Name: isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

D.G. uppskattar mycket stöd från den tyska forskningsstiftelsen (DFG) genom DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) och TRR179 (Projektnummer 272983813), liksom från det tyska centret för infektionsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

1. AAV2 slumpmässig 7-mer peptid display bibliotek förberedelse
OBS: För beredning av ett AAV2 slumpmässigt peptidvisningsbibliotek, syntetisera de degenererade oligonukleotiderna som enkelsträngat DNA, konvertera det till dubbelsträngat DNA, smälta, ligera till acceptorplasmiden och elektroporat.
<ol><li>Design av degenererade oligonukleotider<ol><li>Beställ de degenererade oligonukleotiderna och undvik kodonbias. I oligonukleotiden 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)<sup...

<ol>
	<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy.">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li><li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy.">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues,+as+pipeline+matures.">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+at+the+crossroads.">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).</li><li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification,+Rational+Design+and+Machine+Learning.">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756 (2022).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous.">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li><li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy.">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li><li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing.">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075 (2014).</li><li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing.">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 2, 15041 (2015).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries.">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types.">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li><li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression.">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li><li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning.">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species.">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li><li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism.">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li><li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors.">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li><li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design.">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li><li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system.">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li><li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants.">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).</li><li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone.">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li><li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening.">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li><li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling.">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).</li><li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li><li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens.">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).</li><li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries.">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li><li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo.">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li><li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses.">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy.">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li><li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing.">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).</li><li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNABarcodes:+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags.">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq.">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).</li><li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors.">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li><li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+design:+A+Goldilocks+challenge.">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li><li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing.">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).</li></ol>

I detta protokoll beskrivs de steg som behövs för peptidvisning av AAV-kapsidteknik och för streckkodad AAV-biblioteksscreening, samt för bioinformatisk analys av bibliotekssammansättning och kapsidprestanda. Detta protokoll fokuserar på de steg som underlättar bioinformatisk analys av dessa typer av bibliotek, eftersom de flesta virologilaboratorier släpar efter i programmeringsförmåga för att matcha deras kunskaper i molekylärbiologiska tekniker. Båda typerna av bibliotek har beskrivits utförligt i litter...

