Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. agradece enormemente el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través de los Centros de Investigación Colaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) y TRR179 (Projektnummer 272983813), así como del Centro Alemán para la Investigación de Infecciones (DZIF, BMBF; TTU-VIH 04.819).

1. AAV2 random 7-mer peptide display library preparation
NOTA: Para la preparación de una biblioteca de visualización de péptidos aleatorios AAV2, sintetice los oligonucleótidos degenerados como ADN monocatenario, conviértalo en ADN bicatenario, digiera, liga al plásmido aceptor y electroporate.
<ol><li>Diseño de oligonucleótidos degenerados<ol><li>Ordene los oligonucleótidos degenerados y evite el sesgo del codón. En el oligonucleótido 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC(X01...

<ol>
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En este protocolo, se describen los pasos necesarios para la ingeniería de la cápside AAV de visualización de péptidos y para la detección de bibliotecas AAV con código de barras, así como para el análisis bioinformático de la composición de la biblioteca y el rendimiento de la cápside. Este protocolo se centra en los pasos que facilitan el análisis bioinformático de este tipo de bibliotecas, porque la mayoría de los laboratorios de virología están rezagados en las habilidades de programación para que co...

La terapia de transferencia de genes es la introducción de material genético en las células para reparar, reemplazar o alterar el material genético celular para prevenir, tratar, curar o mejorar la enfermedad. La transferencia de genes, tanto in vivo como ex vivo, se basa en diferentes sistemas de administración, no virales y virales. Los virus han evolucionado naturalmente para transducir eficientemente sus células diana y pueden ser utilizados como vectores de entrega. Entre los diferentes tipos de vectores virales empleados en la terapia génica, los virus adenoasociados se han utilizado cada vez más, debido a su falta de patogenicidad, seguridad, baja inmunogenicidad y, lo que es más importante, su capacidad para mantener la expresión no integradora a largo plazo 1,2,3. La terapia génica AAV ha producido logros considerables en la última década; tres terapias han sido aprobadas por la Agencia Europea de Medicamentos y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para su uso en humanos 3,4. También se están realizando varios ensayos clínicos para tratar una variedad de enfermedades, como la hemofilia, las enfermedades musculares, cardíacas y neurológicas, como se revisó en otra parte3. A pesar de décadas de avances, el campo de la terapia génica ha experimentado una serie de reveses en los últimos años4, sobre todo muertes en ensayos clínicos5 que se han suspendido debido a las toxicidades limitantes de la dosis, particularmente para tejidos que son masivos, como los músculos, o difíciles de alcanzar, como el cerebro6.
Los vectores AAV que se utilizan actualmente en ensayos clínicos pertenecen a los serotipos naturales con algunas excepciones1. La ingeniería AAV ofrece la oportunidad de desarrollar vectores con una especificidad y eficiencia superior de órganos o células. En las últimas dos décadas, se han aplicado con éxito varios enfoques, como la visualización de péptidos, el intercambio de bucles, la mezcla de ADN de la cápside, la PCR propensa a errores y el diseño dirigido, para generar variantes individuales de AAV o bibliotecas de las mismas con diversas propiedades7. Estos se someten a múltiples rondas de evolución dirigida para seleccionar las variantes dentro de ellos con las propiedades deseadas, como se revisa en otra parte 1,3. De todas las estrategias de evolución de la cápside, las bibliotecas AAV de visualización de péptidos han sido las más utilizadas, debido a algunas propiedades únicas: son relativamente fáciles de generar y pueden lograr una alta diversidad y una secuenciación de alto rendimiento, lo que permite seguir su evolución.
