Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. setter stor pris på støtte fra den tyske forskningsstiftelsen (DFG) gjennom DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) og TRR179 (Projektnummer 272983813), samt av det tyske senteret for infeksjonsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

1. AAV2 tilfeldig 7-mer peptid display bibliotek forberedelse
MERK: For utarbeidelse av et AAV2 tilfeldig peptiddisplaybibliotek, syntetiser de degenererte oligonukleotidene som enkeltstrenget DNA, konverter det til dobbeltstrenget DNA, fordøy, ligat til akseptorplasmidet og elektroporat.
<ol><li>Design av degenererte oligonukleotider<ol><li>Bestill de degenererte oligonukleotidene og unngå kodonskjevhet. I oligonukleotidet 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGG...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy.">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues,+as+pipeline+matures.">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+at+the+crossroads.">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).</li><li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification,+Rational+Design+and+Machine+Learning.">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756 (2022).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy.">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li><li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing.">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075 (2014).</li><li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing.">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 2, 15041 (2015).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries.">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types.">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li><li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression.">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li><li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning.">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species.">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li><li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism.">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li><li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors.">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li><li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design.">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li><li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system.">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li><li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants.">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).</li><li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone.">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li><li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening.">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li><li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling.">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).</li><li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li><li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens.">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries.">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li><li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo.">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li><li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses.">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy.">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li><li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing.">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).</li><li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNABarcodes:+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags.">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq.">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).</li><li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors.">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li><li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+design:+A+Goldilocks+challenge.">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li><li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing.">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).</li></ol>

I denne protokollen skisseres trinnene som trengs for AAV-kapsidteknikk for peptidvisning og for strekkodet AAV-bibliotekscreening, samt for bioinformatisk analyse av biblioteksammensetning og kapsidytelse. Denne protokollen fokuserer på trinnene som letter bioinformatisk analyse av disse typer biblioteker, fordi de fleste virologilaboratorier henger etter i programmeringsferdigheter for å matche deres ferdigheter i molekylærbiologiske teknikker. Begge typer biblioteker har blitt omfattende beskrevet i litteraturen, s...

Genoverføringsterapi er innføring av genetisk materiale i celler for å reparere, erstatte eller endre det cellulære genetiske materialet for å forebygge, behandle, kurere eller forbedre sykdom. Genoverføring, både in vivo og ex vivo, er avhengig av forskjellige leveringssystemer, ikke-virale og virale. Virus har utviklet seg naturlig for effektivt å transducere sine målceller og kan brukes som leveringsvektorer. Blant de forskjellige typer virale vektorer som brukes i genterapi, har adenoassosierte virus blitt brukt i økende grad på grunn av deres mangel på patogenisitet, sikkerhet, lav immunogenisitet og viktigst av alt deres evne til å opprettholde langsiktig, ikke-integrerende uttrykk 1,2,3. AAV-genterapi har gitt betydelige prestasjoner det siste tiåret; tre behandlinger er godkjent av European Medicines Agency og US Food and Drug Administration for bruk hos mennesker 3,4. Flere kliniske studier pågår også for å behandle en rekke sykdommer, som hemofili, muskel-, hjerte- og nevrologiske sykdommer, som gjennomgått andre steder3. Til tross for flere tiår med fremskritt har genterapifeltet opplevd en rekke tilbakeslag de siste årene4, viktigst dødsfall i kliniske studier5 som har blitt satt på vent på grunn av dosebegrensende toksisiteter, spesielt for vev som er massive, for eksempel muskler eller vanskelig å nå, for eksempel hjerne6.
AAV-vektorene som i dag brukes i kliniske studier, tilhører de naturlige serotypene, med noen få unntak:1. AAV-engineering tilbyr muligheten til å utvikle vektorer med overlegen organ- eller cellespesifisitet og effektivitet. I løpet av de siste to tiårene har flere tilnærminger blitt brukt med suksess, for eksempel peptidvisning, loop-swap, kapsid-DNA-stokking, feilutsatt PCR og målrettet design, for å generere individuelle AAV-varianter eller biblioteker derav med forskjellige egenskaper7. Disse blir deretter utsatt for flere runder med rettet evolusjon for å velge variantene i dem med de ønskede egenskapene, som gjennomgått andre steder 1,3. Av alle kapsidevolusjonsstrategiene har AAV-biblioteker med peptidvisning vært de mest brukte på grunn av noen unike egenskaper: de er relativt enkle å generere, og de kan oppnå høyt mangfold og høy gjennomstrømningssekvensering, noe som gjør det mulig å følge utviklingen.