Genöverföringsterapi är införandet av genetiskt material i celler för att reparera, ersätta eller förändra det cellulära genetiska materialet för att förebygga, behandla, bota eller förbättra sjukdom. Genöverföring, både in vivo och ex vivo, bygger på olika leveranssystem, icke-virala och virala. Virus har utvecklats naturligt för att effektivt transducera sina målceller och kan användas som leveransvektorer. Bland de olika typerna av virala vektorer som används i genterapi har adenoassocierade virus använts alltmer på grund av deras brist på patogenicitet, säkerhet, låg immunogenicitet och viktigast av allt deras förmåga att upprätthålla långsiktigt, icke-integrerande uttryck 1,2,3. AAV-genterapi har gett betydande framsteg under det senaste decenniet; tre terapier har godkänts av Europeiska läkemedelsmyndigheten och US Food and Drug Administration för användning på människor 3,4. Flera kliniska prövningar pågår också för att behandla en mängd olika sjukdomar, såsom hemofili, muskulösa, hjärt- och neurologiska sjukdomar, som granskas någon annanstans3. Trots årtionden av framsteg har genterapiområdet upplevt en rad bakslag de senaste åren4, viktigast av allt dödsfall i kliniska prövningar5 som har lagts på is på grund av dosbegränsande toxiciteter, särskilt för vävnader som är massiva, såsom muskler, eller svåra att nå, såsom hjärna6.
AAV-vektorerna som för närvarande används i kliniska prövningar tillhör de naturliga serotyperna med några få undantag:1. AAV-teknik erbjuder möjligheten att utveckla vektorer med överlägsen organ- eller cellspecificitet och effektivitet. Under de senaste två decennierna har flera tillvägagångssätt framgångsrikt tillämpats, såsom peptiddisplay, loop-swap, kapsid-DNA-blandning, felbenägen PCR och riktad design, för att generera enskilda AAV-varianter eller bibliotek därav med olika egenskaper7. Dessa utsätts sedan för flera omgångar av riktad utveckling för att välja varianterna inom dem med önskade egenskaper, som granskas någon annanstans 1,3. Av alla kapsidutvecklingsstrategier har AAV-bibliotek för peptidvisning varit de mest använda på grund av några unika egenskaper: de är relativt lätta att generera och de kan uppnå hög mångfald och sekvensering med hög genomströmning, vilket möjliggör efterföljande utveckling.
De första framgångsrika AAV-biblioteken för peptidinsättning beskrevs för nästan 20 år sedan. I en av de första konstruerade Perabo et al.8 ett bibliotek av modifierade AAV2-kapsider, i vilka en pool av slumpmässigt genererade oligonukleotider infördes i en plasmid i en position som motsvarar aminosyra 587 av VP1-kapsidproteinet, i den trefaldiga axeln som sticker ut från kapsiden. Med hjälp av adenovirus-saminfektion utvecklades AAV-biblioteket genom flera urvalsomgångar, och de slutliga omriktade varianterna visade sig kunna transducera cellinjer som är eldfasta mot föräldra AAV28. Kort därefter introducerade Müller et al.9 tvåstegssystemet för biblioteksproduktion, en betydande förbättring av protokollet. Ursprungligen används plasmidbiblioteket, tillsammans med en adenoviral hjälparplasmid, för att producera ett AAV-bibliotek som innehåller chimära kapsider. Detta AAV-skyttelbibliotek används för att infektera celler vid låg infektionsmultiplicitet (MOI), med målet att införa ett viralt genom per cell. Saminfektion med adenovirus säkerställer produktion av AAV med ett matchande genom och kapsid9. Ungefär ett decennium senare använde Dalkara10 in vivo-riktad evolution för att skapa 7m8-varianten. Denna variant har en 10 aminosyrainsättning (LALGETTRPA), varav tre fungerar som länkar, och riktar sig effektivt mot den yttre näthinnan efter intravitreal injektion10. Denna konstruerade kapsid är en exceptionell framgångshistoria, eftersom det är en av få konstruerade kapsider som hittills har kommit till kliniken11.
Fältet upplevde ett andra uppsving med introduktionen av nästa generations sekvenseringstekniker (NGS). Två publikationer från Adachi et al.12 2014 och från Marsic et al.13 2015 visade kraften i NGS för att spåra distributionen av streckkodade AAV-kapsidbibliotek med hög noggrannhet. Några år senare anpassades NGS i streckkodade regioner till peptidinsättningsregionen för att följa kapsidutvecklingen. Körbelin et al.14 utförde en NGS-guidad screening för att identifiera en lungriktad AAV2-baserad kapsid. NGS-analysen hjälpte till att beräkna tre betygspoäng: anrikningspoängen mellan urvalsomgångar, den allmänna specificitetspoängen för att bestämma vävnadsspecificitet och slutligen den kombinerade poängen14. Gradinaru-labbet15 publicerade samma år det Cre-rekombinationsbaserade AAV-riktade evolutionssystemet (CREATE), vilket underlättar ett celltypspecifikt urval. I detta system bär kapsidbiblioteket en Cre-inverterbar switch, eftersom polyA-signalen flankeras av två loxP-platser. AAV-biblioteket injiceras sedan i Cre-möss, där polyA-signalen endast inverteras i Cre+-celler, vilket ger mallen för bindning av en omvänd PCR-primer med den framåtriktade primern i kapsidgenen. Denna mycket specifika PCR-räddning möjliggjorde identifieringen av AAV-PHP. B-variant som kan passera blod-hjärnbarriären15. Detta system utvecklades vidare till M-CREATE (Multiplexed-CREATE), där NGS och syntetisk biblioteksgenerering integrerades i pipeline16.