Las primeras bibliotecas AAV de inserción de péptidos exitosas se describieron hace casi 20 años. En uno de los primeros, Perabo et al.8 construyeron una biblioteca de cápsides AAV2 modificadas, en la que se insertó un conjunto de oligonucleótidos generados aleatoriamente en un plásmido en una posición que corresponde al aminoácido 587 de la proteína de la cápside VP1, en el eje triple que sobresale de la cápside. Utilizando la coinfección por adenovirus, la biblioteca AAV evolucionó a través de múltiples rondas de selección, y se demostró que las variantes finales redirigidas eran capaces de transducir líneas celulares refractarias al AAV2 parental8. Poco después, Müller et al.9 introdujeron el sistema de dos pasos para la producción bibliotecaria, una mejora significativa del protocolo. Inicialmente, la biblioteca de plásmidos, junto con un plásmido auxiliar adenoviral, se utilizan para producir una biblioteca AAV que contiene cápsides quiméricas. Esta biblioteca de lanzadera AAV se utiliza para infectar células a baja multiplicidad de infección (MOI), con el objetivo de introducir un genoma viral por célula. La coinfección con adenovirus asegura la producción de AAV con un genoma y una cápside9 coincidentes. Aproximadamente una década después, Dalkara10 utilizó la evolución dirigida in vivo para crear la variante de 7m8. Esta variante tiene una inserción de 10 aminoácidos (LALGETTRPA), tres de los cuales actúan como enlazadores, y se dirige eficientemente a la retina externa después de la inyección intravítrea10. Esta cápside diseñada es una historia de éxito excepcional, ya que es una de las pocas cápsides diseñadas para llegar a la clínica hasta ahora11.
El campo experimentó un segundo impulso con la introducción de técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS). Dos publicaciones de Adachi et al.12 en 2014 y de Marsic et al.13 en 2015, mostraron el poder de NGS para rastrear la distribución de bibliotecas de cápside AAV con código de barras con alta precisión. Unos años más tarde, la NGS de las regiones con código de barras se adaptó a la región de inserción de péptidos para seguir la evolución de la cápside. Körbelin et al.14 realizaron un cribado guiado por NGS para identificar una cápside basada en AAV2 dirigida a los pulmones. El análisis NGS ayudó a calcular tres puntajes de calificación: el puntaje de enriquecimiento entre las rondas de selección, el puntaje de especificidad general para determinar la especificidad del tejido y, finalmente, el puntaje combinado14. El laboratorio Gradinaru15 publicó el sistema de evolución dirigida AAV (CREATE) basado en la recombinación de Cre en el mismo año, que facilita una selección específica del tipo de célula. En este sistema, la biblioteca de cápside lleva un interruptor invertible Cre, ya que la señal polyA está flanqueada por dos sitios loxP. Luego, la biblioteca AAV se inyecta en ratones Cre, donde la señal de poliA se invierte solo en células Cre+, proporcionando la plantilla para la unión de un cebador de PCR inversa con el cebador directo dentro del gen de la cápside. Este rescate de PCR altamente específico permitió la identificación del AAV-PHP. Variante B que puede atravesar la barrera hematoencefálica15. Este sistema evolucionó aún más en M-CREATE (Multiplexed-CREATE), en el que NGS y la generación de bibliotecas sintéticas se integraron en la tubería16.
Una versión mejorada basada en ARN de este sistema del laboratorio17 de Maguire, iTransduce, permite la selección a nivel de ADN de cápsides que transducen funcionalmente células y expresan sus genomas. El genoma viral de la biblioteca de visualización de péptidos comprende un gen Cre bajo el control de un promotor ubicuo y el gen de la cápside bajo el control del promotor p41. La biblioteca se inyecta en ratones que tienen un casete loxP-STOP-loxP aguas arriba de tdTomato. Las células transducidas con variantes AAV que expresan el genoma viral y, por lo tanto, Cre expresan tdTomato y, en combinación con marcadores celulares, pueden clasificarse y seleccionarse17. Del mismo modo, Nonnenmacher et al.18 y Tabebordbar et al.19 colocaron la biblioteca de genes de la cápside bajo el control de promotores específicos de tejido. Después de la inyección en diferentes modelos animales, se utilizó ARN viral para aislar las variantes de la cápside.