De første vellykkede AAV-bibliotekene for peptidinnsetting ble beskrevet for snart 20 år siden. I en av de første konstruerte Perabo et al.8 et bibliotek av modifiserte AAV2-kapsider, hvor en pool av tilfeldig genererte oligonukleotider ble satt inn i et plasmid i en posisjon som tilsvarer aminosyre 587 av VP1-kapsidproteinet, i den trefoldige aksen som stikker ut fra kapsiden. Ved hjelp av adenovirus-koinfeksjon ble AAV-biblioteket utviklet gjennom flere seleksjonsrunder, og de endelige remålrettede variantene viste seg å være i stand til å transdusere cellelinjer som var refraktære mot foreldrenes AAV28. Kort tid etter introduserte Müller et al.9 totrinnssystemet for bibliotekproduksjon, en betydelig forbedring av protokollen. I første omgang brukes plasmidbiblioteket, sammen med et adenoviralt hjelperplasmid, til å produsere et AAV-bibliotek som inneholder kimære kapsider. Dette AAV-skyttelbiblioteket brukes til å infisere celler ved lav infeksjonsgrad (MOI), med sikte på å introdusere ett virusgenom per celle. Koinfeksjon med adenovirus sikrer produksjon av AAVer med matchende genom og kapsid9. Omtrent et tiår senere brukte Dalkara10 in vivo-rettet evolusjon for å lage 7m8-varianten. Denne varianten har en 10 aminosyreinnsetting (LALGETTRPA), hvorav tre fungerer som linkere, og effektivt retter seg mot den ytre netthinnen etter intravitreal injeksjon10. Dette konstruerte kapsidet er en eksepsjonell suksesshistorie, da det er en av de få konstruerte kapsidene som har kommet seg til klinikken så langt11.
Feltet opplevde et nytt løft med introduksjonen av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS). To publikasjoner fra Adachi et al.12 i 2014 og fra Marsic et al.13 i 2015, viste NGS' evne til å spore distribusjonen av strekkodede AAV-kapsidbiblioteker med høy nøyaktighet. Noen år senere ble NGS av strekkodede regioner tilpasset peptidinnføringsområdet for å følge kapsidutviklingen. Körbelin et al.14 utførte en NGS-veiledet screening for å identifisere et lungemålrettet AAV2-basert kapsid. NGS-analysen bidro til å beregne tre vurderingspoeng: anrikningspoengsummen mellom utvalgsrunder, den generelle spesifisitetspoengsummen for å bestemme vevsspesifisitet, og til slutt den kombinerte poengsummen14. Gradinaru lab15 publiserte Cre-recombination-based AAV targeted evolution (CREATE) system samme år, som muliggjør et celletypespesifikt utvalg. I dette systemet bærer kapsidbiblioteket en Cre-inverterbar bryter, da polyA-signalet er flankert av to loxP-steder. AAV-biblioteket injiseres deretter i Cre-mus, hvor polyA-signalet kun inverteres i Cre+-celler, og gir mal for binding av en omvendt PCR-primer med fremre primer i kapsidgenet. Denne svært spesifikke PCR-redningen gjorde det mulig å identifisere AAV-PHP. B-variant som kan krysse blod-hjernebarrieren15. Dette systemet ble videreutviklet til M-CREATE (Multiplexed-CREATE), der NGS og syntetisk bibliotekgenerering ble integrert i rørledningen16.