En förbättrad RNA-baserad version av detta system från Maguire lab17, iTransduce, möjliggör selektion på DNA-nivå av kapsider som funktionellt transducerar celler och uttrycker deras genom. Det virala genomet i peptidvisningsbiblioteket består av en Cre-gen under kontroll av en allestädes närvarande promotor och kapsidgenen under kontroll av p41-promotorn. Biblioteket injiceras i möss som har en loxP-STOP-loxP-kassett uppströms tdTomato. Celler transducerade med AAV-varianter som uttrycker virusgenomet och därför Cre uttrycker tdTomato och, i kombination med cellmarkörer, kan sorteras och väljas17. På liknande sätt placerade Nonnenmacher et al.18 och Tabebordbar et al.19 kapsidgenbiblioteket under kontroll av vävnadsspecifika promotorer. Efter injektion i olika djurmodeller användes viralt RNA för att isolera kapsidvarianterna.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda streckkodning för att tagga kapsidbibliotek. Björklunds labb20 använde detta tillvägagångssätt för att streckkodspeptidinsättningskapasidbibliotek och utvecklade streckkodsrationell AAV-vektorutveckling (BRAVE). I en plasmid klonas Rep2Cap-kassetten bredvid en inverterad terminal upprepar (ITR)-flankerad, gulfluorescerande protein (YFP)-uttryckande, streckkodsmärkt transgen. Med hjälp av loxP-platser mellan slutet av locket och början av streckkoden genererar en in vitro Cre-rekombination ett fragment som är tillräckligt litet för NGS, vilket möjliggör associering av peptidinsättning med den unika streckkoden (uppslagstabell, LUT). AAV-produktion utförs med hjälp av plasmidbiblioteket och streckkoderna uttryckta i mRNA screenas efter in vivo-applikation , återigen med NGS20. När kapsidbiblioteken består av varianter av hela kapsidgenen (dvs. blandade bibliotek) måste långläst sekvensering användas. Flera grupper har använt streckkoder för att tagga dessa olika bibliotek, vilket möjliggör NGS med högre läsdjup. Kay lab21 taggade mycket olika kapsidblandade bibliotek med streckkoder nedströms cap polyA-signalen. I ett första steg genererades ett streckkodat plasmidbibliotek och det blandade kapsidgenbiblioteket klonades in i det. Sedan användes en kombination av MiSeq (kortläsning, högre läsdjup) och PacBio (långläsning, lägre läsdjup) NGS samt Sanger-sekvensering för att generera deras LUT21. År 2019 avgränsade Ogden och kollegor från kyrkans labb22 AAV2-kapsidens lämplighet för flera funktioner med hjälp av bibliotek som hade enpunktsmutationer, infogningar och borttagningar i varje position, vilket i slutändan möjliggjorde maskinstyrd design. För genereringen av biblioteket syntetiserades mindre fragment av kapsidgenen, märktes med en streckkod, nästa generations sekvenserades och klonades sedan till hela kapsidgenen. NGS-data användes för att generera en LUT. Biblioteket screenades sedan med bara streckkoderna och kortläsningssekvenseringen, vilket i sin tur möjliggör högre läsdjup22.
Streckkodsbibliotek har främst använts för att screena en pool av kända, naturliga och konstruerade varianter efter flera omgångar av urval av kapsidbibliotek eller oberoende av en kapsidutvecklingsstudie. Fördelen med sådana bibliotek är möjligheten att screena flera kapsider, samtidigt som antalet djur minskas och variationen mellan djur minimeras. De första studierna som introducerade denna teknik till AAV-fältet publicerades för nästan ett decennium sedan. Nakai lab 12 taggade 191 dubbla alaninmutanter som täcker aminosyrorna 356 till 736 på VP1 från AAV9 med ett par 12-nukleotidstreckkoder. Med hjälp av NGS screenades biblioteket in vivo för galaktosbindning och andra egenskaper12. Marsic och kollegor avgränsade biodistributionen av AAV-varianter med hjälp av en dubbelbarcordad analys 1 år senare13. En nyare studie på icke-mänskliga primater jämförde biodistributionen i centrala nervsystemet av 29 kapsider med olika leveransvägar23. Vårt labb har nyligen publicerat streckkodade AAV-biblioteksskärmar med 183 varianter som inkluderade naturliga och konstruerade AAV. Dessa skärmar på DNA- och RNA-nivå ledde till identifieringen av en mycket myotrop AAV-variant24 hos möss såväl som andra som visar en hög celltypsspecificitet i mushjärnan25.
Här beskriver vi den metod som används i detta arbete och utökar den till att omfatta screening av AAV-peptidvisningsbibliotek. Detta omfattar generering av AAV2-peptiddisplaybibliotek, en digital dropp-PCR-metod (dd-PCR) för kvantifiering och slutligen en NGS-pipeline för att analysera AAV-varianterna, delvis baserat på Weinmanns och kollegorsarbete 24. Slutligen ges en beskrivning av genereringen av streckkodade AAV-bibliotek och NGS-rörledningen som används i samma publikation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification primer</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>DNA fragment validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td>
			<td>G2938C</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq fw:&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC-seq rv:&#160;&#160;</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td>
			<td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&#160;</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0143</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1851196</td>