Un enfoque alternativo es usar códigos de barras para etiquetar las bibliotecas de cápside. El laboratorio20 de Björklund utilizó este enfoque para las bibliotecas de cápside de inserción de péptidos de códigos de barras y desarrolló la evolución racional del vector AAV con código de barras (BRAVE). En un plásmido, el casete Rep2Cap se clona junto a un transgén marcado con código de barras que expresa repeticiones terminales invertidas (ITR) y que expresa proteínas fluorescentes amarillas (YFP). Utilizando sitios loxP entre el final de la tapa y el comienzo del código de barras, una recombinación de Cre in vitro genera un fragmento lo suficientemente pequeño para NGS, lo que permite la asociación de la inserción del péptido con el código de barras único (tabla de búsqueda, LUT). La producción de AAV se realiza utilizando la biblioteca de plásmidos y los códigos de barras expresados en el ARNm se examinan después de la aplicación in vivo , nuevamente con NGS20. Cuando las bibliotecas de cápside comprenden variantes de todo el gen de la cápside (es decir, bibliotecas barajadas), se debe utilizar la secuenciación de lectura larga. Varios grupos han utilizado códigos de barras para etiquetar estas diversas bibliotecas, lo que permite que NGS tenga una mayor profundidad de lectura. El laboratorio Kay21 etiquetó bibliotecas barajadas de cápside muy diversas con códigos de barras aguas abajo de la señal de poliA de la tapa . En un primer paso, se generó una biblioteca de plásmidos con código de barras, y la biblioteca de genes de la cápside barajada se clonó en ella. Luego se utilizó una combinación de MiSeq (lectura corta, mayor profundidad de lectura) y PacBio (lectura larga, menor profundidad de lectura), así como la secuenciación de Sanger para generar su LUT21. En 2019, Ogden y sus colegas del laboratorio Church22 delinearon la aptitud de la cápside AAV2 para múltiples funciones utilizando bibliotecas que tenían mutaciones, inserciones y eliminaciones de un solo punto en cada posición, lo que finalmente permitió el diseño guiado por máquina. Para la generación de la biblioteca, se sintetizaron fragmentos más pequeños del gen de la cápside, se marcaron con un código de barras, se secuenciaron de próxima generación y luego se clonaron en el gen completo de la cápside. Los datos de NGS se utilizaron para generar una LUT. Luego, la biblioteca se examinó utilizando solo los códigos de barras y la secuenciación de lectura corta, lo que a su vez permite una mayor profundidad de lectura22.
Las bibliotecas con código de barras se han utilizado predominantemente para examinar un conjunto de variantes conocidas, naturales y de ingeniería después de varias rondas de selección de bibliotecas de cápside o independientes de un estudio de evolución de la cápside. La ventaja de tales bibliotecas es la oportunidad de examinar múltiples cápsides, al tiempo que reduce el número de animales y minimiza la variación entre los animales. Los primeros estudios que introdujeron esta tecnología en el campo de AAV se publicaron hace casi una década. El laboratorio Nakai 12 etiquetó 191 mutantes de alanina doble que cubrían los aminoácidos 356 a 736 en el VP1 de AAV9 con un par de códigos de barras de12 nucleótidos. Utilizando NGS, la biblioteca fue examinada in vivo para la unión a galactosa y otras propiedades12. Marsic y sus colegas delinearon la biodistribución de las variantes de AAV utilizando también un análisis de doble barra 1 año después13. Un estudio más reciente en primates no humanos comparó la biodistribución en el sistema nervioso central de 29 cápsides utilizando diferentes vías de entrega23. Nuestro laboratorio ha publicado recientemente pantallas de biblioteca AAV con código de barras de 183 variantes que incluían AAV naturales y de ingeniería. Estas pantallas a nivel de ADN y ARN condujeron a la identificación de una variante AAV24 altamente miotrópica en ratones, así como otras que muestran una alta especificidad de tipo celular en el cerebro del ratón25.
Aquí, describimos la metodología utilizada en este trabajo y la ampliamos para incluir la detección de las bibliotecas de visualización de péptidos AAV. Esto comprende la generación de bibliotecas de visualización de péptidos AAV2, un método de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación y, finalmente, una tubería NGS para analizar las variantes de AAV, basada en parte en el trabajo de Weinmann y colegas24. Finalmente, se proporciona una descripción de la generación de bibliotecas AAV con código de barras y la canalización NGS utilizada en la misma publicación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

