイライブラリの生成とその後の検証。

アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド変異体のエンジニアリング、バーコード化、スクリーニングによる次世代遺伝子治療ベクターの単離(英語)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

このプロトコルは、ウイルスの工学、多様化、層別化を可能にすることにより、ウイルスの自然進化とヒト遺伝子治療のための組換えベクターとしての使用との間の大きなギャップを埋めます。この技術により、新規、単離、または操作されたアデノ随伴ウイルス、つまりAAV変異体のハイスループット並行スクリーニングが可能になり、動物の数、作業、コスト、および時間を節約できます。同定されたAVVキャプシド変異体は、治療用導入遺伝子のAAVベースの送達の有効性および特異性を高め、それによって必要なウイルス量を減らすことができる。これにより、遺伝子治療の安全性と適用性が向上する可能性があります。同じアプローチは、他の遺伝子送達ビヒクルのカプシドまたはプロモーターエンジニアリングにも使用でき、それらの生物学と遺伝子治療におけるそれらの使用についての理解を深めることができます。手順のデモンストレーションを支援するのは、博士課程の学生であるヨナス・ベッカーとジシン・リウ、ポスドクのジョアンナ・シュムスカとマルガリータ・ザヤス、そして私の研究室の研究助手であるエマ・ゲルストマンとエレン・ウィトケです。まず、Python 3とBiopythonでNGSシーケンシングデータを分析します。NGS分析は2つのステップで構成されています。最初のステップでは、スクリプト 1 を使用して、側面シーケンス、長さ、位置などの特定の条件を満たすシーケンスと、必要な情報を提供する構成ファイルをシーケンス ファイルで検索します。2番目のステップでは、スクリプト番号2と構成およびzuordnungを使用して、AGWGGCシーケンスから始まる抽出されたシーケンスを変換します。必要な情報を提供するTXTファイル。スクリプトとデータの2つのフォルダを用意します。シーケンス処理の結果の Gzip 圧縮ファイルをデータ フォルダーにコピーします。次に、Pythonと構成ファイルを、テキスト原稿の説明に従ってスクリプトフォルダーにコピーします。スクリプトを実行する前に、zuordnung を開きます。txt ファイルを作成し、タブ区切りの 2 つの列を追加します。列 1 に Gzip ファイルの名前を入力し、列 2 に目的の最終名を入力します。構成ファイル内の変数を、テキスト 原稿の説明に従って変更します。特定のコマンドを使用して、バリアント配列の検出と抽出を開始します。出力は、抽出されたDNA配列とそのリード数を含むTXTファイルになります。このファイルのヘッダーには統計データが含まれており、これらのデータは次のファイルに転送されます。これらのTXTデータは、DNA配列が翻訳、ランク付け、および分析されるスクリプト番号2の入力ファイルになります。特定のコマンドを使用して、テキスト原稿で説明されているように、スクリプト1のテキスト出力ファイルのPV翻訳と分析を開始します。スクリプト番号 2 の出力ファイルには、zuordnung のルックアップ テーブルの 2 番目の列を使用して名前が付けられます。分析の種類に基づく拡張機能を持つ TXT。3 つの出力ファイルの最初の行と最初の列に、入力テキスト ファイルの各 DNA 配列のインデックスを含む統計データが含まれていることを確認します。残りのカラムは、DNA配列、リード数、順方向または逆方向リード、および翻訳ペプチド配列で構成されている必要があります。無効なシーケンスは NA を持つ必要があり、最後の 2 つの列では無効です。ユーザーのニーズに基づいて、利用可能なソフトウェアを使用して出力ファイルを視覚化します。Python 3のカスタムコードを使用してNGSシーケンシングデータの分析を実行するためのワークフローは、隣接シーケンス、その長さと位置によって導かれるバーコードシーケンスの検出、および一連の組織に対するバーコードの濃縮と分布の分析で構成されます。スクリプトとデータの2つのフォルダを用意します。シーケンス処理の結果の Gzip 圧縮ファイルをデータ フォルダーにコピーします。次に、テキスト原稿の説明に従って、Pythonファイルと構成ファイルをスクリプトフォルダーにコピーします。スクリプトを実行する前に、2 つのタブ区切りテキスト ファイル、つまり capsidvariance を作成します。AAVキャプシドバリアント名に割り当てられたバーコードシーケンスと汚染を含むtxtファイル。汚染の可能性のあるバーコードシーケンスを含むTXTファイル。最後に、構成ファイルを編集して、シーケンス データを含むフォルダーへのパス、バーコードの隣接領域のシーケンス、それらの位置、およびバーコード検出用のウィンドウ サイズの情報を含めます。