			<td>dd-PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS&#160;</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>N0447S</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863024</td>
			<td>dd-PCR supermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863005</td>
			<td>dd-PCR droplet generation oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864008</td>
			<td>dd-PCR droplet generation cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridge Holder</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863051</td>
			<td>dd-PCR cartridge holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Gasket</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1863009</td>
			<td>dd-PCR cover for cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>12001925</td>
			<td>dd-PCR 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td>
			<td>60081-1</td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes, 1mm</td>
			<td>Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)</td>
			<td>748050</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH primer/probe mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Mm00186825_cn</td>
			<td>Taqman qPCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genepulser Xcell</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>4368814</td>
			<td>cDNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITR_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500 system</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>KK2600 07958919001</td>
			<td>NGS sample prepration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>V8151</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Digestion of double-stranded insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_frw</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS_rev</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td>
			<td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td>
			<td>NGS primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td>
			<td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>FC-404-2005</td>
			<td>NGS Library sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&#160;</td>
			<td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td>
			<td>9092-256</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 Plate Sealer&#160;</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814000</td>
			<td>dd-PCR plate sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1814040</td>
			<td>dd-PCR sealing foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td>
			<td>24765-1G</td>
			<td>AAV library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProNex Size-Selective Purification System</td>
			<td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td>
			<td>NG2002</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Hot Start II Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>F549L</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche AG (Basel, Switzerland)</td>
			<td>5963117103</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRep2Cap2_PIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864002</td>
			<td>dd-PCR droplet generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td>
			<td>1864003</td>
			<td>dd-PCR droplet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28306</td>
			<td>Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28704</td>
			<td>Plasmid vector purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>12162</td>
			<td>Plasmid library DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>28104</td>
			<td>Sample prepration for NGS library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>NGS Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFast PCR Master Mix</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>1044234</td>
			<td>Taqman qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>CAATCACGGCGCACATGT</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rep_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SfiI</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>R0123</td>
			<td>Digestion of vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm, steel Beads</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>69989</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIMER-oligonucleotides</td>
			<td>ELLA Biotech (Munich, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Degenerate oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>Plasmid library ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyserLT</td>
			<td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td>
			<td>85600</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_fw</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_rv</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td>
			<td>dd-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP_probe</td>
			<td>IDT (San Joce, CA, USA)</td>
			<td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td>
			<td>dd-PCR probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5 (Capped)</td>
			<td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td>
			<td>D4013</td>
			<td>Vector and Ligation purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of next-generation gene therapy vectors through engineering, barcoding, and screening of adeno-associated virus (aav) capsid variants