Los vectores de entrega de genes derivados del virus adenoasociado (AAV) son una de las herramientas más prometedoras para el tratamiento de enfermedades genéticas, evidenciada por el fomento de datos clínicos y la aprobación de varias terapias génicas AAV. Dos razones principales para el éxito de los vectores AAV son (i) el aislamiento previo de varios serotipos virales naturales con propiedades distintas, y (ii) el posterior establecimiento de tecnologías poderosas para su ingeniería molecular y reutilización en alto rendimiento. Impulsando aún más el potencial de estas técnicas se han implementado recientemente estrategias para codificar cápsides AAV seleccionadas a nivel de ADN y ARN, lo que permite su estratificación in vivo completa y paralela en todos los órganos principales y tipos de células en un solo animal. Aquí, presentamos una tubería básica que abarca este conjunto de vías complementarias, utilizando la visualización de péptidos AAV para representar el diverso arsenal de tecnologías de ingeniería de cápside disponibles. En consecuencia, primero describimos los pasos fundamentales para la generación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV para la selección in vivo de candidatos con las propiedades deseadas, seguido de una demostración de cómo codificar las variantes de cápside más interesantes para el cribado secundario in vivo. A continuación, ejemplificamos la metodología para la creación de bibliotecas para la secuenciación de próxima generación (NGS), incluida la amplificación de códigos de barras y la ligadura de adaptadores, antes de concluir con una descripción general de los pasos más críticos durante el análisis de datos NGS. Como los protocolos informados aquí son versátiles y adaptables, los investigadores pueden aprovecharlos fácilmente para enriquecer las variantes óptimas de la cápside AAV en su modelo de enfermedad favorito y para aplicaciones de terapia génica.