それぞれのコマンドを使用して、指定されたパスと構成ファイルを使用してバーコード検出スクリプトを実行します。このコマンド実行の出力は、capsidバリアントごとの再カウントと生データから回復された読み取りの総数を含むTXTファイルになります。ズオルドヌングにおける組織または臓器間のバーコードAAVキャプシドの分布を評価する。TXTファイルは、バーコード検出実行から得られた各テキストファイルの名前を組織または臓器名に割り当てる。最初の列にテキストファイルの名前を追加し、タブ区切りの割り当てに対応する組織または臓器の名前を追加します。臓器を作成します。オンターゲット臓器とオフターゲット臓器の名前のリストを含むTXTファイルで、Zuordnungの割り当てで指定された名前に対応します。TXT ファイルにエクスポートします。次に、normalization_organを作成します。TXTとnormalization_variant。TXTタブは、すべてのCAPSIDバリアントとすべての臓器および組織の正規化された値を持つ区切りテキストファイルです。normalization_organの最初の列。TXTファイルに、各臓器に与えられた名前と、対応する組織の正規化値を含む2番目の列を書き込みます。normalization_variantの最初の列に入力します。Txt ファイルには Capsid 名のリストが含まれ、2 番目の列にはプールされたライブラリ内の各 Capsid の読み取りカウントの正規化された値が含まれます。すべての追加ファイルへのフルパスを指定して構成ファイルを編集し、この特定のコマンドを使用してバーコード分析スクリプトを実行します。バーコード解析スクリプトは、前述の複数の正規化ステップに基づいて、異なる組織内のカプシド分布の相対濃度またはRC値を含むテキストファイルや、テキストファイルのデータをマージされたマトリックスデータに結合するスプレッドシートファイルなど、いくつかのファイルを出力します。データを視覚化し、テキスト原稿に記載されているようにマトリックスデータのクラスター分析を実行します。スクリプトは相対濃度を入力します。XLSファイルを作成し、階層クラスターヒートマップと主成分分析の2つのプロットを生成します。プロットまたはPNGパラメータを変更するには、Rスクリプトを開き、コメントセクションの指示に従います。AAV2 rep遺伝子の定量化された領域は、99.2%がITRに対して陽性であることを示し、AAVキャプシドがウイルスゲノム全体を含むことを示唆しています。3つのセットすべてにおいて、ライブラリに固有の署名配列に基づいて抽出されたリードは、全リードの約94%を占め、良好な品質を示しています。これらのうち、99%以上が有効なPVリードであり、有効なPVリードの99%以上が一意であり、ライブラリが高い内部多様性とバランスが取れていることが示唆されました。ヒートマップ階層の2つの主要な分岐は、カプシド変異体の変換効率の違いを反映していました。カプシド変異体の大部分を有する左枝には、ほとんどの組織にわたって高い相対濃度値を示したすべてのカプシドが含まれていた。著しく高い肝臓特異性とは別に、他の3つのカプシドは、横隔膜、骨格筋、上腕二頭筋、および脳において特異性を示した。階層的クラスタリングの右枝には、十二指腸と膵臓で最も明白な全体的な低い形質導入効率を持つカプシド変異体が含まれていました。元のサブセットの主成分分析は、肝臓特異性の高いカプシド変異体のクラスターを形成し、VAR60キャプシドの優れた筋向性を概説します。このプロトコルを試みるときは、入力エラーに注意を払う必要があります。Windows コマンド プロンプトを使用している場合と Linux を使用している場合も、構文が異なります。新規AAV変異体の同定に続いて、治療および翻訳の可能性を死亡または大型の動物モデルで検証する必要があります。この技術は、同一の条件下でAAVバリアントを直接並べて比較することを可能にし、非常に用途が広く、大型動物、さらにはヒトでの翻訳への道を開きます。

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Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

光応答性高分子ナノキャリアからのsiRNA放出の時空間制御による遺伝子サイレンシングの予測

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

キャビテーション強化療法の研究

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

細菌スクリーニング、選択、および分離のための光分解性ヒドロゲルインターフェース

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...