En forbedret RNA-basert versjon av dette systemet fra Maguire lab17, iTransduce, tillater seleksjon på DNA-nivået av kapsider som funksjonelt transducerer celler og uttrykker deres genomer. Det virale genomet til peptiddisplaybiblioteket består av et Cre-gen under kontroll av en allestedsnærværende promotor og kapsidgenet under kontroll av p41-promotoren. Biblioteket injiseres i mus som har en loxP-STOP-loxP-kassett oppstrøms tdTomato. Celler transdusert med AAV-varianter som uttrykker virusgenomet og derfor Cre uttrykker tdTomato og i kombinasjon med cellemarkører kan sorteres og selekteres17. På samme måte plasserte Nonnenmacher et al.18 og Tabebordbar et al.19 kapsidgenbiblioteket under kontroll av vevsspesifikke promotorer. Etter injeksjon i forskjellige dyremodeller ble viralt RNA brukt til å isolere kapsidvariantene.
En alternativ tilnærming er å bruke strekkoding til å merke capsid-biblioteker. Björklundlab 20 brukte denne tilnærmingen til strekkode peptid innsetting capsid biblioteker og utviklet strekkode rasjonell AAV vektor evolusjon (BRAVE). I et plasmid er Rep2Cap-kassetten klonet ved siden av et invertert terminal repeats (ITR)-flankert, gult fluorescerende protein (YFP)-uttrykkende, strekkodemerket transgen. Ved å bruke loxP-steder mellom slutten av hetten og begynnelsen av strekkoden, genererer en in vitro Cre-rekombinasjon et fragment som er lite nok for NGS, og tillater dermed assosiasjonen av peptidinnsetting med den unike strekkoden (oppslagstabell, LUT). AAV-produksjonen utføres ved hjelp av plasmidbiblioteket og strekkodene uttrykt i mRNA screenes etter in vivo-applikasjon , igjen med NGS20. Når kapsidbibliotekene består av varianter av hele kapsidgenet (dvs. blandede biblioteker), må langlessekvensering brukes. Flere grupper har brukt strekkoder for å merke disse forskjellige bibliotekene, noe som muliggjør NGS med høyere lesedybde. Kay lab21 merket svært varierte capsid blandet biblioteker med strekkoder nedstrøms for cap polyA-signalet. I et første trinn ble et strekkodet plasmidbibliotek generert, og det blandede kapsidgenbiblioteket ble klonet inn i det. Deretter ble en kombinasjon av MiSeq (kort lest, høyere lesedybde) og PacBio (lang lest, lavere lesedybde) NGS samt Sanger-sekvensering brukt til å generere LUT21. I 2019 avgrenset Ogden og kolleger fra Kirkens laboratorium22 AAV2-kapsidegnetheten for flere funksjoner ved hjelp av biblioteker som hadde enkeltpunktmutasjoner, innsettinger og slettinger i hver posisjon, noe som til slutt muliggjorde maskinstyrt design. For genereringen av biblioteket ble mindre fragmenter av kapsidgenet syntetisert, merket med en strekkode, neste generasjons sekvensert og deretter klonet inn i det fulle kapsidgenet. NGS-dataene ble brukt til å generere en LUT. Biblioteket ble deretter screenet ved hjelp av bare strekkodene og kortlesingssekvenseringen, noe som igjen gir høyere lesedybde22.
Strekkodebiblioteker har hovedsakelig blitt brukt til å skjerme et basseng av kjente, naturlige og konstruerte varianter etter flere runder med utvalg av kapsidbiblioteker eller uavhengig av en kapsidevolusjonsstudie. Fordelen med slike biblioteker er muligheten til å skjerme flere kapsider, samtidig som antall dyr reduseres og variasjonen mellom dyr minimeres. De første studiene som introduserte denne teknologien på AAV-feltet ble publisert for snart ti år siden. Nakai lab 12 merket 191 doble alanin mutanter som dekker aminosyrer 356 til 736 på VP1 fra AAV9 med et par 12-nukleotid strekkoder. Ved hjelp av NGS ble biblioteket screenet in vivo for galaktosebinding og andre egenskaper12. Marsic og kolleger avgrenset biodistribusjonen av AAV-varianter ved hjelp av en dobbelt streket analyse 1 år senere13. En nyere studie på ikke-menneskelige primater sammenlignet biodistribusjonen i sentralnervesystemet av 29 kapsider ved hjelp av forskjellige leveringsveier23. Vårt laboratorium har nylig publisert strekkodede AAV-bibliotekskjermer med 183 varianter som inkluderte naturlige og konstruerte AAV-er. Disse skjermene på DNA- og RNA-nivå førte til identifisering av en svært myotrop AAV-variant24 hos mus så vel som andre som viste en høy celletypespesifisitet i musehjernen25.