Genleveransvektorer härledda från adenoassocierat virus (AAV) är ett av de mest lovande verktygen för behandling av genetiska sjukdomar, vilket framgår av uppmuntrande kliniska data och godkännande av flera AAV-genterapier. Två viktiga orsaker till AAV-vektorernas framgång är (i) den tidigare isoleringen av olika naturligt förekommande virala serotyper med distinkta egenskaper, och (ii) den efterföljande etableringen av kraftfulla tekniker för deras molekylära teknik och återanvändning i hög genomströmning. Ytterligare förstärkning av potentialen hos dessa tekniker är nyligen implementerade strategier för streckkodning av utvalda AAV-kapsider på DNA- och RNA-nivå, vilket möjliggör deras omfattande och parallella in vivo-stratifiering i alla större organ och celltyper i ett enda djur. Här presenterar vi en grundläggande pipeline som omfattar denna uppsättning kompletterande vägar, med hjälp av AAV-peptiddisplay för att representera den mångsidiga arsenalen av tillgängliga kapsidtekniktekniker. Följaktligen beskriver vi först de avgörande stegen för generering av ett AAV-peptiddisplaybibliotek för in vivo-urval av kandidater med önskade egenskaper, följt av en demonstration av hur man streckkodar de mest intressanta kapsidvarianterna för sekundär in vivo-screening. Därefter exemplifierar vi metoden för skapandet av bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS), inklusive streckkodsförstärkning och adapterligering, innan vi avslutar med en översikt över de mest kritiska stegen under NGS-dataanalys. Eftersom protokollen som rapporteras här är mångsidiga och anpassningsbara kan forskare enkelt utnyttja dem för att berika de optimala AAV-kapsidvarianterna i sin favoritsjukdomsmodell och för genterapiapplikationer.