Generación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV2. Como primer paso hacia la selección de AAV diseñados, se describe la generación de una biblioteca de plásmidos. El inserto peptídico se produce mediante el uso de cebadores degenerados. Reducir la combinación de codones en aquellos de 64 a 20 tiene las ventajas de eliminar los codones de parada y facilitar el análisis NGS, al reducir la diversidad de bibliotecas en el ADN pero no en el nivel de proteína. El inserto de oligonucle?...

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Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Generación de la biblioteca de visualización de péptidos AAV y posterior validación a través del código de barras de candidatos con propiedades novedosas para la creación de AAV de próxima generación.

Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Este protocolo cierra una brecha significativa entre la evolución natural de los virus y su uso como vectores recombinantes para la terapia génica humana al permitir su ingeniería, diversificación y estratificación. Esta técnica permite la detección paralela de alto rendimiento para variantes novedosas, aisladas o diseñadas de virus adenoasociados, en resumen AAV, ahorrando así en número de animales, trabajo, costo y tiempo. Las variantes identificadas de la cápside AVV pueden aumentar la eficacia y la especificidad de la administración de transgenes terapéuticos basados en AAV, reduciendo así la dosis viral requerida.Esto podría mejorar la seguridad y la aplicabilidad de la terapia génica. El mismo enfoque también podría usarse para la cápside o la ingeniería promotora de otros vehículos de administración de genes, lo que mejora nuestra comprensión de su biología y su uso en la terapia génica. Ayudarán a demostrar el procedimiento los estudiantes de doctorado Jonas Becker y Jixin Liu, las postdoctorales Joanna Szumska y Margarita Zayas, así como las asistentes de investigación Emma Gerstmann y Ellen Widtke de mi laboratorio.Comience analizando los datos de secuenciación NGS con Python 3 y Biopython. El análisis NGS se compone de dos pasos. Para el primer paso, busque en los archivos de secuencia secuencias que satisfagan criterios específicos, como secuencias de flanqueo, longitud y ubicación, utilizando el script uno, y un archivo de configuración que proporcione la información necesaria.Para el segundo paso, traduzca las secuencias extraídas comenzando en la secuencia AGWGGC usando el script número dos y la configuración y zuordnung. TXT que proporciona la información necesaria. Prepare dos carpetas: script y data.Copie los archivos comprimidos Gzip resultantes de la secuenciación en la carpeta de datos. A continuación, copie Python y los archivos de configuración en la carpeta de secuencias de comandos como se describe en el manuscrito de texto. Antes de ejecutar los scripts, abra el zuordnung.txt y agregue dos columnas separadas por tabulaciones. Introduzca los nombres de los archivos Gzip en la columna uno y el nombre final deseado en la columna dos. Cambie las variables en el archivo de configuración como se describe en el manuscrito de texto.Con el comando específico, inicie la detección y extracción de secuencias de variantes. La salida serán archivos TXT con las secuencias de ADN extraídas y su número de lecturas. El encabezado de este archivo contiene datos estadísticos y estos datos se transferirán a los siguientes archivos.Estos datos TXT serán el archivo de entrada para el script número dos en el que se traducen, clasifican y analizan las secuencias de ADN. Usando el comando específico, inicie la traducción PV y el análisis de los archivos de salida de texto del script uno como se describe en el manuscrito de texto. Los archivos de salida del script número dos se nombrarán utilizando la segunda columna de la tabla de búsqueda en zuordnung.TXT con extensiones basadas en el tipo de análisis. Asegúrese de que los tres archivos de salida contienen datos estadísticos en las primeras filas y una primera columna con el índice de cada secuencia de ADN de los archivos de texto de entrada. Las columnas restantes deben consistir en la secuencia de ADN, el número de lecturas, la lectura directa o inversa y la secuencia peptídica traducida.Las secuencias no válidas deben tener NA y no ser válidas en las dos últimas columnas. Visualice los archivos de salida utilizando el software disponible según las necesidades del usuario. Para realizar el análisis de los datos de secuenciación NGS utilizando código personalizado en Python 3, el flujo de trabajo comprende la detección de secuencias de códigos de barras guiadas por secuencias de flanqueo, su longitud y ubicación, así como el análisis del enriquecimiento y distribución de códigos de barras sobre el conjunto de tejidos.Prepare dos carpetas: script y data. Copie los archivos comprimidos Gzip resultantes de la secuenciación en la carpeta de datos. A continuación, copie los archivos de python y configuración en la carpeta de script como se describe en el manuscrito de texto.Antes de ejecutar el script, cree dos archivos de texto delimitados por tabulaciones:capsidvariance. txt con las secuencias de códigos de barras asignadas a los nombres de variantes de cápside AAV y la contaminación. TXT con secuencias de códigos de barras que provienen de una posible contaminación.Finalmente, edite