Her beskriver vi metodikken som er brukt i dette arbeidet og utvider den til også å omfatte screening av AAV-peptiddisplaybiblioteker. Dette omfatter generering av AAV2 peptiddisplaybiblioteker, en digital dråpe-PCR (dd-PCR) metode for kvantifisering, og til slutt en NGS-pipeline for å analysere AAV-variantene, delvis basert på arbeidet til Weinmann og kolleger24. Til slutt gis en beskrivelse av genereringen av strekkodede AAV-biblioteker og NGS-pipelinen som brukes i samme publikasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

Genleveringsvektorer avledet fra adenoassosiert virus (AAV) er et av de mest lovende verktøyene for behandling av genetiske sykdommer, dokumentert ved oppmuntrende kliniske data og godkjenning av flere AAV-genterapier. To hovedårsaker til suksessen til AAV-vektorer er (i) den tidligere isoleringen av forskjellige naturlig forekommende virale serotyper med distinkte egenskaper, og (ii) den påfølgende etableringen av kraftige teknologier for molekylærteknikk og gjenbruk i høy gjennomstrømning. Ytterligere å øke potensialet i disse teknikkene er nylig implementerte strategier for strekkoding av utvalgte AAV-kapsider på DNA- og RNA-nivå, noe som muliggjør deres omfattende og parallelle in vivo-stratifisering i alle større organer og celletyper i et enkelt dyr. Her presenterer vi en grunnleggende pipeline som omfatter dette settet av komplementære veier, ved hjelp av AAV-peptidskjerm for å representere det mangfoldige arsenalet av tilgjengelige capsid engineering-teknologier. Følgelig beskriver vi først de sentrale trinnene for generering av et AAV-peptiddisplaybibliotek for in vivo-utvelgelse av kandidater med ønskede egenskaper, etterfulgt av en demonstrasjon av strekkode for de mest interessante kapsidvariantene for sekundær in vivo-screening. Deretter eksemplifiserer vi metodikken for opprettelse av biblioteker for neste generasjons sekvensering (NGS), inkludert strekkodeforsterkning og adapterligering, før vi avslutter med en oversikt over de mest kritiske trinnene under NGS-dataanalyse. Siden protokollene som er rapportert her er allsidige og tilpasningsdyktige, kan forskere enkelt utnytte dem til å berike de optimale AAV-kapsidvariantene i deres favorittsykdomsmodell og for genterapiapplikasjoner.

Generering av et AAV2 peptiddisplaybibliotek. Som et første skritt mot utvelgelsen av konstruerte AAV-er, beskrives genereringen av et plasmidbibliotek. Peptidinnsatsen produseres ved å bruke degenererte primere. Å redusere kombinasjonen av kodoner i de fra 64 til 20 har fordelene ved å eliminere stoppkodoner og legge til rette for NGS-analyse, ved å redusere bibliotekets mangfold på DNA, men ikke proteinnivået. Oligonukleotidinnsatsen kjøpes som enkelttrådet DNA (figur 1</...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

AAV peptid display bibliotek generering og påfølgende validering gjennom strekkoding av kandidater med nye egenskaper for etablering av neste generasjons AAVs.