Generering av ett AAV2-peptidvisningsbibliotek. Som ett första steg mot valet av konstruerade AAV beskrivs genereringen av ett plasmidbibliotek. Peptidinsatsen produceras med hjälp av degenererade primers. Att minska kombinationen av kodon i de från 64 till 20 har fördelarna med att eliminera stoppkodon och underlätta NGS-analys genom att minska biblioteksdiversiteten på DNA men inte proteinnivån. Oligonukleotidinsatsen köps som enkelsträngat DNA (figur 1), som omv...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants at JoVE.com

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus AAV Capsid Variants

Generering av AAV-peptidvisningsbibliotek och efterföljande validering genom streckkodning av kandidater med nya egenskaper för skapandet av nästa generations AAV.

Isolering av nästa generations genterapivektorer genom teknik, streckkodning och screening av adenoassocierade virus (AAV) kapsidvarianter

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Detta protokoll stänger ett betydande gap mellan naturlig utveckling av virus och deras användning som rekombinanta vektorer för mänsklig genterapi genom att möjliggöra deras teknik, diversifiering och stratifiering. Denna teknik möjliggör parallell screening med hög genomströmning för nya, isolerade eller konstruerade adenoassocierade virus, kort sagt AAV, varianter, vilket sparar på djurantal, arbete, kostnad och tid. De identifierade AVV-kapsidvarianterna kan öka effekten och specificiteten av AAV-baserad leverans av terapeutiska transgener och därigenom minska den erforderliga virusdosen.Detta skulle kunna förbättra genterapins säkerhet och användbarhet. Samma tillvägagångssätt kan också användas för kapsid- eller promotorteknik av andra genleveransfordon som förbättrar vår förståelse för deras biologi och deras användning i genterapi. Till sin hjälp att demonstrera proceduren har doktoranderna Jonas Becker och Jixin Liu, postdoktorn Joanna Szumska och Margarita Zayas, samt forskningsassistenterna Emma Gerstmann och Ellen Widtke från mitt laboratorium.Börja med att analysera NGS-sekvenseringsdata med Python 3 och Biopython. NGS-analysen består av två steg. I det första steget söker du i sekvensfilerna efter sekvenser som uppfyller specifika kriterier, till exempel flankerande sekvenser, längd och plats med hjälp av skript ett och en konfigurationsfil som innehåller den information som behövs.För det andra steget, översätt de extraherade sekvenserna med början vid AGWGGC-sekvensen med skript nummer två och konfigurationen och zuordnung. txt-filer som ger den information som behövs. Förbered två mappar:skript och data.Kopiera de Gzip-komprimerade filerna från sekvenseringen till datamappen. Kopiera sedan Python- och konfigurationsfilerna till skriptmappen enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Innan du kör skripten öppnar du zuordnung.txt-fil och lägg till två tabbseparerade kolumner. Ange namnen på Gzip-filerna i kolumn ett och önskat slutnamn i kolumn två. Ändra variablerna i konfigurationsfilen enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Använd det specifika kommandot och initiera detektering och extrahering av variantsekvensen. Utdata kommer att vara TXT-filer med de extraherade DNA-sekvenserna och deras antal läsningar. Rubriken på den här filen innehåller statistiska data och dessa data kommer att överföras till följande filer.Dessa TXT-data kommer att vara indatafilen för skript nummer två där DNA-sekvenserna översätts, rangordnas och analyseras. Använd det specifika kommandot, initiera PV-översättning och analys av textutdatafilerna för skript ett enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Utdatafilerna för skript nummer två kommer att namnges med den andra kolumnen i uppslagstabellen i zuordnung.txt med tillägg baserat på typen av analys. Se till att de tre utdatafilerna innehåller statistiska data i de första raderna och en första kolumn med indexet för varje DNA-sekvens från indatatextfilerna. De återstående kolumnerna ska bestå av DNA-sekvensen, antal läsningar, framåt- eller bakåtläsning och översatt peptidsekvens.De ogiltiga sekvenserna ska ha NA och inte vara giltiga i de två sista kolumnerna. Visualisera utdatafilerna med hjälp av tillgänglig programvara baserat på användarens behov. För att utföra analysen av NGS-sekvenseringsdata med anpassad kod i Python 3 omfattar arbetsflödet detektering av streckkodssekvenser som styrs av flankeringssekvenser, deras längd och plats, samt analys av streckkodsanrikning och distribution över uppsättningen vävnader.Förbered två mappar:skript och data. Kopiera de Gzip-komprimerade filerna från sekvenseringen till datamappen. Kopiera sedan python- och konfigurationsfilerna till skriptmappen enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Innan du kör skriptet skapar du två tabbavgränsade textfiler:kapsidvariansen. txt-fil med streckkodssekvenserna som tilldelats AAV-kapsidvariantnamn och kontaminationen. txt-fil med streckkodssekvenser som kommer från möjlig kontaminering.Slutligen redigerar du konfigurationsfilen så att den innehåller information om sökvägen till