el archivo de configuración para incluir la información de la ruta a la carpeta con datos de secuenciación, secuencia de regiones flanqueantes de los códigos de barras, su posición y tamaño de ventana para la detección de códigos de barras. Ejecute el script de detección de código de barras con las rutas proporcionadas y los archivos de configuración utilizando el comando respectivo. El resultado de la ejecución de este comando serán archivos TXT con recuentos por variante de cápside y el número total de lecturas recuperadas de los datos sin procesar.Evaluar la distribución de la cápside AAV con código de barras entre tejidos u órganos, en el zuordnung. txt, asigne el nombre de cada archivo de texto obtenido de la ejecución de detección de código de barras a un nombre de tejido u órgano. Agregue los nombres de los archivos de texto en la primera columna y los nombres de tejidos u órganos correspondientes en la asignación delimitada por tabulaciones.Crear un órgano. TXT con la lista de nombres para órganos dentro y fuera del objetivo, que corresponden a los nombres dados en la asignación Zuordnung. Txt.A continuación, cree normalization_organ. txt y normalization_variant. Archivos de texto delimitados por la pestaña TXT con valores normalizados para todas las variantes de cápside y todos los órganos y tejidos.En la primera columna con el normalization_organ. txt, escriba los nombres dados para cada órgano, y la segunda columna con valores de normalización para el tejido correspondiente. Rellene la primera columna del normalization_variant.TXT con la lista de nombres de cápside y la segunda columna con los valores normalizados de los recuentos de lectura para cada cápside de la biblioteca agrupada. Edite el archivo de configuración especificando las rutas completas a todos los archivos adicionales y ejecute el script de análisis de código de barras utilizando este comando específico. El script de análisis de código de barras genera varios archivos, como los archivos de texto con concentración relativa o valores RC de distribución de cápside dentro de diferentes tejidos basados en múltiples pasos de normalización descritos anteriormente, y el archivo de hoja de cálculo que combina datos de archivos de texto en datos de matriz combinados.Visualice los datos y realice un análisis de conglomerados de los datos de la matriz como se describe en el texto manuscrito. El script introducirá la concentración relativa. XLS y generar dos gráficos de mapa de calor de clúster jerárquico y análisis de componentes principales.Para modificar trazados o parámetros PNG, abra el script de R y siga las instrucciones de la sección de comentarios. Las regiones cuantificadas del gen AAV2 rep mostraron que el 99,2% eran positivas para ITR, lo que sugiere que las cápsides AAV contenían todos los genomas virales. En los tres conjuntos, las lecturas extraídas basadas en secuencias de firmas específicas de la biblioteca representaron aproximadamente el 94% del total de lecturas, lo que indica una buena calidad.De estos, más del 99% eran lecturas PV válidas y más del 99% de las lecturas PV válidas eran únicas, lo que sugiere que la biblioteca estaba equilibrada con una alta diversidad interna. Las dos ramas principales de la jerarquía del mapa de calor reflejaron la diferencia en la eficiencia de transducción de las variantes de cápside. La rama izquierda con la mayoría de las variantes de cápside incluía todas las cápsides que mostraron un alto valor de concentración relativa en la mayoría de los tejidos.Además de la especificidad hepática sorprendentemente alta, otras tres cápsides exhibieron especificidad en el diafragma, el músculo esquelético, los bíceps y el cerebro. La rama derecha del agrupamiento jerárquico incluyó las variantes de cápside con una eficiencia de transducción general más baja más evidente en el duodeno y el páncreas. El análisis de componentes principales para el subconjunto original forma el grupo de variantes de cápside con alta especificidad hepática y describe el tropismo muscular sobresaliente de la cápside VAR60.Al intentar este protocolo, debe prestar atención a los errores de escritura. La sintaxis también es diferente si está usando el símbolo del sistema de Windows en comparación con Linux. Tras la identificación de nuevas variantes de AAV, el potencial terapéutico y traslacional debe verificarse en un modelo animal fallecido o más grande.Esta técnica permite una comparación directa lado a lado de variantes de AAV en condiciones idénticas y es extremadamente versátil, allanando el camino para su traducción en animales grandes, o incluso en humanos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Investigación

Bioingeniería

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Sistema de terapia robótica Espejo para la recuperación funcional de armas hemipléjica

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Predicción de la silenciación génica a través del control espaciotemporal de la liberación de siRNA de Nanocarriers poliméricos fotosensibles

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Estudio de la terapia mejorada de cavitación

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Interfaces de hidrogel fotodegradables para detección, selección y aislamiento de bacterias

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...