Isolering av neste generasjons genterapivektorer gjennom engineering, strekkoding og screening av adeno-associated virus (AAV) kapsidvarianter

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Denne protokollen lukker et betydelig gap mellom naturlig evolusjon av virus og deres bruk som rekombinante vektorer for human genterapi ved å muliggjøre deres engineering, diversifisering og stratifisering. Denne teknikken muliggjør parallell screening med høy gjennomstrømning for nye, isolerte eller konstruerte adenoassosierte virus, kort sagt AAV-varianter, og sparer dermed dyretall, arbeid, kostnader og tid. De identifiserte AVV-kapsidvariantene kan øke effekten og spesifisiteten av AAV-basert levering av terapeutiske transgener, og dermed redusere den nødvendige virusdosen.Dette kan forbedre sikkerheten og anvendeligheten av genterapi. Den samme tilnærmingen kan også brukes til kapsid- eller promotorkonstruksjon av andre genleveringsbiler, noe som forbedrer vår forståelse av deres biologi og deres bruk i genterapi. Bidragsytere til å demonstrere prosedyren vil være PhD-studentene Jonas Becker og Jixin Liu, postdoktor Joanna Szumska og Margarita Zayas, samt forskningsassistentene Emma Gerstmann og Ellen Widtke fra laboratoriet mitt.Begynn med å analysere NGS-sekvenseringsdataene med Python 3 og Biopython. NGS-analysen består av to trinn. I det første trinnet søker du i sekvensfilene etter sekvenser som tilfredsstiller bestemte kriterier, for eksempel flankerende sekvenser, lengde og plassering, ved hjelp av skript én og en konfigurasjonsfil som gir den nødvendige informasjonen.For det andre trinnet, oversett de ekstraherte sekvensene som starter ved AGWGGC-sekvensen ved hjelp av skript nummer to og konfigurasjonen og zuordnung. txt-filer som gir den nødvendige informasjonen. Forbered to mapper:skript og data.Kopier Gzip-komprimerte filer som følge av sekvenseringen til datamappen. Kopier deretter Python- og konfigurasjonsfilene til skriptmappen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Før du kjører skriptene, åpner du zuordnung.txt-fil og legg til to fanedelte kolonner. Skriv inn navnene på Gzip-filene i kolonne én og ønsket sluttnavn i kolonne to. Endre variablene i oppsettsfilen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Bruk den spesifikke kommandoen til å starte deteksjonen og ekstraksjonen av variantsekvenser. Utdataene vil være TXT-filer med de ekstraherte DNA-sekvensene og deres antall lesninger. Overskriften til denne filen inneholder statistiske data, og disse dataene vil bli overført til følgende filer.Disse TXT-dataene vil være inndatafilen for skript nummer to der DNA-sekvensene oversettes, rangeres og analyseres. Bruk den spesifikke kommandoen, initier PV-oversettelse og analyse av tekstutdatafilene til skript en som beskrevet i tekstmanuskriptet. Utdatafilene til skript nummer to vil bli navngitt ved hjelp av den andre kolonnen i oppslagstabellen i zuordnung.txt med utvidelser basert på typen analyse. Forsikre deg om at de tre utdatafilene inneholder statistiske data i de første radene og en første kolonne med indeksen for hver DNA-sekvens fra inndatatekstfilene. De resterende kolonnene skal bestå av DNA-sekvensen, antall avlesninger, fremover eller omvendt lest og oversatt peptidsekvens.De ugyldige sekvensene skal ha NA og ikke være gyldige i de to siste kolonnene. Visualiser utdatafilene ved hjelp av tilgjengelig programvare basert på brukerens behov. For å utføre analysen av NGS-sekvenseringsdataene ved hjelp av tilpasset kode i Python 3, består arbeidsflyten av deteksjon av strekkodesekvenser styrt av flankerende sekvenser, deres lengde og plassering, samt analyse av strekkodeberikelse og distribusjon over settet med vev.Forbered to mapper:skript og data. Kopier Gzip-komprimerte filer som følge av sekvenseringen til datamappen. Deretter kopierer du python- og konfigurasjonsfilene til skriptmappen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Før du kjører skriptet, må du opprette to tabulatordelte tekstfiler:capsidvariance. txt-fil med strekkodesekvensene tilordnet AAV capsid-variantnavn, og forurensningen. txt-fil med strekkodesekvenser som kommer fra mulig forurensning.Til slutt redigerer du konfigurasjonsfilen for å inkludere informasjonen om banen til mappen med sekvenseringsdata, sekvens av flankerende områder av strekkodene, deres posisjon og vindusstørrelse for strekkodedeteksjon. Utfør strekkodedeteksjonsskriptet med de medfølgende banene og konfigurasjonsfilene ved å bruke den respektive kommandoen. Utdataene fra denne kommandokjøringen vil være TXT-filer med omtellinger per capsid-variant og det totale antallet leser som gjenopprettes fra rådataene.