mappen med sekvenseringsdata, sekvens av streckkodernas flankerande regioner, deras position och fönsterstorlek för streckkodsidentifiering. Kör streckkodsidentifieringsskriptet med de angivna sökvägarna och konfigurationsfilerna med respektive kommando. Utdata från den här kommandokörningen är TXT-filer med omräkningar per kapsidvariant och det totala antalet läsningar som återställts från rådata.För att utvärdera fördelningen av streckkodad AAV-kapsid mellan vävnader eller organ, i zuordnung. txt-fil, tilldela namnet på varje textfil som erhållits från streckkodsdetekteringskörningen till ett vävnads- eller organnamn. Lägg till namnen på textfiler i den första kolumnen och motsvarande vävnads- eller organnamn i den flikavgränsade tilldelningen.Skapa ett organ. txt-fil med listan över namn för on- och off-target-organ, som motsvarar namnen i uppdraget Zuordnung. txt-filen.Skapa sedan normalization_organ. txt och normalization_variant. TXT-fliken avgränsade textfiler med normaliserade värden för alla kapsidvarianter och alla organ och vävnader.I den första kolumnen med normalization_organ. txt-fil, skriv namnen för varje organ och den andra kolumnen med normaliseringsvärden för motsvarande vävnad. Fyll den första kolumnen i normalization_variant.txt-fil med listan över kapsidnamn och den andra kolumnen med normaliserade värden för antalet lästa värden för varje kapsid i poolbiblioteket. Redigera konfigurationsfilen genom att ange de fullständiga sökvägarna till alla ytterligare filer och kör streckkodsanalysskriptet med det här specifika kommandot. Streckkodsanalysskriptet matar ut flera filer, till exempel textfilerna med relativ koncentration eller RC-värden för kapsidfördelning inom olika vävnader baserat på flera normaliseringssteg som beskrivits tidigare och kalkylbladsfilen som kombinerar textfildata till sammanslagna matrisdata.Visualisera data och utföra klusteranalys av matrisdata enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Skriptet matar in den relativa koncentrationen. XLS-filer och generera två diagram med hierarkisk klustervärmekarta och huvudkomponentanalys.För att ändra tomter eller PNG-parametrar, öppna R-skriptet och följ instruktionerna i kommentarsektionen. De kvantifierade regionerna av AAV2-repgenen visade att 99,2% var positiva för ITR, vilket tyder på att AAV-kapsiderna innehöll hela virusgenomerna. I alla tre uppsättningarna representerade de extraherade läsningarna baserat på signatursekvenser som är specifika för biblioteket cirka 94% av de totala läsningarna, vilket indikerar god kvalitet.Av dessa var mer än 99% giltiga PV-avläsningar och över 99% av de giltiga PV-avläsningarna var unika, vilket tyder på att biblioteket balanserades med hög intern mångfald. De två huvudgrenarna i värmekarthierarkin återspeglade skillnaden i transduktionseffektiviteten hos kapsidvarianter. Den vänstra grenen med majoriteten av kapsidvarianterna inkluderade alla kapsider som visade ett högt relativt koncentrationsvärde över de flesta vävnader.Förutom påfallande hög leverspecificitet uppvisade tre andra kapsider specificitet i membranet, skelettmuskeln, biceps och hjärnan. Den högra grenen av den hierarkiska klustringen inkluderade kapsidvarianterna med totalt sett lägre transduktionseffektivitet tydligast i tolvfingertarmen och bukspottkörteln. Huvudkomponentanalysen för den ursprungliga delmängden bildar klustret av kapsidvarianter med hög leverspecificitet och beskriver VAR60-kapsidens enastående muskeltropism.När du försöker detta protokoll måste du vara uppmärksam på skrivfel. Syntaxen är också annorlunda om du använder Windows-kommandotolken jämfört med Linux. Efter identifieringen av nya AAV-varianter måste den terapeutiska och translationella potentialen verifieras i en avliden eller större djurmodell.Denna teknik möjliggör en direkt jämförelse sida vid sida av AAV-varianter under identiska förhållanden och är extremt mångsidig, vilket banar väg för dess översättning hos stora djur eller till och med hos människor.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning för Isolering av morfologi Särskilda reagenser mot TDP-43 varianter i amyotrofisk lateralskleros

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy för funktionell återhämtning av hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolering av murina adipos vävnad Microvascular Fragment som Vaskularisering Aggregat för Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Förutsägande av gensläckning genom spatiotemporal kontroll av siRNA-frisättning från foto-responsiva polymera nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues för injicerbara regenerativ terapi och hög genomströmning drogkontroll

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Studera kavitation förbättrad terapi

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Tillförlitligt konstruera och kontrollera stabila optogenetiska genkretsar i däggdjursceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Fotodegraderbara Hydrogelgränssnitt för bakteriescreening, urval och isolering

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...