Å evaluere fordelingen av strekkodet AAV-kapsid mellom vev eller organer, i zuordnung. txt-fil, tilordne navnet på hver tekstfil hentet fra strekkodedeteksjonskjøringen til et vevs- eller organnavn. Legg til navnene på tekstfiler i den første kolonnen og tilsvarende vevs- eller organnavn i den tabulatordelte oppgaven.Lag et organ. txt-fil med listen over navn for on- og off-target organer, som tilsvarer navnene gitt i oppgaven zuordnung. txt-fil.Opprett deretter normalization_organ. txt og normalization_variant. TXT-fanedelte tekstfiler med normaliserte verdier for alle kapsidvarianter og alle organer og vev.I den første kolonnen med normalization_organ. txt-fil, skriv navnene gitt for hvert organ, og den andre kolonnen med normaliseringsverdier for det tilsvarende vevet. Fyll den første kolonnen i normalization_variant.txt-fil med listen over kapsidnavn, og den andre kolonnen med de normaliserte verdiene for leseantallet for hver capsid i det samlede biblioteket. Rediger konfigurasjonsfilen ved å spesifisere de fullstendige banene til alle tilleggsfiler og utfør strekkodeanalyseskriptet ved hjelp av denne spesifikke kommandoen. Strekkodeanalyseskriptet sender ut flere filer, for eksempel tekstfilene med relativ konsentrasjon eller RC-verdier for kapsidfordeling i forskjellige vev basert på flere normaliseringstrinn beskrevet tidligere, og regnearkfilen som kombinerer tekstfildata til sammenslåtte matrisedata.Visualiser dataene og utfør klyngeanalyse av matrisedataene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Manuset vil legge inn den relative konsentrasjonen. xls-filer og generere to plott av hierarkisk klyngevarmekart og prinsipal komponentanalyse.For å endre plott eller PNG-parametere, åpne R-skriptet og følg instruksjonene i kommentarfeltet. De kvantifiserte regionene i AAV2 rep-genet viste at 99,2 % var positive for ITR, noe som tyder på at AAV-kapsidene inneholdt hele virusgenomet. I alle tre settene representerte de utpakkede lesningene basert på signatursekvenser som var spesifikke for biblioteket, omtrent 94% av de totale lesningene, noe som indikerer god kvalitet.Av disse var mer enn 99% gyldige PV-lesninger og over 99% av de gyldige PV-lesningene var unike, noe som tyder på at biblioteket var balansert med høyt internt mangfold. De to hovedgrenene i varmekarthierarkiet reflekterte forskjellen i transduksjonseffektiviteten til kapsidvarianter. Den venstre grenen med flertallet av kapsidvariantene inkluderte alle kapsidene som viste en høy relativ konsentrasjonsverdi over de fleste vev.Bortsett fra påfallende høy leverspesifisitet, viste tre andre kapsider spesifisitet i mellomgulvet, skjelettmuskulaturen, biceps og hjernen. Den høyre grenen av den hierarkiske klyngen inkluderte kapsidvariantene med generell lavere transduksjonseffektivitet tydeligst i duodenum og pancreas. Hovedkomponentanalysen for den opprinnelige delmengden danner klyngen av kapsidvarianter med høy leverspesifisitet og skisserer VAR60 kapsid fremragende muskeltropisme.Når du prøver denne protokollen, må du være oppmerksom på skrivefeil. Syntaksen er også annerledes hvis du bruker Windows-ledeteksten sammenlignet med Linux. Etter identifisering av nye AAV-varianter må terapeutisk og translasjonelt potensial verifiseres i en avdød eller større dyremodell.Denne teknikken muliggjør en direkte side-ved-side-sammenligning av AAV-varianter under identiske forhold og er ekstremt allsidig, og baner vei for oversettelse hos store dyr, eller til og med hos mennesker.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic Force Mikros Basert Biopanning for isolering av morfologi spesifikke reagenser mot TDP-43 Varianter i Amyotrofisk lateral sklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System for funksjonell bedring av hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolering av Murine fettvev-avledet mikrovaskulær Fragmenter som vaskularisering Enheter for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Forutsi gensletting gjennom spatiotemporal kontroll av siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues for injiserbare regenerativ Therapy og høy gjennomstrømming narkotikarelaterte Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Studere kavitasjon forbedret terapi

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Pålitelig prosjektering og kontroll av stabile optogenetiske genkretser i pattedyrceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Foto nedbrytbare Hydrogel-grensesnitt for bakteriescreening, utvelgelse og isolasjon

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...